ĐẶT VẤN ĐỀ Cellulase là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và phổ biến trong đời sống. Trong nông nghiệp enzyme này được dùng để chế biến thức ăn cho vật nuôi, sản xuất phân hữu cơ. Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase là tác nhân thủy phân nguyên liệu giàu cellulose (rơm rạ, mạt cưa, gỗ vụn,.) tạo thành glucose, mật đường thay thế cho phương pháp thủy phân bằng acid. Ngành sản xuất đường tại Việt Nam đã có từ lâu đời, từ khi người dân chúng ta biết làm nên mật mía từ cây mía, nhưng ngành công nghiệp mía đường tại Việt Nam chỉ mới bắt đầu phát triển vào đầu những năm 1990, vẫn còn rất non trẻ và khá lạc hậu.
Cho đến giai đoạn hiện nay ngành mía đường tại Việt Nam đã chưa phát triển mạnh để có thể trở thành ngành công nghiệp chủ lực của nền kinh tế Đi từ nhu cầu thực tế và nhu cầu giải quyết vấn đề còn tồn đọng nhằm góp phần giảm ô nhiễm môi trường và có thể tận dụng một cách có hiệu quả rác có nguồn gốc cellulose nói chung và nguồn phụ phế liệu của công nghiệp đường nói riêng là nguyên nhân của bài luận văn : “Tối ưu hóa môi trường tách chiết và tinh sạch enzyme Cellulase từ aspergillus awamori trên môi trường lên men bán rắn”. MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI Khảo sát thành phần môi trường cảm ứng để chủng nấm mốc aspergillus awamori cho hoạt lực enzyme cao nhất. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như: Tỷ lệ bã mía : cám mì; độ ẩm; pH; nồng độ dung dịch dinh dưỡng; thời gian nuôi cấy và tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của nấm mốc aspergillus awamori Tối ưu hóa các yếu tố bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra môi trường và các điều kiện nuôi cấy tối ưu. Phân tách hệ cellulase từ canh trương nuôi cấy bằng phương pháp điện di trên gel (SDS-PAGE) 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3 2.
Giới thiệu về cellulose Cellulose là một trong những hợp chất hữu cơ tự nhiên khá bền vững được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Hằng năm có khoảng 232 tỉ tấn hưu cơ sản sinh, trong số này có 172 tỉ tấn được tạo thành ở trên đất liền và 60 tỉ tấn được tạo thành ở trong các đại dương (Bazilevit,1971). Có 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40-50% trong gỗ.
Cellulose không tan trong nước mà chỉ có thể phồng lên khi hấp thu nước, bị phân hủy đun nóng với axit hoặc kiềm ở nồng độ khá cao, bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40-500C nhờ các enzyme thủy phân cellulose-được gọi chung là cellulase. Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose ( chiếm 20-40% trọng lượng khô), đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosacharide như galactose, mannose, glucose, xylose , arabinose và các nhóm acetyl, do bản chất không kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết chặt chẽ với lignin (10-25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme.Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông) cellulose tồn tại trong trạng thái polymer gần tinh khiết.
Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, rượu bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy. Cellulase: Cellulase là một nhóm enzyme hoạt động phối hợp trong việc thủy phân cellulose thành glucose (Emert, 1974 và Whitaker ,1971) .Hệ cellulase gồm 3 thành phần chính: exoglucanase (EC 3.4) và β-glucosidase (EC 3. Cellulase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm sợi. Ngoài ra, cellulase còn có mặt ở trong các hạt của thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất , sâu róm và ốc sên.
Từ hơn 100 năm qua, đã có một vài nghiên cứu về enzym phân giải cellulose trong quá trình nẩy mầm của thực vật, đó là enzym phân giải vách tế bào thực vật được gọi là cytase. Bary (1886), mô tả hoạt động của nấm sinh trưởng trên củ cải đường “Sợi nấm phân hủy vách tế bào và làm mềm mô củ cải giống như củ cải được nấu”. 4 Karrer và Schubert (1927), đã nghiên cứu sâu về hoạt động của enzym từ ốc sên trên cellulose tái sinh (tơ nhân tạo). Reese (1950), đã làm sáng tỏ các bước hoạt động thủy phân cellulose của cellulase.
C1 Cx ‐glucosidase Cellulose Cellulose Glucose Cellobiose Phản ứng Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết hydrogene trong phân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng - glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose. Nấm sợi aspergillus awamori 2. Vị trí phân loại và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sinh thái aspergillus awamori được phân loại như sau: -Giới : nấm -Ngành : Ascomycota -Lớp: Eurotiomycetes -Bộ : Eurotiales - Họ: Trichocomacea -Giống: Aspergillus -Loài: Aspergillus awamori 2. Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ A.awamori Môi trường sống: aspergillus awamori được phân lập từ lá rotton ,từ đất phân bố: aspergillus awamori phân bố ở Đài loan Kenya Mỹ Đặc điểm Là nấm mốc màu xám đen giàu hệ eyme amylase và được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất rượu 5 Hình 2.1 đại thể và vi thể của nấm mốc aspergillus awamori A.Đại thể của nấm mốc aspergillus awamori trên môi trường PGA B.vi thể của nấm mốc aspergillus awamori Hình 2.2 hình thái Aspergillus awamori A.khuẩn lạc trên môi trường thạch Czapeck, sau 10 ngày B.
