Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Trần khánh vy nghiên cứu phương pháp xác định

Khóa luận nghiên cứu phương pháp xác định nitrosamin trong thịt nướng bằng sắc ký khí khối phổ của Trần Khánh Vy ngành Dược sĩ năm 2024.

• Tác giả: Trần Khánh Vy
• Người hướng dẫn: TS. Đặng Thị Ngọc Lan
• Trường học: Hà Nội - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên cứu phương pháp xác định một số nitrosamin trong thịt nướng bằng sắc ký khí khối phổ
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu Trần Khánh Vy

Khóa luận tốt nghiệp của Trần Khánh Vy được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia năm 2018. Đề tài nghiên cứu phương pháp xác định nitrosamin trong thịt nướng sử dụng công nghệ sắc ký khí khối phổ (GC-MS/MS) tiên tiến. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm, nhằm phát hiện các chất gây ung thư tiềm ẩn trong thực phẩm. Nitrosamin được biết đến là những hợp chất độc hại có khả năng gây tổn hại sức khỏe người tiêu dùng. Khóa luận được hướng dẫn bởi các chuyên gia hàng đầu như TS. Đặng Thị Ngọc Lan, đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của nghiên cứu.

1.1. Mục tiêu và ý nghĩa của khóa luận

Mục tiêu chính của nghiên cứu là phát triển và thẩm định phương pháp xác định đồng thời các loại nitrosamin trong sản phẩm thịt nướng. Nitrosamin là những hợp chất có tính gây ung thư cao, cần được kiểm soát chặt chẽ trong thực phẩm. Phương pháp này sẽ cung cấp công cụ hiệu quả cho các cơ quan kiểm nghiệm trong việc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

1.2. Nơi thực hiện và điều kiện nghiên cứu

Khóa luận được hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, địa chỉ 65 Phạm Thận Duật, Hà Nội. Viện cung cấp các thiết bị GC-MS/MS hiện đại, điều kiện thí nghiệm tối ưu và đội ngũ chuyên gia hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho Trần Khánh Vy hoàn thành nghiên cứu với chất lượng cao.

II. Phương pháp xác định nitrosamin bằng GC MS MS

Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS/MS) là công nghệ phân tích hiện đại được Trần Khánh Vy sử dụng để xác định nitrosamin trong thịt nướng. Kỹ thuật này cho phép phát hiện đồng thời nhiều loại nitrosamin như NDMA, NDPA, NDPhA với độ nhạy cao. GC-MS/MS kết hợp ưu điểm của sắc ký khí với phổ khối hai lần, giúp loại bỏ các yếu tố nhiễu, nâng cao tính chọn lọc và độ tin cậy. Phương pháp này được khảo sát kỹ lưỡng các điều kiện tối ưu như nhiệt độ, áp suất, thời gian phân tích để đạt hiệu quả cao nhất.

2.1. Nguyên lý hoạt động của GC MS MS

GC-MS/MS hoạt động bằng cách tách các hợp chất trong mẫu qua cột sắc ký khí, sau đó ion hóa bằng va chạm electron (EI) hoặc ion hóa hóa học (CI). Các ion được phát hiện bằng phổ khối hai lần, cho phép lựa chọn các ion đặc trưng. Phương pháp này có tính chọn lọc cao, giảm thiểu ảnh hưởng nền và ảnh hưởng nền (ME), đảm bảo kết quả chính xác.

2.2. Các điều kiện tối ưu phân tích

Trần Khánh Vy đã khảo sát chi tiết các điều kiện GC-MS/MS bao gồm nhiệt độ cột, tốc độ dòng khí mang, năng lượng va chạm (CE) và tỷ lệ ion. Các tham số được điều chỉnh để đạt giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) thấp nhất, đảm bảo phương pháp xác định đạt độ nhạy tối đa.

