Luận văn: Sàng lọc hợp chất thảo dược diệt khuẩn Helicobacter pylori

Luận văn sàng lọc và tìm ra các hợp chất thảo dược tiềm năng trong việc tiêu diệt vi khuẩn HP, mở ra hướng mới điều trị viêm loét dạ dày.

• Tác giả: Phạm Thị Vui
• Người hướng dẫn: Ts. Phạm Bảo Yên
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Sàng lọc một số hợp chất từ thảo dược có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Helicobacter pylori gây viêm loét dạ dày
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Vi khuẩn Helicobacter pylori và bệnh viêm loét dạ dày

Vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori) là nguyên nhân chính gây viêm loét dạ dày ở con người. Theo nghiên cứu từ Đại học Quốc gia Hà Nội, vi khuẩn H. pylori có khả năng xâm nhiễm vào niêm mạc dạ dày, gây ra các tổn thương và viêm loét. Tỷ lệ nhiễm H. pylori ở Việt Nam khá cao, đặc biệt ở các khu vực nông thôn. Bệnh viêm loét dạ dày không chỉ gây khó chịu mà còn có thể dẫn đến các biến chứng nguy hiểm như chảy máu dạ dày nếu không được điều trị kịp thời. Hiểu rõ về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn H. pylori là bước đầu tiên để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

1.1. Đặc điểm và cơ chế gây bệnh của H. pylori

Vi khuẩn H. pylori là một loại vi khuẩn gram âm, có khả năng sống trong môi trường axit của dạ dày. Nó sản xuất các enzyme đặc biệt giúp nó xuyên qua lớp nhầy dạ dày và gây viêm nhiễm. Vai trò của các enzyme vi khuẩn rất quan trọng trong việc duy trì sự sống và gây bệnh của nó. Vi khuẩn này có thể lây truyền qua đường ăn uống, nước bẩn hoặc tiếp xúc trực tiếp.

1.2. Tỷ lệ nhiễm và khả năng kháng thuốc

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn H. pylori ngày càng trở nên phổ biến, khiến việc điều trị bằng kháng sinh trở nên khó khăn hơn. Các chủng H. pylori kháng một số loại kháng sinh phổ biến như Metronidazole và Clarithromycin. Điều này tạo ra nhu cầu tìm kiếm các phương pháp điều trị thay thế, đặc biệt là từ thảo dược tự nhiên.

II. Nghiên cứu thảo dược diệt khuẩn HP

Nghiên cứu sàng lọc các hợp chất từ thảo dược có khả năng tiêu diệt vi khuẩn H. pylori là một hướng đi tiến bộ trong điều trị bệnh viêm loét dạ dày. Các thảo dược chữa bệnh dạ dày truyền thống đã được sử dụng trong y học cổ truyền Việt Nam nhiều năm. Thông qua các bài thuốc dân gian chữa bệnh dạ dày, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng nhiều thảo dược có tác dụng ức chế vi khuẩn H. pylori. Luận văn thạc sĩ khoa học từ Đại học Khoa học Tự nhiên đã sàng lọc và định danh các hợp chất từ thảo dược có hoạt tính mạnh mẽ. Những phát hiện này mở ra triển vọng phát triển các thuốc tự nhiên để điều trị hiệu quả bệnh viêm loét dạ dày.

2.1. Các thảo dược được nghiên cứu

Các thảo dược có khả năng diệt khuẩn HP được sàng lọc từ các bài thuốc dân gian truyền thống. Những loại thảo dược chữa dạ dày này chứa các hợp chất sinh học quý báu như Glycyrrhizic acid, Berberine, và Quercetin. Mỗi loại thảo dược có thành phần khác nhau, phụ thuộc vào bộ phận thu hái và cách chế biến. Các hợp chất từ thảo dược này đã chứng minh khả năng ức chế hoạt động của vi khuẩn H. pylori hiệu quả.

