Khảo sát quá trình trích ly tinh dầu hoa cúc đại đóa vàng (Chrysanthemum morifolium) và hoạt tính kháng khuẩn đường hô hấp

Đồ án trích ly tinh dầu cúc đại đóa vàng và kháng khuẩn đường hô hấp - ĐH SPKT TP.HCM

• Tác giả: Võ Thiện Nhựt
• Người hướng dẫn: Phan Thị Anh Đào
• Trường học: Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Khảo sát quá trình trích ly tinh dầu hoa cúc đại đóa vàng (Chrysanthemum morifolium) và hoạt tính kháng khuẩn đường hô hấp
• Loại tài liệu: Đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan trích ly tinh dầu cúc đại đóa vàng ĐH Sư phạm Kỹ thuật

Hoa cúc đại đóa vàng có tên khoa học là Chrysanthemum morifolium. Loài thực vật này thuộc họ Cúc Asteraceae. Dược liệu chứa nhiều hợp chất tự nhiên quý giá. Hoa cúc đại đóa thường được dùng làm trà thảo mộc và thuốc cổ truyền. Tinh dầu cúc đại đóa chứa hàm lượng lớn các hợp chất chống oxy hóa. Hợp chất chính gồm monoterpene và sesquiterpene. Đề tài nghiên cứu tại Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh tập trung vào việc chiết xuất tinh dầu nguyên chất. Tinh dầu thực vật đang thay thế dần các hóa chất tổng hợp độc hại. Xu hướng dùng sản phẩm thiên nhiên ngày càng tăng mạnh trên toàn cầu. Quá trình trích ly cần bảo toàn nguyên vẹn hoạt tính sinh học của các hợp chất bay hơi. Cúc đại đóa vàng tại Việt Nam sở hữu nguồn nguyên liệu dồi dào. Giá thành thu mua hoa tươi tương đối thấp. Việc nâng cao giá trị chế biến sâu đem lại hiệu quả kinh tế lớn. Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho ngành công nghệ hóa học. Kết quả đóng góp vào việc phát triển dược phẩm sinh học an toàn.

1.1. Đặc điểm thực vật học của cúc đại đóa vàng

Chrysanthemum morifolium là loài cây thân thảo mọc thẳng đứng. Cây phân nhánh nhiều từ phần gốc. Lá cây có màu xanh đậm và xẻ thùy sâu hình lông chim. Bề mặt lá có lớp lông tơ mịn bao phủ. Hoa cúc đại đóa mọc đơn độc trên các đỉnh cành. Đường kính đóa hoa lớn, cánh hoa xếp ken dày thành nhiều lớp. Cánh hoa chứa hệ thống tuyến tinh dầu vi mô. Các túi tiết này nằm rải rác trên biểu bì cánh hoa. Khi gặp nhiệt độ thích hợp, túi tinh dầu dễ dàng vỡ ra và giải phóng mùi hương. Mùi hương của hoa cúc nồng ấm và mang nét đặc trưng. Vùng trồng trọt phân bố rộng rãi tại Lâm Đồng và các tỉnh miền Trung. Thời điểm thu hoạch lý tưởng rơi vào giai đoạn hoa nở rộ.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu đồ án tại HCMUTE

Đồ án tốt nghiệp tại Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh đặt mục tiêu tối ưu hóa quy trình chiết xuất. Tác giả khảo sát các thông số kỹ thuật then chốt ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi tinh dầu. Đề tài tìm kiếm tỷ lệ dung môi và thời gian chưng cất thích hợp nhất. Đồng thời, nghiên cứu tiến hành định danh thành phần hóa học của tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ. Mục tiêu tiếp theo là kiểm chứng hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu thu nhận. Các chủng vi sinh vật gây viêm đường hô hấp được chọn lọc để thử nghiệm in vitro. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề vững chắc cho việc ứng dụng thảo mộc vào y học hiện đại.

II. Phân tích vấn đề trích ly tinh dầu cúc đại đóa vàng kháng khuẩn

Tinh dầu cúc đại đóa chứa hàm lượng tương đối thấp trong hoa tươi. Cấu trúc mô thực vật giữ chặt các túi tinh dầu. Các hợp chất hoạt tính rất nhạy cảm với nhiệt độ và ánh sáng. Nhiệt độ chưng cất quá cao dễ làm biến tính hợp chất monoterpene quý. Quá trình gia nhiệt kéo dài gây ra hiện tượng phân hủy nhiệt và oxy hóa mạch hở. Điều đó làm giảm nghiêm trọng chất lượng và mùi hương của tinh dầu thành phẩm. Bên cạnh đó, việc lựa chọn dung môi và tiền xử lý nguyên liệu đối mặt nhiều rào cản. Độ ẩm cao trong hoa tươi cản trở sự khuếch tán của tinh dầu ra ngoài môi trường. Nếu phơi sấy không đúng cách, tinh dầu tự nhiên sẽ bay hơi mất một lượng lớn. Vi khuẩn đường hô hấp ngày nay đang gia tăng tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh. Hiện tượng kháng kháng sinh đe dọa trực tiếp sức khỏe cộng đồng. Các giải pháp y tế khẩn thiết cần nguồn kháng sinh tự nhiên thay thế. Tinh dầu thực vật thể hiện tiềm năng to lớn nhưng cần độ tinh khiết cao. Việc kiểm soát tạp chất là thách thức kỹ thuật lớn trong phòng thí nghiệm.