III. Quy trình xử lý mẫu và chiết chất

Quy trình xử lý mẫu là bước quan trọng để loại bỏ các tạp chất và tập trung nitrosamin từ mẫu thịt nướng. Trần Khánh Vy đã phát triển phương pháp chiết sử dụng kỹ thuật QuEChERS (Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn định, an toàn). Phương pháp này kết hợp chiết pha rắn (SPE) và chiết pha rắn phân tán (d-SPE) để loại bỏ ảnh hưởng nền hiệu quả. Việc lựa chọn dung môi, bột làm sạch, thời gian chiết đều được khảo sát kỹ lưỡng để tối ưu hóa độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp.

3.1. Kỹ thuật QuEChERS trong chiết nitrosamin

Kỹ thuật QuEChERS giúp chiết nitrosamin một cách nhanh chóng và hiệu quả từ mẫu thịt nướng. Phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ như acetonitril (ACN) kết hợp với các muối để tăng hiệu suất chiết. Chiết pha rắn phân tán (d-SPE) với amin bậc 1-2 (PSA) giúp loại bỏ các chất béo, gốc axit, cải thiện tính chọn lọc của phương pháp.

3.2. Khảo sát các điều kiện chiết tối ưu

Trần Khánh Vy đã khảo sát thời gian chiết, khối lượng bột làm sạch, và ảnh hưởng nền để xác định điều kiện tối ưu. Các kết quả cho thấy khi sử dụng đúng điều kiện, độ thu hồi đạt 85-110%, độ lặp lại RSD < 15%, đảm bảo phương pháp xác định đạt tiêu chuẩn AOAC (Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức).

IV. Thẩm định phương pháp và đánh giá hàm lượng nitrosamin

Thẩm định phương pháp là bước quan trọng để đảm bảo phương pháp xác định đạt yêu cầu kỹ thuật. Trần Khánh Vy đã tiến hành các thử nghiệm bao gồm tính chọn lọc, khoảng tuyến tính (khoảng nồng độ trong đó phương pháp có độ chính xác cao), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). Kết quả cho thấy phương pháp có tính chọn lọc cao, không có mẫu chuẩn dương tính giả. Độ lặp lại và độ thu hồi đều nằm trong khoảng chấp nhận được. Sau đó, phương pháp được ứng dụng để đánh giá hàm lượng nitrosamin trong các sản phẩm thịt nướng trên địa bàn Hà Nội.

4.1. Các chỉ tiêu thẩm định phương pháp

Thẩm định phương pháp bao gồm: (1) Tính chọn lọc - kiểm tra mẫu trắng không có nitrosamin; (2) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - xác định nồng độ thấp nhất có thể phát hiện; (3) Khoảng tuyến tính và đường chuẩn - kiểm tra quan hệ giữa nồng độ và diện tích peak; (4) Độ lặp lại và độ thu hồi - đảm bảo kết quả ổn định, chính xác.

4.2. Kết quả đánh giá hàm lượng nitrosamin trong thịt nướng

Sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong các mẫu thịt nướng thu thập từ Hà Nội cho thấy hiện diện của NDMA, NDPA, NDPhA. Một số mẫu có nồng độ vượt quá giới hạn cho phép, chỉ ra nguy hiểm tiềm ẩn đối với sức khỏe người tiêu dùng. Phương pháp GC-MS/MS của Trần Khánh Vy cung cấp công cụ hiệu quả để giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm trở lại đây, đồ nướng đang được giới trẻ rất ưa chuộng. Một phần chịu ảnh hưởng từ xu hướng ẩm thực Hàn Quốc và quan trọng hơn cả là đồ nướng hội tủ rất nhiều yếu tố như thơm – ngon – rẻ. Số lượng các quán nướng vỉa hè đang tăng lên với tốc độ chóng mặt. Tuy nhiên, đáng buồn là theo ước tính, mỗi năm Việt Nam có khoảng 7.000 người được chuẩn đoán mắc bệnh ung thư, trong đó có 5.000 ca tử vong và thực phẩm được cho là một trong những nguyên nhân chính gây ra tình trạng này Nitrosamin là một nhóm hóa chất có khả năng gây ung thư cho con người khi tiếp xúc với môi trường và một số loại thực phẩm, trong đó có thịt chế biến.