2.2. Tác động ức chế của thảo dược

Tác động ức chế vi khuẩn H. pylori của thảo dược được đánh giá thông qua các phương pháp thí nghiệm khoa học. Hoạt độ ức chế được xác định bằng cách đo sự sống sót của vi khuẩn khi tiếp xúc với dịch chiết thảo dược. Kết quả cho thấy nhiều loại thảo dược có hoạt tính tương đương hoặc cao hơn các kháng sinh truyền thống, nhưng không gây ra hiện tượng kháng thuốc.

III. Phương pháp và kết quả nghiên cứu khoa học

Nghiên cứu về thảo dược diệt khuẩn HP sử dụng các phương pháp khoa học hiện đại để phân lập và xác định hoạt tính. Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein tại Đại học Khoa học Tự nhiên đã thực hiện các thí nghiệm phức tạp. Phân lập vi khuẩn H. pylori từ mẫu nội soi bệnh nhân, sau đó đánh giá khả năng kháng một số loại kháng sinh bằng Etest. Các dịch chiết thảo dược được tối ưu hóa thành phần bằng sắc ký lớp mỏng để định danh các hợp chất có hoạt tính. Kết quả cho thấy hàm lượng cao khô của các dịch chiết ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả ức chế vi khuẩn.

3.1. Phương pháp phân lập và định danh

Phân lập vi khuẩn H. pylori được thực hiện từ các mẫu nội soi của bệnh nhân bị viêm loét dạ dày. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy và định danh bằng phương pháp PCR với trình tự mồi đặc hiệu. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để phát hiện và định danh các hợp chất từ thảo dược trong các dịch chiết. Kỹ thuật này cho phép các nhà nghiên cứu xác định chính xác thành phần hóa học và mối quan hệ giữa chúng và hoạt tính ức chế.

3.2. Đánh giá hoạt tính ức chế

Hoạt độ ức chế vi khuẩn H. pylori được đánh giá thông qua các phương pháp in vitro đơn giản nhưng hiệu quả. Các dịch chiết thảo dược được thêm vào môi trường nuôi cấy chứa vi khuẩn và theo dõi tỷ lệ sống sót. Đánh giá tính mẫn cảm của H. pylori với kháng sinh bằng Etest cho phép so sánh hoạt tính của thảo dược với các thuốc hiện có. Khả năng gây tan máu của dịch chiết cũng được kiểm tra để đánh giá độ an toàn.

IV. Ứng dụng lâm sàng và triển vọng phát triển

Kết quả nghiên cứu về thảo dược diệt khuẩn HP mở ra những triển vọng mới trong điều trị bệnh viêm loét dạ dày. Hợp chất từ thảo dược có hoạt tính mạnh mẽ có thể được phát triển thành các sản phẩm dược phẩm mới. Ưu điểm của thảo dược tự nhiên là chúng ít gây hiện tượng kháng thuốc và có tác dụng phụ nhẹ hơn so với kháng sinh hóa học. Các bài thuốc dân gian chữa bệnh dạ dày đã được xác nhận về mặt khoa học, có thể được tiêu chuẩn hóa để sử dụng rộng rãi. Sự kết hợp giữa y học cổ truyền và nghiên cứu khoa học hiện đại là chìa khóa để phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả cho bệnh viêm loét dạ dày.

4.1. Ưu điểm của liệu pháp thảo dược

Thảo dược chữa bệnh dạ dày có nhiều ưu điểm so với điều trị bằng kháng sinh. Thứ nhất, vi khuẩn H. pylori khó phát triển khả năng kháng thuốc đối với các thành phần từ thảo dược vì chúng có tác dụng đa hướng. Thứ hai, các hợp chất từ thảo dược thường có tác dụng phụ ít hơn và dung sai tốt hơn. Thứ ba, thảo dược tự nhiên rẻ hơn và dễ tiếp cận hơn so với các thuốc hiện đại, đặc biệt ở các nước đang phát triển.

