Chương 1. Tổng quan về độc tố nọc rắn Nọc rắn là một nguồn khá đa dạng của nhiều hợp chất với một phổ hoạt tính sinh học rộng. Nhiều protein trong nọc rắn có hoạt tính enzyme của phospholipase A2, proteinase, nucleotidase, phosphodiesterase, và L-amino acid oxidase. Cùng với hoạt tính xúc tác có thể tham gia vào hoạt động phân giải của tuyến nọc, các enzyme này cũng bao gồm một số tác dụng dược học đa dạng như là tác dụng thần kinh, nhiễm độc cơ, tổn thương cơ tim, tác dụng làm tan và chảy máu cũng như chống đông máu.
Một số protein và polypeptide trong các loại nọc rắn khác không biểu hiện hoạt tính enzyme và do vậy được mô tả như những protein không có hoạt tính enzyme. Các protein này thường có kích thước 5 đến 10 kDa bao gồm các độc tố thần kinh, độc tố gây rối loạn tim, độc tố nhiễm độc cơ, các chất ức chế kênh ion và các protein chống đông máu. Đến nay hơn 1000 protein trong nọc rắn không có hoạt tính enzyme đã được xác định và được phân loại thành các họ protein như là: các độc tố dạng 3 thùy gồm độc tố thần kinh và độc tố rối loạn tim, các chất ức chế serine protease, các chất lectin, sarafatoxins, các yếu tố kích thích phát triển thần kinh, các atrial natriuretic peptide, các peptide kích thích bradykinin, disintegrin và helveprins [29], [33]. Về phân loại, nọc rắn có thể được chia thành 2 loại: hemotoxic (tấn công mô và mạch máu) và neurotoxic (tấn công hệ thống thần kinh).
Nọc rắn thường không màu hoặc có màu vàng nhạt phụ thuộc vào lượng L-aminoacide oxidase (riboflavin) có trong nọc. Nọc rắn không ổn định ở nhiệt độ thường, do vậy để duy trì hoạt tính sinh học của nọc rắn thì cần thiết phải tiến hành đông khô. Một đặc điểm đặc trưng là có sự khác nhau về thành phần nọc giữa các loài khác nhau và ngay trong bản thân mỗi loài. Sự khác nhau về thành phần nọc cũng được thể hiện giữa rắn con và rắn trưởng thành, giữa các vùng địa lý khác nhau.
Các protein nọc rắn, bất kể là có hay không có hoạt tính enzyme, thường tiến hóa theo hướng phá hủy chức năng của các mô, cơ quan và hệ thống sinh lý học. Do vậy khi nọc được đưa vào con mồi, nó gây ra sự tấn công đồng thời trên nhiều mô khác nhau, dẫn đến nhiều cơ quan hoặc hệ thống bị tổn thương và thường dẫn đến cái chết [44]. Độc tố thần kinh của nọc rắn (α-neurotoxin) cũng được biết đến như là các độc tố thần kinh (neurotoxin) sau synap. Chúng là thành phần độc nhất, chủ yếu được tìm 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan thấy trong nọc rắn thuộc họ Elapidae và Hydrophiidae.
Chúng gây ra sự tê liệt thần kinh bằng cách gắn với các thụ thể nicotinic ở vùng sau synap của hệ thống thần kinh cơ. Các độc tố thần kinh nọc rắn đã được nghiên cứu rộng rãi về khía cạnh mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng cũng như tổ chức gen và biểu hiện dưới dạng tái tổ hợp [9]. Các nghiên cứu đã chứng minh vai trò quan trọng của các độc tố thần kinh nọc rắn trên phương diện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trong Y-Dược. Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tích cực giải mã những bí mật ẩn chứa trong thành phần của các loài rắn độc.