khuẩn lạc trên môi trường malt Extract, sau 10 ngày C.Bào tử X1890 E bào tử(SEM) X12279 6 Đường kính khuẩn lạc trên môi trường thạch Czapeck là 4.0 cm trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng,các sợi tơ mọc thành từng khóm,đầu bào tử trần tỏa tia hoặc phân nhánh thành từng bó (cột),có màu nâu olive sáng đến màu nâu olive hay màu nâu olive đen, khuẩn ty có màu trắng đến vàng nhạt,mặt trái không màu đến màu vàng baryta , cuống bào tử có kích thước lớn 120-1510 x 4.0-18 µm có mày trong suốt đến vàng nâu trơn nhẵn túi bào tử có dạng hình cầu hoặc hình cầu méo,rộng 13-72 µm.thẻ bình chiếm ½ cho đến toàn bộ bề mặt của túi,có 0-3 vách,có kích thước là 4.đính bào tử hình cầu đến hình cầu méo dài 2.Đường kính khuẩn lạc trên môi trường Malt Extract agar là 6.0cm,trong 7 ngày ở 25 độ,phẳng,đầu bào tuwrtraanf tỏa tia hoặc chia thành từng bó (cột),gần nâu olive đến nâu olive tối ,khuẩn ty có màu trắng mặt trái không màu đến màu kem.Một số nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp cellulase từ A.awamori Nghiên cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 30°c. Theo Takashi và cộng sự (2002), nhiệt độ thích hợp đểAspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất là 37°c. Wainwright và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm A.
awamori là khoảng 5. Độ pH quá acid (khoảng 2-3) sẽ ngăn cản sự tạo thành bào tử, dẫn đến hệ sợi bị phân tán khi nuôi cấy chìm. Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm A.niger, gồm amylase, amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase. Ngoài ra chitinase của nấm này cũng được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010 [60].
Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng không có hại, nhưng một số có thể tạo độc tố gây hại đến động vật và con người. Sự an toàn của Aspergllỉus niger được đề cập đến trong nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng sự (2003), Blumenthal (2004), Olemspka-Beer và cộng sự (2006) [41]. Theo thông tin tóm tắt từ những bài báo của các tác giả này, khoảng 3- 10% các chủng Aspergillus niger có khả năng sinh ra độc tố thường những điều kiện nuôi cấy xác định như ochratoxin A.Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase.Điều hòa sinh tổng hợp cellulase. Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên môi trường chứa cellulose, dẫn xuất của cellulose và lactose; còn trên môi trường chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase không được sinh ra (Bisaria và Mishra, 1989; Béguin, 1990; Kubicek, 1993a).
Người ta cho rằng, các đoạn oligosaccharide ngắn được giải phóng từ cơ chất cellulose không tan, các phân tử này hoặc dẫn xuất của chúng được tế bào nấm sợi hấp thu và kích hoạt quá trính sinh tổng hợp cellulase. Một trong các phân tử kích thích nấm sợi sinh tổng hợp cellulase có hiệu quả nhất là sophorose (Mandels et al., 1962; Nisizawa et al., 1971), chất này có nguồn gốc từ các phân tử celloligosaccharide. Phân tích sự biểu hiện cellulase ở mức độ phân tử được thực hiện trên các đối tượng nấm sợi như A.awamori (El-Gogary et al., 1989; Fowler và Brown, 1992; Seiboth et al., 1992; Fowler et al., 1993; Kubicek, 1993b; Penttil et al., 1993; Stangl et al. chrysosporium (Covert et al.
niger (Macro et al. Các nghiên cứu này đã chứng minh rằng khả năng sinh tổng hợp cellulase ở các loài nấm sợi này được điều hòa ở mức độ phiên mã. Qua kiểm chứng các kết quả sinh hóa, phát hiện các phân tử mRNA mã hóa cho hệ cellulase từ các loài nấm sợi sinh trưởng trên cơ chất cellulose và trên lactose nhưng không phát hiện trong môi trường có cơ chất là glucose.awamori, các thành phần chính của hệ cellulase (CBHI, CBH2, EGI, và EG2) dường như được biểu hiện đồng thời trong các điều kiện cảm ứng khác nhau (Fowler và Brown 1992; Penttil 1993). Trong đó, mức độ mRNA mã hóa cho CBHI luôn cao nhất (Penttil, 1993), còn mức độ mRNA mã hóa cho các thành phần khác ở trạng thái ổn định.
Theo Gritzali và Brown (1979), tỷ lệ enzym CBHI cao nhất (chiếm khoảng 50%) trong hỗn hợp cellulase được tiết ra bởi A. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase: Nguồn carbon: Theo lý thuyết sinh tổng hợp enzym cảm ứng, trong môi trường nuôi cấy các vi sinh vật sinh cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn carbon. 8 Những nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, cám bổi, mùn cưa, bã củ cải, rơm, than bùn v. koning2 được nuôi trên môi trường có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất.
Chất cảm ứng enzym cellulase còn là cellobiozooctaacetat, cám mì, lactose, salixyl. Đối với Stachybotris atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là tinh bột (1%). Nguồn nitơ: Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh cellulase là muối nitrate.