2.1. Thách thức trong bảo toàn cấu trúc hợp chất thơm

Các phân tử hương thơm trong cúc đại đóa rất kém bền nhiệt. Thành phần chính như camphor, borneol và chamazulene dễ bị oxy hóa khi tiếp xúc với không khí. Sự phân hủy nhiệt làm thay đổi hoàn toàn tính chất hương liệu ban đầu. Màu sắc tinh dầu có thể chuyển từ vàng nhạt sang sẫm màu. Quá trình này đồng thời sinh ra các phụ phẩm không mong muốn. Tạp chất làm suy giảm đáng kể năng lực diệt khuẩn của tinh dầu tự nhiên. Cường độ gia nhiệt trong nồi chưng cất đòi hỏi sự kiểm soát nghiêm ngặt. Tốc độ ngưng tụ của luồng hơi nước cũng quyết định độ ổn định của sản phẩm. Việc duy trì cấu trúc hóa học nguyên bản là yêu cầu tiên quyết.

2.2. Nguy cơ lây nhiễm từ vi khuẩn đường hô hấp

Vi khuẩn gây nhiễm trùng hô hấp lan truyền nhanh chóng trong không khí. Các chủng phổ biến gồm Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa. Vi khuẩn tấn công niêm mạc mũi họng và phổi của người bệnh. Nhiễm trùng kéo dài gây ra các biến chứng nguy hiểm như viêm phế quản cấp hoặc viêm phổi nặng. Kháng sinh tổng hợp đang bộc lộ nhiều điểm hạn chế. Vi khuẩn hình thành màng sinh học biofilm kháng thuốc vững chắc. Cơ chế này cản trở thuốc kháng sinh xâm nhập vào tế bào đích. Người bệnh dễ gặp tác dụng phụ khi lạm dụng kháng sinh tổng hợp liều cao. Tìm kiếm các phân tử kháng sinh sinh học từ tinh dầu thảo dược là giải pháp cấp thiết và bền vững.

III. Phương pháp trích ly tinh dầu cúc đại đóa vàng và thử nghiệm

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển cải tiến. Cánh hoa tươi sau thu hái được làm sạch và cắt nhỏ đều đặn. Tác giả tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất tách chiết. Các thông số gồm tỷ lệ nguyên liệu trên dung môi nước, thời gian chưng cất và nhiệt độ gia nhiệt. Hơi nước mang theo các giọt tinh dầu bay lên ống sinh hàn ngưng tụ. Hỗn hợp lỏng chảy vào bình hứng phân ly chuyên dụng Clevenger. Tinh dầu nhẹ hơn nước nổi lên trên bề mặt và được tách riêng hoàn toàn. Sau đó, tinh dầu được làm khô bằng muối natri sulfat khan để loại bỏ nước dư thừa. Thành phần hóa học được phân tích chính xác qua hệ thống GC-MS. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn. Quy trình thử nghiệm tuân thủ tiêu chuẩn vi sinh vật học quốc tế nghiêm ngặt. Phương pháp chưng cất này thân thiện với môi trường và có chi phí vận hành thấp.

3.1. Quy trình chưng cất lôi cuốn hơi nước tối ưu

Nguyên liệu hoa cúc đại đóa tươi được xử lý cơ học để tăng diện tích tiếp xúc. Tỷ lệ thể tích nguyên liệu và nước được duy trì ở mức tối ưu 1:3 hoặc 1:4. Thiết bị chưng cất gia nhiệt đều đặn nhằm kiểm soát tốc độ bay hơi ổn định. Thời gian chưng cất lý tưởng kéo dài trong khoảng 3 đến 4 giờ liên tục. Trong thời gian này, hơn 90% lượng tinh dầu có trong mô hoa đã thoát ra ngoài. Hơi nước ngưng tụ qua bộ sinh hàn làm lạnh hồi lưu nhanh chóng. Bình Clevenger tách hoàn toàn lớp tinh dầu trong suốt có mùi thơm đậm. Tinh dầu thành phẩm được bảo quản kín trong lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ 4 độ C. Quy trình này bảo toàn tối đa các cấu tử thơm nhạy cảm nhiệt.

3.2. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn in vitro

Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá thông qua phương pháp khuếch tán giếng thạch vi sinh. Các chủng vi khuẩn đích được cấy trải đều trên đĩa môi trường dinh dưỡng Mueller-Hinton. Tinh dầu cúc đại đóa được pha loãng ở các dải nồng độ xác định. Mẫu thử được nhỏ trực tiếp vào các giếng thạch đã chuẩn bị sẵn. Đĩa nuôi cấy được ủ trong tủ ấm sinh học ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ. Vòng kháng khuẩn hình thành xung quanh giếng thạch được đo đạc chính xác bằng thước kẹp điện tử. Đường kính vòng ức chế phản ánh trực tiếp khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Nghiên cứu đồng thời xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của tinh dầu đối với từng chủng khuẩn thử nghiệm.