Sự hiểu biết sâu hơn về thành phần nọc và cách thức tiết ra nọc qua hàng triệu năm tiến hóa hứa hẹn sẽ khám phá ra những loại kháng huyết thanh kháng nọc độc rắn tốt hơn trong tương lai đối với các nạn nhân bị rắn độc cắn. Quan trọng hơn, các nhà khoa học sẽ khám phá ra nhiều loại thuốc mới từ nọc rắn để chữa trị các bệnh ung thư, tim mạch và hàng loạt các loại bệnh khác [30]. Độc tố alpha Cobratoxin (α – Cbtx) có nguồn gốc từ nọc rắn hổ mang đất N. Độc tố này thuộc nhóm độc tố thần kinh nọc rắn chuỗi dài α-neurotoxin, có khả năng gắn với ái lực cao với các tiểu đơn vị α của thụ thể nicotinic acetylcholine tại màng sau synap của khớp nối dây thần kinh – cơ và một số mô tích điện.
Độc tố α – Cbtx được cấu tạo bởi 71 amino acid với 10 Cys tạo 5 liên kết disulfide, trong đó Cys26-Cys30 tham gia vào quá trình gắn với thụ thể alpha 7 nicotinic acetylcholine (α7nAChR). Trình tự amino acid của độc tố α – Cbtx: IRCFITPDIT SKDCPNGHVC YTKTWCDAFC SIRGKRVDLG CAATCPTVKT GVDIQCCSTD NCNPFPTRKRP (NCBI ID: P01391) Trong độc tố α – Cbtx các amino acid Cys 3, 14, 20, 41, 45, 56; Gly17, 40; Pro46; Asn63; Tyr21 đóng vai trò quan trọng trong hình thành cấu trúc không gian; Trp25, Arg33, Gly34 đóng vai trò chức năng, Cys26-Cys30, Lys35, Ala43, Ser58 và Asp60 là những amino acid bảo thủ của nhóm độc tố nọc rắn chuỗi dài. Những bằng chứng có giá trị liên quan đến ảnh hưởng của tính độc khi biến đổi hóa học đối với các nhóm bảo thủ cho thấy các amino acid Trp25, Asp27, Arg33, Gly34 và Lys49 đóng vai trò quan trọng trong quá trình gắn của độc tố α – Cbtx đối với thụ thể acetylcholine [10]. Có 6 amino acid đóng vai trò quan trọng trong liên kết với thụ thể là Trp25, Asp27, Arg33, Arg36 và Phe65.
Những aminoacid này thuộc vùng liên kết với thụ thể cơ (Torpedo AChR) và thụ thể thần kinh (α7AChR), trong đó, Arg 33 có vị trí gần với Tyr187 và Pro193 của α7 AChR. Ngoài ra, các amino acid Ala128, 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan Lys35, Cys26, Cys30 chỉ gắn chọn lọc với α7 AChR; Lys23 và Lys49 chỉ gắn với Torpedo AChR [36]. Thụ thể nicotinic acetylcholine và ứng dụng trong y học Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) là các thụ thể tác động theo kiểu choline, tạo thành những kênh gắn phối tử tại màng tế bào (không qua chất truyền tin thứ hai). Đây là loại thụ thể thuộc nhóm kênh ion đóng - mở phụ thuộc vào các phối tử và kênh này được khởi động bằng việc gắn acetylcholine – một trong những chất dẫn truyền thần kinh nghiên cứu tốt nhất.
Khi được giải phóng ra khỏi màng trước synap, acetylcholine khuếch tán nhanh qua khe synap và kết hợp với cơ quan thụ cảm ở màng của nơron thứ hai – còn gọi là màng sau synap. Kết quả làm thay đổi tính thấm của màng làm ion Na+ đi vào sau synap, gây khử cực màng nơron và làm xuất hiện điện thế sau synap. Điện thế này nhỏ hơn và kéo dài hơn so với xung thần kinh. Điện thế sau synap không tuân theo quy luật “tất cả hay không có gì” mà độ lớn nhỏ của nó phụ thuộc vào số lượng chất dẫn truyền được giải phóng [6].