4.2. Hướng phát triển trong tương lai

Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào phân lập và tinh sạch các hợp chất từ thảo dược có hoạt tính cao nhất. Các thử nghiệm lâm sàng trên con người cần được thực hiện để xác định liều lượng tối ưu và an toàn. Sự hợp tác giữa các phòng thí nghiệm và các cơ sở y tế sẽ giúp tăng tốc độ phát triển các sản phẩm mới. Tiêu chuẩn hóa các bài thuốc dân gian và cấp phép cho các sản phẩm thảo dược là bước quan trọng để đưa chúng vào sử dụng lâm sàng rộng rãi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, các bệnh về dạ dày, bao gồm cả ung thư dạ dày ngày càng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam. Năm 1982, Marshall và Warren phát hiện một loại vi khuẩn hiện diện ở niêm mạc dạ dày đặt tên là Campylobacter pylori, sau đặt tên là Helicobacter pylori (H. Vi khuẩn này được xác định là nguyên nhân chính gây ra phần lớn các bệnh lý liên quan đến dạ dày-tá tràng, do vậy tiệt trừ H. pylori được xem là liệu pháp quan trọng trong điều trị các bệnh dạ dày.

Phần lớn các phác đồ điều trị bệnh dạ dày do H. pylori sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh như amoxycillin, tetracyline, metronidazole và thuốc chống tiết acid hoặc thuốc bảo vệ niêm mạc dạ dày. Các phác đồ điều trị sử dụng kháng sinh trước đây là hiệu quả, tuy nhiên số liệu thống kê gần đây cho thấy khả năng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng. Chính vì vậy, việc nghiên cứu thuốc mới, đặc biệt từ các hợp chất thiên nhiên nhằm khắc phục tình trạng này, đồng thời hạn chế tác dụng phụ của thuốc có bản chất tổng hợp hóa học là nhu cầu cấp thiết.

Mặt khác, Việt Nam có nguồn thảo dược phong phú, được dùng trong nhiều bài thuốc cổ truyền để chữa đau dạ dày, từ đây có thể tìm thấy các chất ức chế tự nhiên đối với H. Với mục tiêu tìm ra hợp chất tự nhiên ức chế vi khuẩn H. pylori nhằm bước đầu ứng dụng trong nghiên cứu tìm ra thuốc mới chữa bệnh dạ dày, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Sàng lọc một số hợp chất từ thảo dƣợc có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Helicobacter pylori gây viêm loét dạ dày”. Phạm Thị 1 K22 Cao học sinh Luận văn thạc sĩ khoa Chƣơng 1.

Bệnh dạ dày Ngày nay, các bệnh về dạ dày, bao gồm cả ung thư dạ dày ngày càng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam. Bệnh lý thường gặp nhất trong số các bệnh này là viêm loét dạ dày hay còn gọi là bệnh dạ dày thường đi kèm với sự xuất hiện những tổn thương ở hệ thống ống tiêu hóa đặc biệt là phần đầu ruột non (Hình 1. Đặc điểm chính của bệnh là mãn tính, diễn biến có chu kỳ, thường tái phát và dễ gây biến chứng nguy hiểm như chảy máu hay thủng dạ dày thậm chí tiến triển thành ung thư dạ dày gây ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống và công việc của người bệnh. Một số vị trí tổn thương ở người mắc bệnh dạ dày [78] 1.

Thực trạng bệnh dạ dày ở Việt Nam và trên thế giới Bệnh dạ dày là căn bệnh có từ lâu và phổ biến trên thế giới [47] với khoảng 4 % người mắc bệnh. Riêng ở các nước phát triển tần suất mắc bệnh cao hơn gần gấp đôi (7-10 %) [58]. Theo thống kê, mỗi năm khoảng 0,1-0,2 % dân số được chẩn đoán mắc mới, tỷ lệ những người nhập viện do mắc mới từ 0,03-0,17 % (Bảng 1. Tại Mỹ, bệnh dạ dày ảnh hưởng tới 5.000 người, mỗi năm có khoảng 500.000 người mới mắc bệnh [37].

