MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có khả năng lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế. Ở Việt Nam bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa. Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987.
Sau đó xuất hiện ở nhiều nƣớc chăn nuôi lợn theo phƣơng thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)…. Từ năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nƣớc khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới. Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế (trực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn. Ƣớc tính hàng năm nƣớc Mỹ phải gánh chịu những tổn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trƣờng.
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Tuy nhiên các dịch bệnh nặng chỉ đƣợc thông báo vào đầu năm 2007, lây lan khắp 17 tỉnh thành, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi. Đến nay bệnh đã trở nên khó có thể kiểm soát đƣơ ̣c và lây lan ngày càng rộng hơn do tập quán và hệ thống chăn nuôi heo phức tạp ở Việt Nam. Để phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp vẫn đƣợc sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thú y.
Gần đây chỉ có một số lƣợng hạn chế các vắcxin bất hoạt và nhƣợc độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu. Tuy nhiên vắcxin dạng này có một số nhƣợc điểm nhƣ vắcxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thƣờng khô ng cao, còn vắcxin nhƣợc độc ta ̣o ra mức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tƣơng đồng nhƣng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại. Hiện nay trên thị trƣờng Việt Nam cũng có hai loại vắcxin chống Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm PRRSV dạng này nhƣng giá thành khá cao, hiệu quả lại thấp và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút. Vắcxin thực vật hay còn go ̣i là vắ cxin ăn đƣ ợc (edible vaccine) là một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại.
Thực chất vắcxin thực vật là vắcxin tiểu đơn vị đƣợc sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn. So với các hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có nhiều ƣu điểm nhƣ: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng nên dễ bảo quản và sử dụng; có thể dùng qua đƣờng miệng nhƣ ăn tƣơi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ; an toàn; đặc biệt vắcxin ăn đƣợc kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật”, đƣợc tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế về KH&CN theo nghị định thƣ giữa hai nƣớc Việt Nam – Vƣơng Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) của virus gây bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu tương” giai đoạn 2011-2013. Đề tài đƣợc tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với mục tiêu: i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho một số kháng nguyên của vi rút PRRS vào tế bào thực vật và ii) Đánh giá hiệu quả sử dụng của các vector thông qua việc phân tích sự biểu hiện của các kháng nguyên trong tế bào thuốc lá BY-2.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME, PRRS) 1. Giới thiệu chung Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có lan khả năng lây nhanh và có thể ghép với các loại mầm bệnh khác do đó làm ốm và chết hàng loạt lợn nhiễm bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế [54, 59]. Ở Việt Nam bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh.
Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa [61]. Bệnh đƣợc mô tả lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào năm 1987 và ở châu Âu vào những năm 1990, đầu tiên là Đức, Pháp và Anh sau đó lan tràn khắp châu Âu. Năm 1998, bệnh đƣợc phát hiện ở châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc …) [7, 59]. Thời gian đầu do chƣa xác định đƣợc nguyên nhân nên bệnh có nhiều tên gọi khác nhau [59, 60]: Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Swine Disease, MDS) Bệnh tai xanh (Blue Ear Disease, BED) Hội chứng hô hấp và sẩy thai ở lợn (Porcine Endemic Abortion & Respiratory Syndrome, PEARS) Hội chứng hô hấp và vô sinh ở lợn (Swine Infertility & Respiratory Syndrome, SIRS) Năm 1992, trong hội nghị quốc tế về sức khỏe gia súc, Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã nhất trí đă ̣t tên cho căn bê ̣nh này là “H ội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) [7].
Kể từ đó, tên này đã trở thành tên gọi chính thức của bệnh. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ. Đến nay, bệnh đã bùng phát và lây lan khắp các tỉnh thành trên cả nƣớc [28]. Triệu chứng bệnh Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các lứa tuổi và thƣờng biểu hiện ở hai trạng thái: sinh sản và hô hấp [28, 61, 62]: Rối loạn sinh sản: tăng số lƣợng lợn con sinh ra bi ̣ch ết hoặc chết trong bào thai (25-35%), lợn con sinh non chiếm 10% đồng thời chứng biếng ăn, tắt sữa ở lợn nái nuôi con làm tăng thêm tỉ lê ̣ lợn con chết trƣớc cai sữa.