Để bảo quản, thịt thường được tiêm chất bảo quản có chứa muối nitrit, nitrat. Amin từ quá trình phân hủy protein trong khi nấu sẽ kết hợp với nitrit tạo thành nitrosamin. Mức độ tạo thành nitrosamin phụ thuộc vào các yếu tố: phương pháp nấu, nhiệt độ, thời gian, nồng độ của nitrit/nitrat, quy trình sơ chế, điều kiện bảo quản. Vấn đề cấp bách đang được đặt ra là phải kiểm soát hàm lượng nitrosamin trong các sản phẩm chế biến từ thịt, đặc biệt là thịt nướng để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng.

Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác định nitrosamin trong thực phẩm. Tuy nhiên, ở Việt Nam sự quan tâm cho vấn đề này vẫn còn khá hạn chế. Khóa luận “Nghiên cứu phương pháp xác định một số nitrosamin trong thịt nướng bằng sắc ký khí khối phổ” được thực hiện không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn. Mục tiêu của khóa luận như sau: 1.

Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong thịt nướng 2. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt nướng trên địa bàn Hà Nội. Giới thiệu về nitrosamin 1. Công thức cấu tạo của nitrosamin Nitrosamin là hợp chất hóa học có cấu trúc R1-N(-R2)-N=O, trong đó một nhóm nitroso liên kết với một amin bậc 2 hoặc muối amoni bậc 4.

Công thức cấu tạo chung của nitrosamin và công thức cấu tạo của một số nitrosamin được nghiên cứu trong khóa luận này được giới thiệu ở hình 1. Công thức cấu tạo chung của nitrosamin Bảng 1. Một số nitrosamin thường gặp Khố i TT Nitrosamin Công thức cấ u ta ̣o lươ ̣ng phân tử 1. N-nitroso diphenyl amine (NDPhA) N N O 198 1.

Sự tạo thành nitrosamin Trong thực phẩm, nitrosamin được tạo bởi nitrit và các amin bậc 2, là các chất thường gặp trong protein, trong các điều kiện nhất định như môi trường acid mạnh như trong dạ dày người. Theo các nghiên cứu, khoảng pH tối ưu cho sự tạo thành nitrosamin từ nitrit là 2,5 – 3,5. Nhiệt độ cao như khi chiên thực phẩm cũng thúc đẩy sự tạo thành nitrosamin. Có thể nhận biết nitrosamin bằng phản ứng Liebermann nitroso.

2 Trong môi trường acid, nitrit tạo thành acid nitrous (HNO2), acid này nhận thêm proton và phân chia thành cation nitrosonium N≡O+ và nước: H2NO2+ → H2O + NO+ Sau đó, cation nitrosonium phản ứng với amin tạo thành nitrosamin. Tính chất hóa lý của nitrosamin Các nitrosamin thường tồn tại ở dạng lỏng, màu vàng nhạt. Có khoảng 20 nitrosamin được xác định trong các sản phẩm thịt. Nitrosamin bao gồm nitrosamin không bay hơi và nitrosamin bay hơi, phụ thuộc vào các nhóm thế (R1 và R2).

Các nitrosamin bay hơi (thường chỉ < 5 µg/kg) là đối tượng nghiên cứu của hầu hết các nghiên cứu trước đây. Các nghiên cứu này thường chỉ tập trung nghiên cứu 5 nitrosamin, đặc biệt là NDMA và NPYR. Nhiệt độ bay hơi của các nitrosamin nhóm này dao động trong khoảng 120-180oC ở điều kiện thường. Các nitrosamin bay hơi thường là các chất có tính phân cực trung bình, có thể tan được trong nước và một số dung môi phân cực như methanol, ethanol, acetonitril.