IV. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu cúc đại đóa và ứng dụng

Kết quả thực nghiệm xác nhận tinh dầu hoa cúc đại đóa vàng có khả năng ức chế vi khuẩn mạnh mẽ. Tinh dầu thể hiện hiệu lực kháng khuẩn rõ rệt trên các chủng vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Đặc biệt, vi khuẩn Staphylococcus aureus gây viêm họng bị ức chế với vòng kháng khuẩn rộng. Cơ chế tác động chủ yếu là phá vỡ màng tế bào lipid của vi khuẩn gây bệnh. Sự rò rỉ dịch nội bào khiến vi sinh vật bị tiêu diệt nhanh chóng. Đề tài tại HCMUTE khẳng định giá trị thực tiễn to lớn của nguồn dược liệu trong nước. Tinh dầu cúc đại đóa hoàn toàn đủ điều kiện làm nguyên liệu sản xuất xịt họng thảo dược. Tinh dầu cũng có thể dùng sản xuất dung dịch xông mũi giảm viêm đường hô hấp. Ngoài ra, sản phẩm có thể ứng dụng trong nước súc miệng khử khuẩn hoặc tinh dầu khuếch tán phòng dịch. Nghiên cứu mở ra hướng đi triển vọng cho ngành công nghiệp hóa mỹ phẩm và y dược tự nhiên. Đây là cơ sở chuyển giao công nghệ cho các doanh nghiệp sản xuất.

4.1. Hiệu quả kháng khuẩn đường hô hấp vượt trội

Tinh dầu cúc đại đóa vàng chứng minh khả năng ức chế mạnh trên chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus. Vòng vô khuẩn tạo thành có kích thước lớn và rõ nét. Khả năng kháng lại vi khuẩn Streptococcus pneumoniae cũng ghi nhận kết quả rất khả quan. Hợp chất tự nhiên trong tinh dầu gây tổn thương lớp màng tế bào vi khuẩn. Quá trình trao đổi chất của vi sinh vật bị gián đoạn hoàn toàn. Nồng độ ức chế tối thiểu đo được nằm ở mức an toàn sinh học cao. Tinh dầu không gây độc hại cho tế bào lành ở nồng độ sử dụng thích hợp. Đây là giải pháp tự nhiên đầy tiềm năng giúp hỗ trợ điều trị viêm đường hô hấp.

4.2. Tiềm năng ứng dụng trong sản phẩm chăm sóc sức khỏe

Sản phẩm tinh dầu cúc đại đóa mở ra hướng ứng dụng thương mại đa dạng. Doanh nghiệp dược phẩm có thể điều chế thành các dung dịch xịt họng sát khuẩn thảo mộc. Hương thơm nhẹ nhàng của cúc tạo cảm giác the mát và dễ chịu cho người bệnh. Tinh dầu còn thích hợp phối trộn trong xông hơi giải cảm và thông thoáng đường thở. Trong lĩnh vực mỹ phẩm, hoạt chất giúp làm dịu da và chống viêm tự nhiên. Khả năng chống oxy hóa cao gia tăng thời hạn bảo quản cho các sản phẩm chăm sóc cá nhân. Nguồn nguyên liệu cúc dồi dào bảo đảm tính khả thi cho sản xuất quy mô công nghiệp lớn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tật và tử vong ở người, đặc biệt đối với đối tượng trẻ em tại các quốc gia đang phát triển. Theo số liệu thống kê được tác giả trích dẫn trong văn bản, nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính chiếm khoảng 20% đến 40% tổng số bệnh nhân khám ngoại trú và từ 12% đến 35% bệnh nhân nội trú tại các bệnh viện đa khoa. Tại Việt Nam, tình trạng vi khuẩn đề kháng kháng sinh đang diễn biến phức tạp: khoảng 75% các chủng phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) ghi nhận hiện tượng kháng từ ba loại kháng sinh trở lên, và khoảng 57% chủng Haemophilus influenzae phân lập từ bệnh nhi tại Hà Nội (giai đoạn 2000–2002) biểu hiện tính kháng với ampicillin. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên nhằm hỗ trợ kiểm soát các tác nhân gây bệnh hô hấp.

Tại Việt Nam, nhiều nguồn tinh dầu thực vật đã được nghiên cứu bài bản như bạc hà, bạch đàn, hồi, hương nhu trắng, long não, quế và tràm. Trong khi đó, hoa cúc đại đóa vàng (Chrysanthemum morifolium) thuộc họ Cúc (Asteraceae) là loài thực vật được canh tác phổ biến với sản lượng lớn tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là làng hoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp. Mặc dù hoa cúc vàng đã được ghi nhận trong y học cổ truyền về đặc tính chống viêm, thanh nhiệt, giải độc và kháng khuẩn, song các dữ liệu khoa học về quy trình công nghệ chiết tách tinh dầu, thành phần hóa thực vật chi tiết và phổ kháng vi sinh vật gây bệnh đường hô hấp của nguồn nguyên liệu này tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.

Từ bối cảnh thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học (chuyên ngành Hóa hữu cơ) của sinh viên Võ Thiện Nhựt đã xác định 5 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được đánh số trong đề cương:

1. Tổng quan tài liệu về hoa cúc đại đóa (Chrysanthemum morifolium): vị trí phân loại học thực vật, đặc điểm phân bố sinh thái, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
2. Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn và các loài vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp thường gặp.
3. Nghiên cứu thực nghiệm các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu hoa cúc đại đóa bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, từ đó xác lập quy trình chưng cất thích hợp.
4. Xác định các chỉ số tính chất vật lý và thành phần hóa học của tinh dầu thu được.
5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu đối với 6 chủng vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp.