Ở các nước châu Âu và Australia, từ năm 1992-1999 tỷ lệ mắc bệnh dạ dày giảm từ 205 xuống còn 7,7 người mắc bệnh/100. Bệnh dạ dày có thể gặp ở mọi lứa tuổi và giới tính, tuy nhiên ở trẻ em ít phổ biến hơn, thường được phát hiện lần đầu trong độ tuổi 30-50 và phát triển thành viêm dạ dày ở độ tuổi trên 60 tuổi [24]. Những người có nguy cơ mắc bệnh cao nhất là nam Phạm Thị 2 K22 Cao học sinh Luận văn thạc sĩ khoa giới ở độ tuổi từ 55-65. 35 % trong số các bệnh nhân viêm loét được chẩn đoán là có các biến chứng nguy hiểm có thể dẫn đến ung thư dạ dày [82].

Tỷ lệ mắc bệnh dạ dày được phát hiện đối với dân số nói chung năm 2009 [70] Chẩn đoán Tài liệu tham khảo Quốc gia Kích Tỷ lệ mắc mới cơ bản thƣớc bệnh dạ dày mẫu (%/năm) Bác sĩ chẩn Bartholomeeusen và Bỉ 140.000 0,19 đoán cs (2007) Garcia Rodruigez Anh 458.840 0,10 and Hernandez Diaz (2004) Lassen và cs (2006) Đan Mạch 470.000 0,15 Perez-Aisa và cs Tây Ban Nha 237.000 0,17 Paimela và cs (2002) Phần Lan 5.000 0,07 Post và cs (2002) Hà Lan 15.000 0,03 Tỷ lệ tử vong do viêm loét dạ dày thấp, tuy nhiên tỷ lệ mắc mới và tử vong do biến chứng của bệnh rất cao. Năm 2012, trên thế giới có khoảng 952.000 người mắc mới ung thư dạ dày, bệnh ung thư phổ biến thứ 5 sau các bệnh ung thư phổi, vú, đại trực tràng và tuyến tiền liệt [81]. Trong đó, trên 70 % trường hợp mắc bệnh (677.000 người) là ở các nước đang phát triển và một nửa trong số này đến từ các nước Đông Á (Đông Nam Á và Trung Quốc) mà chủ yếu là từ Trung Quốc. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2012, tại Mỹ có 21.000 trường hợp mới mắc bệnh, khu vực Đông Nam Á có 91.000 người trong khi đó Trung Quốc có 405.000 trường hợp [96].

Đến năm 2014, tại Mỹ, khoảng 22.220 người được chẩn đoán mắc ung thư dạ dày trong số đó có 10.990 bệnh nhân có nguy cơ tử vong cao [65]. Trên thế giới, ung thư dạ dày là nguyên nhân gây tử vong thứ 2 trong số các bệnh ung thư (Hình 1. Năm 2012 trên toàn thế giới có 723.000 người tử vong vì ung thư dạ dày, chiếm 8,8 % số trường hợp tử vong vì ung thư trên toàn thế giới. Tỷ lệ tử vong cao nhất ở các nước Châu Phi và thấp nhất ở các nước phát triển [96].

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, Trung Quốc là nước có số trường hợp mắc Phạm Thị 3 K22 Cao học sinh Luận văn thạc sĩ khoa mới và tử vong liên quan đến bệnh ung thư dạ dày cao nhất thế giới, tiếp theo là Nhật Bản và Ấn Độ. Ước lượng tổng số trường hợp tử vong do ung thư bởi cơ quan nghiên cứu Ung thư Quốc tế và hiệp hội Gánh nặng Ung thư Toàn cầu năm 2000 [60] Ở Việt Nam, những năm gần đây, bệnh viêm loét dạ dày thường đứng đầu trong các bệnh về đường tiêu hóa (với tỷ lệ khoảng 26 %) và có chiều hướng ngày càng gia tăng. Theo Niên giám thống kê của Bộ Y tế năm 2013, tỷ lệ người mắc viêm dạ dày, ruột non có nguồn gốc nhiễm khuẩn là 243,3/100. Đây là một trong 10 bệnh có tỷ lệ người mắc cao nhất (Bảng 1.