Rối loạn hô hấp: lợn thở dốc, thở dồn dập, khi kiểm tra mô phổi cho thấy viêm phổi, hoại tử phổi rất nặng. VI RÖT GÂY BỆNH LỢN TAI XANH Năm 1991 Viện Thú y Lelystad, Hà Lan đã phân lập đƣợc vi rút gây bệnh lợn tai xanh, sau đó là Mỹ, Đức [59, 61]. Đến nay, các thông tin về loại vi rút này đã đƣợc nghiên cứu khá rõ. Bệnh lợn tai xanh gây ra bởi vi rút PRRS thuô ̣c chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, có genom là ARN sợi đơn dƣơng [18].
Đặc điểm hình thái PRRSV là vi rút hình cầu, có vỏ bọc ngoài với đƣờng kính virion vào khoảng 45 – 55 nm, nucleocapsid có đƣờng kính từ 30 – 35 nm. Đồng thời, PRRSV là vi rút ARN, có bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dƣơng, mang những đặc điểm chung của chi Arterivirus [18, 60, 61]. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi rút PRRS gây bê ̣nh lơ ̣n tai xanh [61]. Cấu trúc di truyền Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Hệ gen của vi rút PRRS là ARN sợi đơn dƣơng, có kích thƣớc khoảng 15 kb và chứa 9 khung đọc mở (ORF - open reading frame): 1a, 1b, 2a, 2b và 3-7.
Trong đó ORF1a và 1b mã hóa cho các protein phi cấu trúc nhƣ replicase, polymerase tham gia vào quá trình nhân bản của vi rút. Các ORF 2-7 mã hóa cho 6 protein cấu trúc bao gồm 4 phân tử glycoprotein (GP2, GP3, GP4, E), 1 phân tử protein mạng lƣới (M) và 1 protein vỏ nhân vi rút (N) [18] (Hình 1. Mô hình cấu trúc hệ gen của vi rút PRRS [61]. Dựa vào phân tích cấu trúc gen ngƣời ta xác tính đƣợc 2 nhóm vi rút PRRS: nhóm I gồm các vi rút thuộc chủng châu Âu (tên gọi phổ thông là vi rút Lelystad) gồm 4 phân nhóm (subtype) đã đƣợc xác định.
Nhóm II gồm các vi rút thuộc chủng Bắc Mỹ (với tên gọi là VR-2332) [18, 62]. Gần đây, một biến thể của nhóm II có độc lực cao hơn đã xuất hiện gây nhiều tổn thất ở châu Á [28, 61]. Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai nhóm PRRSV có nhiều nét chung, nhƣng các nghiên cứu cho thấy giữa hai nhóm có sự khác biệt lớn về bộ gen (mức độ tƣơng đồng chỉ 55-80%), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng nhƣ độc lực vi rút [7, 42]. Điều này có nghĩa là vắcxin đƣợc làm từ một chủng PRRSV sẽ không thể bảo vệ hoàn toàn cho đàn lợn.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ngƣời ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả 2 nhóm phân lập, đƣợc khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và axít amin của các khung đọc mở (ORFs).Tƣơng đồng về trình tự axít amin của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4 và 5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7) [7, 54]. Phân tích trình tự cho thấy các vi rút đang tiến hoá. Giải trình tự một phần hoặc từng gen riêng biệt, hoặc toàn bộ hệ gen, đặc biệt là vùng gen chức năng và cấu trúc (mã hóa cho GP2, 3, 4, E, M, N) cho thấy tiến hoá của các chủng vi rút là do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong các gen. Ví dụ gen m có độ dài 522 bp ở nhóm LV và 525 bp ở nhóm VR-2332 [9, 54].