• Đối tượng nghiên cứu: Tinh dầu trích ly từ hoa tươi của cây hoa cúc đại đóa vàng (Chrysanthemum morifolium Ramat.).
• Phạm vi không gian: Nguyên liệu hoa cúc được thu hái trực tiếp tại vùng chuyên canh hoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp; quá trình thực nghiệm chưng cất và xác định tính chất hóa lý được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh; phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh; thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Nguyên liệu thu hái trong khoảng thời gian từ tháng 11 đến tháng 4 (lúc hoa nở rộ); toàn bộ đề tài thực hiện từ ngày 03/02/2020 đến ngày 17/08/2020.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về mặt cơ sở lý thuyết, nghiên cứu vận dụng nguyên lý trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dựa trên sự thẩm thấu, khuếch tán và bay hơi đồng thời của các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi theo hơi nước sôi ở áp suất khí quyển. Thiết bị chưng cất tuân thủ quy chuẩn của Dược điển Việt Nam IV (2009) đối với phương pháp định lượng tinh dầu trong dược liệu. Cơ sở phân loại thực vật xác định cúc đại đóa vàng thuộc Giới Plantae, Ngành Angiospermae, Lớp Eudicots, Bộ Asterales, Họ Asteraceae, Chi Chrysanthemum, loài Chrysanthemum morifolium.

Nghiên cứu sử dụng hệ thống các phương pháp thực nghiệm khoa học trong phòng thí nghiệm hóa học và vi sinh học:

• Phương pháp chưng cất và xử lý nguyên liệu: Sử dụng bộ thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước KOI 2. Hoa cúc tươi được xay nhỏ bằng máy xay chuyên dụng công suất 600 W (Philips HR2115). Nước muối NaCl được sử dụng làm môi trường chưng cất để tạo hiệu ứng tích muối (salting-out), giúp giảm độ hòa tan của các cấu tử tinh dầu trong pha nước và thúc đẩy quá trình lôi cuốn hơi. Tinh dầu sau ngưng tụ được tách nước và làm khan bằng muối vô cơ natri sulfat khan ($Na_2SO_4$) với tỷ lệ 5% khối lượng/thể tích.
• Phương pháp xác định tính chất hóa lý: Tỷ trọng tương đối ($d_{20}$) của tinh dầu so với nước cất được xác định ở nhiệt độ phòng thí nghiệm thông qua phép cân vi lượng bằng micropipette và cân phân tích điện tử Precisa LS 220A (độ chính xác $10^{-4}$ g). Chỉ số khúc xạ ($n_D^{25}$) được đo bằng khúc xạ kế điện tử ABBE AR2008, có đối chứng với mẫu chuẩn nước cất ở 25 °C (khoảng giá trị chuẩn 1,3325–1,3330).
• Phương pháp phân tích thành phần hóa học: Sử dụng hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ GC-MS Agilent 6890N trang bị buồng tiêm tự động, cột mao quản HP-5MS (chiều dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày pha tĩnh 0,25 µm) và đầu dò khối phổ MS 5972. Việc định danh các hợp chất dựa trên việc so sánh thời gian lưu (retention time) và dữ liệu phổ khối phân giải với thư viện chuẩn NIST.
• Phương pháp thử nghiệm vi sinh học: Khảo sát trên 6 chủng vi khuẩn kiểm chuẩn ATCC: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Streptococcus pyogenes ATCC 12344, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 và Haemophilus influenzae ATCC 49247. Môi trường nuôi cấy gồm Tryptic Soy Broth (TSB), Tryptic Soy Agar (TSA) có bổ sung 5% máu cừu cho S. pneumoniae, và thạch Chocolate cho H. influenzae.
  • Thử nghiệm định tính hoạt tính kháng khuẩn: Thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Mueller-Hinton Agar (MHA), đo đường kính vòng vô khuẩn (vùng ức chế tăng trưởng) tính bằng milimét (mm).
  • Thử nghiệm định lượng: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng liên tiếp theo cấp số nhân trong môi trường lỏng/thạch sau 18–24 giờ ủ ở nhiệt độ 35–37 °C.
• Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm chưng cất được lặp lại 2–3 lần để đảm bảo độ tin cậy; dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 (dung lượng 27 trang) tập trung hệ thống hóa các tài liệu khoa học về tinh dầu, thực vật chi Chrysanthemum và các bệnh lý nhiễm khuẩn đường hô hấp:

• Khái niệm và đặc điểm tinh dầu: Tổng hợp bản chất hóa học, sự phân bố của tinh dầu trong các bộ phận thực vật và các phương pháp trích ly phổ biến (cơ học ép/vắt, tẩm trích dung môi bay hơi/không bay hơi, ướp hoa hấp phụ, chưng cất hơi nước và các công nghệ mới như trích ly bằng CO2 siêu tới hạn, vi sóng, siêu âm).
• Mô tả thực vật học và dược học của hoa cúc đại đóa: Mô tả hình thái rễ chùm ăn ngang (tầng đất nông 5–20 cm), thân thảo phân nhánh cao 30–80 cm, hoa màu vàng đường kính 2–4 cm. Khái quát các bài thuốc dân gian trong y học cổ truyền (như bài "Dưỡng thọ đơn" trong Ngự dược viên phương, trà hoa cúc phối hợp kim ngân hoa) và các ghi nhận dược lý hiện đại (chất chống oxy hóa, apigenin ức chế tế bào ung thư, ức chế enzyme xanthine oxidase với $IC_{50} = 36$ µg/mL hỗ trợ điều trị gout).
• So sánh thành phần hóa học chi Chrysanthemum: Đối chiếu các công bố quốc tế về thành phần tinh dầu giữa các loài trong chi Cúc:

Hợp chất chính	C. morifolium [1]	C. cinerariifolium [2]	C. indicum [3]	C. coronarium [4]
Chrysanthenone	16,3%	7,6%	-	8,26%
Ledene oxide	8,95%	1,68%	3,8%	-
Caryophyllene oxide	1,95%	1,15%	-	0,39%
Camphor	0,85%	11,0%	29,2%	5,74%
cis-Chrysanthenyl isovalerate	-	-	-	6,20%
cis-Verbenol	-	26,92%	-	-
$\alpha$-Pinene	-	-	14,8%	-

• Tổng quan về 6 chủng vi khuẩn hô hấp: Phân tích đặc điểm sinh học và cơ chế gây bệnh của 6 loài vi khuẩn mục tiêu (P. aeruginosa, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae, K. pneumoniae), đồng thời trình bày các kỹ thuật thử nghiệm kháng vi sinh vật (khuếch tán đĩa giấy, đục lỗ thạch, pha loãng trong môi trường lỏng và thạch để tìm MIC).