Dựa trên vị trí và đặc tính dược học, nAChR được chia thành 2 nhóm theo vị trí định vị là nhóm định vị ở tế bào cơ và nhóm định vị ở tế bào thần kinh trung ương [12]. Thụ thể nACh là những protein lập thể nằm xuyên màng, kích thước xấp xỉ 290 kDa. Cấu tạo chung gồm 5 tiểu đơn vị được sắp xếp tuần tự quanh một lõi ion trong một mặt phẳng trực giao với màng tế bào [10]. Mỗi tiểu đơn vị được tạo thành bởi 4 chuỗi xuyên màng (MI, MII, MIII và MIV), ngoài ra còn có thêm vùng liên kết với phối tử phía đầu –NH2, một cấu trúc vòng lớn và dễ biến đổi nằm giữa MIII và MIV.
Chuỗi MII của cả 5 tiểu đơn vị đều tham gia tạo thành lõi dẫn truyền ion [38], [47]. Ngoài cấu tạo đặc trưng của loại kênh ion phụ thuộc phối tử, mỗi nhóm thụ thể nAChR lại có những sự kết hợp khác nhau của các tiểu đơn vị để tạo ra những nét đặc trưng riêng. Nhóm thụ thể nAChR cơ cấu tạo dạng 2α1, 1β, 1δ và 1γ. Ngược lại, thụ thể nAChR thần kinh được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị α cùng loại (α7, α9 hoặc α10) [17].
Sự kết hợp đa dạng của các tiểu đơn vị trong nhóm thụ thể nAChR tác động lên hệ thần kinh chính là đặc tính hấp dẫn các nhà nghiên cứu về hoá sinh học và dược học. Xác định được vai trò của mỗi loại tiểu đơn vị trong các mô tự nhiên sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động cũng như vai trò của thụ thể nAChR và điều này chỉ có thể tiến hành khi chúng ta phát triển được những mẫu dò chọn lọc đối với từng loại tiểu đơn vị [19]. 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan Hình 1: Các kiểu cấu trúc của nAChR (Tiffany J. Davis and Christopher M.
de Fiebre, Ph.) Kênh thụ thể acetylcholin là kênh dẫn truyền các tín hiệu thần kinh qua synap được nghiên cứu sâu nhất và nhiều nhất vì chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền xung thần kinh. Các xung thần kinh được truyền qua hầu hết các synap bởi các phân tử nhỏ có khả năng khuếch tán gọi là các chất truyền thần kinh (neurotransmitters) như acetylcholine. Màng trước synap được tách ra từ màng sau khớp thần kinh bằng một khe hở khoảng 50 nm, được gọi là khe synap. Điểm kết thúc của một sợi trục axon trước synap được lấp đầy bằng các bóng synap, mỗi bóng chứa khoảng 10 4 phân tử acetylcholine (Hình 2).
Một xung thần kinh mới xuất hiện làm tiết ra acetylcholin từ đồng thời khoảng 300 bóng synap, làm tăng lượng acetylcholine ở khe synap từ 10 nM lên 500 μM trong thời gian nhỏ hơn 1 mili giây [50]. Hình 2: Kênh dẫn truyền tín hiệu thần kinh qua synap (www.org) 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan Sự liên kết của acetylcholin với màng sau synap làm thay đổi tính thấm ion của nó một cách rõ rệt. Phân tử actylcholine đã mở ra một kênh trao đổi ion, tạo ra tính thấm cân bằng của Na+ và K+. Độ dẫn của cả Na+ và K+ tăng trong vòng 0,1 mili giây, kéo theo một lượng lớn Na+ vào trong và một lượng nhỏ K+ ra ngoài.
Sự xâm nhập của Na+ vào trong gây ra sự khử cực màng sau synap và sinh ra một điện thế hoạt động. Sự chảy vào của Na+ lớn hơn rất nhiều so với sự chảy ra của K+, do đó gradient điện thế qua màng là do Na+ sinh ra. Sự thay đổi tính thấm là do thụ thể nicotinic acetylcholine điều khiển. Khoảng thời gian để kênh mở ra dưới tác động của điều kiện sinh lý chỉ được đo bằng mili giây, vì acetylcholine trong khe synap nhanh chóng bị thủy phân thành acetate và choline do enzyme acetylcholinesterase.