Các nitrosamin thể hiện tính chất chung của nhóm N-nitroso (-N-N=O). Đây là nhóm chất có hoạt tính cao và là tác nhân có thể gây ung thư hoặc phá hủy tế bào trên người [4]. Độc tính Nitrosamin đã được chứng minh gây ung thư trên động vật, Hiện nay các bằng chứng dịch tễ học từ các nghiên cứu bệnh chứng cho thấy sự xuất hiện của nitrosamin tỷ lệ thuận với nguy cơ mắc ung thư dạ dày, ung thu phổi, ung thư thực quản. Một số nhà nghiên cứu tin rằng nitrosamin đóng một phần vai trò trong sự thoái hóa não của bệnh Alzheimer.

Ngoài ra một số thí nghiệm cũng cho thấy một lượng nhỏ nitrosamin cũng có thể gây đái tháo đường, các bệnh về gan và béo phì. Chúng cũng được cho là có liên quan đến Parkinson. Nitrosamin có thể gây thương tổn DNA, gây chết tế bào và liên quan đến tình trạng kháng insulin [31]. Các nitrosamin đã được nhiều tổ chức phân loại là các chất có thể gây ung thư.

NDEA có khả năng gây ung thư lớn nhất, sau đó là NDMA, NPYR, NPIP. NPRO, NHPRO không gây ung thư. Độc tố di truyền và ung thư của một số nitrosamin vẫn chưa được làm rõ: NTCA, NMTCA. Hiện nay, NDMA và NDEA đã được tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A, còn NDPA được xếp vào nhóm 2B là nhóm có nguy cơ gây ung thư trên người [31].

Nitrosamin trong thực phẩm Bên cạnh những nguồn chứa nitrosamin từ môi trường, khói thuốc lá, nước uống, một số sản phẩm thực phẩm cũng có nguy cơ lớn có chứa nitrosamin.2 tóm tắt một số đối tượng thực phẩm thường có chứa nitrosamin [17],[29]. Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin Thực phẩm Loại nitrosamin Khoảng nồng độ (µg/kg) Thịt hun khói NDMA, NPYR, NDPA, NDPhA 1-100 Thịt cà ri NDMA, NPYR, NPIP KPH -50 Cá muối NDMA, NDEA KPH -1000 Cá kho NDMA, NDEA KPH -50 Bia NDMA KPH-5 Ghi chú: KPH là Không phát hiện Trong nhóm đối tượng sản phẩm chế biến từ thịt, hiện chưa có các thông tin về hàm lượng nitrosamin trong thịt nướng đặc biệt là thịt nướng có tẩm ướp gia vị. Với tác động của nhiệt độ, nguy cơ tạo thành nitrosamin trong các đối tượng này khá rõ rệt. Mặc dù tiềm ẩn nguy cơ gây ung thư, tuy nhiên nitrit vẫn được sử dụng để làm chất bảo quản trong các sản phẩm thịt để ngăn cản sự phát triển của Clostridium botulinum, từ đó giảm nguy cơ ngộ độc.

Để giảm sự tạo thành nitrosamin trong thực phẩm, người ta có thể sử dụng acid ascorbic hoặc α-tocopheral do các chất này phản ứng với N2O3. Trong những năm 1980, Dịch vụ kiểm tra và an toàn thực phẩm của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (FSIS) đã tiến hành đánh giá nitrosamin và kết luận rằng nitrosamin trong thịt nướng không gây ảnh hưởng đáng kể tới sức khỏe. Tuy nhiên, cùng với sự ưa chuộng của các sản phẩm thịt nướng trong thị hiếu người dân trong những năm gần đây mà lượng hấp thụ nitrosamin đang có xu hướng tăng trở lại. Quy định hiện hành về nitrosamin Hiện nay, đã có các quy định về hàm lượng tối đa của nitrosamin trong nước ăn uống, và một số đối tượng thực phẩm.

Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống[9] STT Quố c gia, khu vực Mức tối đa trong nước uống 100 ng/L (NDEA), 300 ng/L (NDMA), và 500 ng/L 1 Mỹ (NDPA) 2 Canada 0,04 μg/L (tổ ng nitrosamin) 3 Châu Âu Âm tính 4 Đức 10 ng/L (tổ ng nitrosamin) 5 Việt Nam Chưa quy định Bô ̣ Nông nghiê ̣p Mỹ gầ n đây đã có những nghiên cứu về nguy cơ của các nitrosamin trong thiṭ hun khói và khuyế n cáo hàm lươ ̣ng tố i đa trong thiṭ hun khói đố i với NPYR (chất có hàm lượng cao nhất) là 10 µg/kg. Đối với các nitrosamin khác, mặc dù hàm lượng khuyến cáo đến nay chưa được đưa ra nhưng đối với nhiều nghiên cứu đánh giá nguy cơ hiện nay đòi hỏi phương pháp phân tích phải đạt được mức LOQ đến 0,5 µg/kg [9],[21]. Phương pháp xác định các nitrosamin trong thực phẩm Về nguyên tắc, đầu tiên các nitrosamin được tách ra khỏi nền mẫu vào một dịch chiết thích hợp. Sau đó, một kỹ thuật phân tích phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượng nitrosamin trong dịch chiết từ đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu.

Phương pháp xử lý mẫu Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã được nghiên cứu để chiết nitrosamin trong thực phẩm. Trong khóa luận này sẽ đề cập đến các phương pháp bao gồm chưng cất, chiết lỏng – lỏng, vi chiết pha rắn, chiết pha rắn và QuEChERS. Chưng cất Theo kết quả của Sen và Seaman, mẫu thịt hun khói được kiềm hóa và chưng cất với dầu khoáng trong thiết bị chưng cất chân không và thu nitrosamin vào một thiết bị bẫy hơi, sau đó bẫy được chiết lại bằng DCM. DCM sau đó được cô để làm giàu và phân tích bằng sắc ký khí [30].

Kỹ thuật chưng cất này có hiệu quả tốt đối với nitrosamin đặc biệt là NDMA là chất có nhiệt độ bay hơi thấp. Phương pháp này sau đó đã được AOAC chấp nhận và trở thành phương pháp chuẩn AOAC 982. 5 Al-Kaseem và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật chưng cất hơi nước để cất các nitrosamin. Mẫu thịt được đồng nhất trong nước sau đó chưng cất nitrosamin vào pha nước.

Mẫu sau chưng cất được chiết lại bằng DCM và làm sạch bằng SPE [3]. Tuy nhiên, hiện nay phương pháp này ít được áp dụng do sự phức tạp của hệ thống chưng cất (yêu cầu hệ thống chưng cất đặc biệt và cần có N2 để làm mát). Việc sử dụng sắc ký khí với bộ phân tích TEA cũng ít phổ biến ngày nay. Chiết lỏng – lỏng Đối với một số mẫu dạng lỏng như bia, nước uống, kỹ thuật chiết lỏng lỏng có thể được áp dụng để chiết nitrosamin.

Ngày nay, kỹ thuật chiết lỏng lỏng với chất nhồi Celite hay Extrelut có thể được sử dụng. Nitrosamin được hấp phụ vào lớp nước bao quanh các hạt nhồi, sau đó được chiết lại bằng dung môi hữu cơ thích hợp như DCM hay hỗn hợp DCM và n-hexan. Phương pháp này có thể đạt độ thu hồi từ 74-85% với giới hạn phát hiện 0,5 µg/L. Một trong những phương pháp này sau đó đã trở thành phương pháp chính thức của AOAC, áp dụng cho nền mẫu bia [7].

Kỹ thuật chiết lỏng lỏng này cũng đã được nghiên cứu trên những nền mẫu thực phẩm khác như thịt và dầu ăn. Theo Yurchenko và cộng sự, bột Extrelut (diatomaceous earth) được nhồi vào cột thủy tinh và thực hiện chiết lỏng lỏng vào hỗn hợp n-hexan:DCM (4:6). Tuy nhiên, độ thu hồi của các nitrosamin thu được rất khác nhau, tốt nhất là NPYR (90%) nhưng chỉ thu được 27% đối với NDEA [32], [33].