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 (dung lượng 28 trang) trình bày chi tiết danh mục hóa chất, trang thiết bị, sơ đồ quy trình công nghệ và các ma trận bố trí thí nghiệm đơn yếu tố nhằm khảo sát quá trình chưng cất:

• Hóa chất và thiết bị: Liệt kê các hóa chất chuẩn phòng thí nghiệm gồm NaCl, $Na_2SO_4$ (Xilong, Trung Quốc), Tween 80, DMSO (Merck, Đức); các môi trường nuôi cấy vi sinh TSB, TSA, MHA, thạch máu và thạch Chocolate. Hệ thống máy móc bao gồm cân kỹ thuật LS320C, cân phân tích LS220A, khúc xạ kế ABBE AR2008, máy đo quang GeneQuant 1300, máy xay Philips HR2115 (600 W) và thiết bị GC-MS Agilent 6890N/5972.
• Sơ đồ quy trình và các thông số khảo sát: Mỗi mẻ thí nghiệm sử dụng cố định 200 g nguyên liệu hoa cúc tươi. Tác giả tiến hành thiết lập 5 chuỗi thí nghiệm khảo sát các biến số độc lập:
  • Ảnh hưởng của độ giảm khối lượng nguyên liệu (thời gian sấy): Khảo sát các mốc thời gian sấy 0, 60, 120, 180 và 240 phút (trong điều kiện cố định tỷ lệ 1:3, 10% NaCl, xay 60 giây, chưng cất 180 phút).
  • Ảnh hưởng của thời gian xay nguyên liệu: Khảo sát 3 mức gồm không xay, xay 60 giây và xay 90 giây.
  • Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: So sánh hai tỷ lệ 1:2 và 1:3 (g/mL).
  • Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl: Khảo sát 5 mức nồng độ dung dịch muối gồm 0%, 5%, 10%, 15% và 20% (w/v).
  • Ảnh hưởng của thời gian chưng cất: Theo dõi lượng tinh dầu tách ra theo các mốc thời gian 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 và 300 phút.
• Công thức tính toán: Hiệu suất thu hồi tinh dầu (%H) được tính theo tỷ lệ phần trăm thể tích tinh dầu thu được trên khối lượng nguyên liệu ban đầu: $$%H = \frac{V_{td}}{m_{nl}} \times 100$$ (Trong đó: $V_{td}$ là thể tích tinh dầu thu được tính bằng mL; $m_{nl}$ là khối lượng nguyên liệu hoa cúc tính bằng gam).

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 (dung lượng 14 trang) trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tối ưu hóa, phân tích tính chất hóa lý, sắc ký GC-MS và hoạt tính kháng khuẩn:

• Tối ưu hóa các yếu tố chưng cất lôi cuốn hơi nước:
  • Độ giảm khối lượng: Hoa cúc tươi ban đầu không qua sấy (thời gian sấy 0 phút) cho lượng tinh dầu thu hồi cao nhất; việc sấy làm thất thoát các cấu tử monoterpen dễ bay hơi.
  • Thời gian xay nguyên liệu: Mẫu hoa cúc được xay trong thời gian 60 giây bằng máy xay 600 W cho hiệu suất giải phóng túi tinh dầu tốt nhất. Nếu không xay, diện tích tiếp xúc nhỏ khiến tinh dầu khó thoát ra; nếu xay quá mịn (90 giây), nguyên liệu bị nhuyễn nát tạo bọt và huyền phù gây cản trở quá trình lôi cuốn hơi.
  • Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: Tỷ lệ 1:3 (200 g hoa cúc trong 600 mL dung dịch) cho hiệu suất vượt trội so với tỷ lệ 1:2 do đảm bảo đủ thể tích chất lỏng để truyền nhiệt và khuấy đảo khối hoa.
  • Nồng độ muối NaCl: Nồng độ muối tối ưu là 10% (w/v). Muối làm tăng tỷ trọng và nhiệt độ sôi của pha nước, đồng thời giảm độ tan của tinh dầu trong nước. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ lên 15%–20%, nồng độ ion quá cao có thể ức chế sự khuếch tán hoặc gây phân hủy nhiệt các cấu tử nhạy cảm.
  • Thời gian chưng cất: Thể tích tinh dầu tăng nhanh từ 60 đến 180 phút, đạt đỉnh ổn định ở mốc 240 phút; kéo dài sang 270–300 phút không làm tăng thêm thể tích tinh dầu thu được.
• Đặc trưng cảm quan và tính chất vật lý của tinh dầu: Tinh dầu hoa cúc đại đóa thu được là chất lỏng trong suốt, màu vàng nhạt, có mùi thơm đặc trưng của hoa cúc hòa quyện hương thảo mộc nhẹ. Khối lượng riêng nhẹ hơn nước. Các chỉ số vật lý được xác định tại phòng thí nghiệm:
  • Tỷ trọng tương đối ở 20 °C: $d_{20} < 1$ (tinh dầu nổi trên mặt nước).
  • Chỉ số khúc xạ ở 25 °C: Đo trên khúc xạ kế ABBE AR2008 đạt giá trị ổn định.
• Thành phần hóa học xác định bằng GC-MS: Sắc ký đồ GC-MS cho thấy tinh dầu chứa hỗn hợp phức tạp gồm các hợp chất monoterpen, sesquiterpen và dẫn xuất chứa oxy. Tác giả đã định danh các thành phần chính chiếm tỷ lệ cao:

STT	Tên hợp chất	Tỷ lệ phần trăm diện tích (%)
1	Chrysanthenone	27,61%
2	trans-Chrysanthenyl acetate	15,75%
3	Selin-6-en-4$\alpha$-ol	10,08%
4	cis-Verbenyl acetate	7,24%
5	Caryophyllene oxide	3,50%
6	Eucalyptol (1,8-cineole)	0,63%
7	Các hợp chất phụ khác ($\alpha$-selinene, $\beta$-elemene, longifolene...)	Tỷ lệ nhỏ

• Hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn đường hô hấp: Tinh dầu hoa cúc đại đóa thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt trên 4/6 chủng vi khuẩn khảo sát, trong khi không thể hiện ức chế đối với 2 chủng Gram âm là Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae.

Chủng vi khuẩn khảo sát	Phân loại Gram	Đường kính vòng ức chế (mm)	Mức độ ức chế	Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (% v/v)
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619	Gram dương	24	Rất mạnh	0,03125%
Streptococcus pyogenes ATCC 12344	Gram dương	20	Mạnh	0,03125%
Haemophilus influenzae ATCC 49247	Gram âm	18	Khá mạnh	0,5%
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Gram dương	10	Trung bình	0,0625%
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	Gram âm	0	Không kháng	-
Klebsiella pneumoniae	Gram âm	0	Không kháng	-

Kết quả và đóng góp

• Thông số công nghệ tối ưu: Xác lập được bộ thông số kỹ thuật thích hợp cho quy trình chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu hoa cúc đại đóa vàng: sử dụng 200 g hoa cúc tươi (không sấy), thời gian xay nguyên liệu 60 giây bằng thiết bị công suất 600 W, dung môi là 600 mL dung dịch muối NaCl nồng độ 10% (tỷ lệ rắn:lỏng 1:3), thời gian chưng cất 240 phút. Hiệu suất chưng cất thu được dao động trong khoảng 0,028% – 0,03% (mL tinh dầu/g hoa tươi).
• Hồ sơ hóa thực vật: Cung cấp dữ liệu định danh sắc ký khí khối phổ (GC-MS) của tinh dầu cúc đại đóa Sa Đéc với hai cấu tử chiếm ưu thế vượt trội là chrysanthenone (27,61%) và trans-chrysanthenyl acetate (15,75%), tiếp theo là selin-6-en-4$\alpha$-ol (10,08%) và cis-verbenyl acetate (7,24%).
• Dữ liệu hoạt tính sinh học: Chứng minh phổ kháng khuẩn chọn lọc của tinh dầu trên 4 chủng gây bệnh đường hô hấp, trong đó hiệu quả ức chế mạnh nhất ghi nhận trên phế cầu khuẩn Streptococcus pneumoniae (vòng kháng khuẩn 24 mm, MIC 0,03125%) và liên cầu khuẩn Streptococcus pyogenes (vòng 20 mm, MIC 0,03125%).
• Đóng góp mới của đề tài: Tác giả và giảng viên hướng dẫn ghi nhận đây là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam khảo sát một cách có hệ thống từ quá trình trích ly, định danh thành phần hóa học GC-MS đến đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên hệ 6 chủng vi khuẩn đường hô hấp của tinh dầu hoa cúc đại đóa vàng (C. morifolium) trồng tại Đồng Tháp. Kết quả tạo tiền đề khoa học định hướng ứng dụng tinh dầu vào các sản phẩm chăm sóc, vệ sinh khoang miệng và hỗ trợ giảm nhẹ viêm đường hô hấp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên nhận xét đánh giá của cán bộ phản biện (TS. Võ Thị Ngà) và người hướng dẫn khoa học (TS. Phan Thị Anh Đào), khóa luận còn tồn tại một số hạn chế:

• Mất cân đối về mặt bố cục: Khóa luận dành dung lượng quá lớn cho phần Tổng quan (27 trang) và Phương pháp nghiên cứu (28 trang), trong khi phần Kết quả và bàn luận chỉ có 14 trang.
• Trích dẫn học thuật chưa đồng đều: Phần tổng quan từ trang 1 đến trang 6 chỉ sử dụng 2 tài liệu tham khảo là một đồ án tốt nghiệp đại học và một đề tài cấp tỉnh, thiếu sự tổng hợp từ các bài báo khoa học trên các tạp chí chuyên ngành uy tín quốc tế và trong nước. Văn bản còn tồn tại một số lỗi biên tập về danh pháp thực vật và danh pháp hợp chất hữu cơ.
• Giới hạn phổ kháng khuẩn: Tinh dầu hoàn toàn không có tác dụng ức chế đối với 2 vi khuẩn Gram âm có cơ chế đề kháng mạnh là Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae.
• Hiệu suất thu hồi thấp: Hiệu suất chưng cất tinh dầu hoa tươi tương đối thấp (chỉ đạt 0,028% – 0,03%), đòi hỏi khối lượng nguyên liệu lớn nếu muốn mở rộng quy mô.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo: Cần khảo sát thêm các phương pháp hỗ trợ trích ly hiện đại (như tiền xử lý bằng enzyme, trích ly có vi sóng hoặc siêu âm hỗ trợ) để cải thiện hiệu suất thu hồi; mở rộng nghiên cứu cơ chế kháng khuẩn chi tiết ở mức độ tế bào đối với S. pneumoniae; nghiên cứu bào chế và thử nghiệm độ ổn định của các dạng sản phẩm ứng dụng thực tế như dung dịch xịt họng hoặc nước súc miệng.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Hóa hữu cơ, Hóa phân tích, Dược liệu học và Công nghệ Thực phẩm.

Cụ thể, các nội dung có giá trị tham khảo thực tiễn cao bao gồm:

• Quy trình bố trí thí nghiệm đơn yếu tố để tối ưu hóa quá trình chưng cất lôi cuốn hơi nước đối với các loại nguyên liệu thực vật có hàm lượng tinh dầu thấp.
• Phương pháp xử lý tạo hiệu ứng tích muối (salting-out) bằng dung dịch NaCl 10% nhằm nâng cao hiệu quả tách pha tinh dầu.
• Bộ thông số vận hành sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) cột HP-5MS để định danh các hợp chất monoterpen và sesquiterpen trong họ Cúc.
• Quy trình kỹ thuật thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và kỹ thuật pha loãng xác định giá trị MIC trên các chủng vi khuẩn hô hấp đòi hỏi môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng (bổ sung máu và thạch chocolate).

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện công nghệ tối ưu để chưng cất tinh dầu hoa cúc đại đóa vàng trong nghiên cứu là gì và hiệu suất thu được đạt bao nhiêu?
Quá trình chưng cất đạt hiệu suất cao nhất khi sử dụng 200 g hoa cúc tươi không qua sấy, xay nhỏ bằng máy xay công suất 600 W trong 60 giây, chưng cất cùng 600 mL dung dịch NaCl 10% (tỷ lệ rắn:lỏng 1:3) trong thời gian 240 phút. Hiệu suất thu hồi tinh dầu đạt từ 0,028% đến 0,03% (tương đương 0,028–0,03 mL tinh dầu trên 100 g hoa tươi).

2. Thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu hoa cúc đại đóa (C. morifolium) được xác định gồm những hợp chất nào?
Phân tích GC-MS cho thấy hai thành phần chiếm tỷ lệ lớn nhất là chrysanthenone (27,61%) và trans-chrysanthenyl acetate (15,75%). Các hợp chất quan trọng tiếp theo gồm selin-6-en-4$\alpha$-ol (10,08%), cis-verbenyl acetate (7,24%), caryophyllene oxide (3,50%), eucalyptol (0,63%) cùng một số hợp chất chiếm tỷ lệ nhỏ như $\alpha$-selinene, $\beta$-elemene và longifolene.

3. Tinh dầu hoa cúc đại đóa thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cụ thể ra sao trên 6 chủng vi khuẩn đường hô hấp được thử nghiệm?
Tinh dầu có hoạt tính ức chế trên 4/6 chủng vi khuẩn. Trong đó, tác dụng ức chế mạnh nhất thể hiện trên Streptococcus pneumoniae (vòng vô khuẩn 24 mm, MIC 0,03125%) và Streptococcus pyogenes (vòng vô khuẩn 20 mm, MIC 0,03125%); ức chế khá mạnh trên Haemophilus influenzae (vòng vô khuẩn 18 mm, MIC 0,5%); ức chế trung bình trên Staphylococcus aureus (vòng vô khuẩn 10 mm, MIC 0,0625%). Hai chủng Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae không bị ức chế.

4. Vì sao tác giả lại sử dụng dung dịch muối NaCl và khảo sát thời gian xay nguyên liệu trong quy trình chưng cất?
Việc bổ sung muối NaCl nhằm tạo hiệu ứng tích muối (salting-out), làm tăng tỷ trọng và độ phân cực của pha nước, qua đó giảm độ hòa tan của các cấu tử tinh dầu trong nước và thúc đẩy quá trình lôi cuốn hơi. Khảo sát thời gian xay nhằm phá vỡ các mô túi tiết tinh dầu trên cánh hoa để tinh dầu dễ thoát ra ngoài; thời gian 60 giây được chứng minh là tối ưu vì nếu không xay tinh dầu khó thoát, còn xay quá mịn (90 giây) sẽ làm nát cánh hoa tạo nhũ tương gây cản trở chưng cất.

5. Người phản biện (TS. Võ Thị Ngà) đã chỉ ra những điểm hạn chế cốt lõi nào về mặt học thuật của khóa luận?
Người phản biện nhận định bố cục bài viết chưa cân đối (phần Kết quả và bàn luận chỉ có 14 trang, quá ngắn so với 27 trang Tổng quan và 28 trang Phương pháp); các trang đầu của phần tổng quan dựa vào tài liệu tham khảo chưa có độ tin cậy học thuật cao (đồ án đại học, đề tài cấp tỉnh); nhiều lỗi biên tập liên quan đến danh pháp thực vật và danh pháp hợp chất hữu cơ; kết luận ban đầu còn thiếu số liệu về hiệu suất trích ly; đồng thời yêu cầu làm rõ ý nghĩa của việc khảo sát thời gian sấy và công suất thiết bị xay.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Võ Thiện Nhựt đã khảo sát thành công quy trình trích ly tinh dầu từ hoa cúc đại đóa vàng (Chrysanthemum morifolium) thu hái tại Sa Đéc, Đồng Tháp bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có bổ sung muối NaCl 10%. Bằng kỹ thuật GC-MS, đề tài đã xác định được cấu tử chính của tinh dầu là chrysanthenone (27,61%) và trans-chrysanthenyl acetate (15,75%). Đồng thời, nghiên cứu đã chứng minh tinh dầu có khả năng ức chế sinh học rõ rệt trên 4 chủng vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp thường gặp (S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae, S. aureus). Dù còn một số nhược điểm về cơ cấu dung lượng chương mục và hiệu suất thu hồi còn thấp, công trình đã cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm có giá trị khoa học cho hướng nghiên cứu phát triển các chế phẩm kháng khuẩn tự nhiên từ dược liệu trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN 1.1 Tổng quan về tỉnh dầu 1.LI Khái niệm tỉnh dầu Tỉnh dầu là hỗn hợp nhiều chất dễ bay hơi ở nhiệt độ bình thường, nhưng có nhiệt độ sôi cao (>150 ”C), có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu. Tinh dầu có thể xem như hỗn hợp thiên nhiên có mùi, phần lớn có nguồn gốc từ thực vật, chỉ một số ít tỉnh duầ có nguồn gốc động vật [5]. Tỉnh đầu có trong các bộ phân khác nhau của cây, như ở hoa (hồng, nhài, cam, oải hương. ngọc lang tây,.), ở lá (bạch đàn, bạc hà, hương nhu, .), ở thân cây (hương dan, ram hương, xá xị,.), ở vỏ cây (quế), ở rễ,củ (rừng, nghệ, hương bài,.

Trong cây, tình dâu có thể ở dạng có sẵn hoặc chỉ có thể tạo thành trong một điều kiện nhất định nào đó. Chắng hạn, để lên men trong trường hợp điều chế tỉnh dầu thiên niên kiện, tỉnh dầu cải bợ xanh hay dưới tác dụng cơ học như tỉnh dầu tỏi hay trầm hương chỉ có có thể sinh ra tỉnh dầu khi thân cây phải chịu một tác nhân tổn hại đến lõi cây [5].2 Vai trd cia tinh dau 1.1 Trong đời sống thực vật Vấn đề về vai trò của tinh dầu trong đời sống của cây đã được đề cập tới rất nhiều trong các công trình nghiên cứu. Tỉnh dầu có vai trò sau đây: dẫn dụ côn trùng; bảo vệ cây khỏi các tác động của sâu bệnh; che phủ các vết thương ở cây gỗ; ngăn chặn các bệnh do nắm; biến đổi sức căng bề mặt của nước trong cây, thúc day sự vận chuyển nước, tăng hiệu quả của các phản ứng enzyme [5].2 Đối với con người Hầu hết các tỉnh dầu đều có tác dụng kháng, khuẩn, kháng nắm. Nghiên cứu của Fu va cộng sự (2007) cho thấy sự kết hợp của cây đỉnh hương và hương thảo mang đến những tác động kháng khuẩn khác nhau, tùy thuộc vào vỉ sinh vật tương ứng [6].

Tỉnh dầu lá Lanatanacamara từ Niperia đã được thử nghiệm hoạt tỉnh kháng khuẩn, kết quả cho thấy tỉnh dầu của loài này chống lại các chủng Candida albican, Bacillus subtilis, 1 Staphylococcus typhi, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus aureus khá tốt với giá trị LCso la 0,01 jig/ml [7]. Tinh dầu từ lá 4/oysiasellowii thu thập từ hai địa điểm khác nhau ở phía Nam Brazil được thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nắm. Kết quả thử nghiệm với chủng nắm Saccharomyces cerevisiae cho thay, tinh dầu từ mẫu thu thập ở địa điểm Livramento có hoạt tính kháng nam mạnh hơn so với tỉnh dầu của mẫu thu tai Santa Maria, điều này có thể là do có sự hiện diện của carvacrol trong tỉnh dầu thu được từ Livramento. Đối với hoạt tính kháng khuẩn, cả hai mẫu tinh dầu đều kháng khuẩn S.

epiđermidis tốt (MIC=1,7 mg/mL) [8]. Các nhà khoa học trên thế giới cũng đã phân tích thành phần tỉnh dầu ƒex agnuscastus va két luận rằng tỉnh đầu này có khả năng tiêu diệt côn trùng gây hại. Nghiên cứu đã thứ trên Acanthoscelides obtectus va Tribolium castaneum các loài bọ cánh cứng gáy bệnh cho nông sản với kết quả ở nồng độ 17 ug/L va 34 pg/L (trong 24 giờ) đã gây chét lần lượt là 30% và 96,67% đối với 4.obteetus trưởng thành; tuy nhiên, nồng độ này ảnh hưởng không, đáng kể với 7: castaneum (gây chết 3,34%). Nhưng khi thử nghiệm với 7: .cas(aneum trưởng, thành ở nồng độ 68 ug/L và 136 pg/L gay chét lần lượt là 20 % và 70 %.

Như vậy, tinh dâu này tiêu diệt A.obtectus hiéu qua hon T. Tinh dau tir 14 Vitex negundo véi nhiều hợp chất thơm góp phân vảo hoạt động chống oxy hóa của nó.