Năm 2012, Việt Nam là nước có số trường hợp mắc mới, tử vong do ung thư dạ dày cao thứ 9 trên thế giới, cao nhất trong khu vực Đông Nam Á. Theo thống kê năm 2012, Việt Nam có 14.203 trường hợp mắc ung thư dạ dày, gần 70 % số trường hợp là nam giới (9.591 ca tử vong, tỷ lệ tử vong cao thứ 3 sau các bệnh lý về gan (15.995 ca) và phổi (14. Phạm Thị 4 K22 Cao học sinh Luận văn thạc sĩ khoa Bảng 1. Tỷ lệ các bệnh hay mắc phải ở Việt Nam năm 2013 [1] Tỷ lệ mắc STT Tên bệnh bệnh (Trên 100.000 ngƣời) 1 Các bệnh viêm phổi 470,0 2 Viêm họng và viêm amidan cấp 396,7 3 Tăng huyết áp nguyên phát 359,3 4 Các tổn thương khác do chấn thương xác định ở nhiều nơi 357,0 5 Viêm phế quản và viêm tiểu phế quản 289,2 6 Tiêu chảy, viêm dạ dày, ruột non có nguồn gốc nhiễm 243,3 khuẩn 7 Viêm dạ dày và tá tràng 211,6 8 Bệnh virut khác 182,9 9 Sốt virut khác do tiết túc truyền và sốt virut xuất huyết 170,5 10 Bệnh khác của cột sống 168,8 Các số liệu trên cho thấy, bệnh dạ dày là căn bệnh rất phổ biến với những biến chứng nguy hiểm như ung thư dạ dày với tỷ lệ tử vong cao trên thế giới cũng như ở Việt Nam.

Nguyên nhân và chẩn đoán viêm loét dạ dày 1. Nguyên nhân Trong nhiều năm, acid dư thừa được cho là nguyên nhân chính của bệnh loét dạ dày-tá tràng. Tuy nhiên, gần đây các nghiên cứu chỉ ra rằng tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn và hóa chất (thuốc kháng viêm không chứa steroid-NSAID). Ngoài ra, một số yếu tố như cuộc sống căng thẳng, các tác nhân gây ô nhiễm môi trường như khói thuốc lá cũng góp phần gây viêm loét.

Tác nhân vi khuẩn: Hệ tiêu hóa của người có rất nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Năm 2003, Bondarenko công bố ngoài H. pylori, nấm thuộc chi Candida, Streptococcus, trong dạ dày người còn có Bacillus, Lactobacillus [31]. Tuy nhiên, nhiễm vi khuẩn H.

pylori là một trong những nhiễm khuẩn thường gặp nhất ở người, dù tỷ lệ thay đổi khá lớn và tỷ lệ nghịch với mức độ phát triển kinh tế. Từ khi được phát hiện ra, H. pylori được công Phạm Thị 5 K22 Cao học sinh Luận văn thạc sĩ khoa nhận là tác nhân hàng đầu của một số bệnh đường tiêu hóa trên như loét dạ dày-tá tràng, ung thư biểu mô tuyến dạ dày và lymphoma tế bào B nguyên phát ở dạ dày [68]. pylori được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp loại là tác nhân gây ung thư số 1 [8].

Tác nhân hóa chất: Tỷ lệ viêm loét ở người sử dụng NSAID mãn tính là khoảng 20 %, trong khi những người không dùng thuốc là 5 %. Một số thuốc giảm đau thông thường như aspirin, ibuprofen và naproxen đã được chứng minh có khả năng gây viêm dạ dày cấp và mãn tính. Dù chỉ sử dụng liều thấp (0,3-1 g) nhóm thuốc này cũng có tác động đến việc phá hủy yếu tố bảo vệ dẫn tới viêm loét dạ dày. Khả năng bị viêm loét do sử dụng NSAID tăng khi bệnh nhân trên 60 tuổi, có tiền sử mắc bệnh dạ dày hoặc sử dụng thuốc NSAID liều cao, bị nhiễm H.

pylori hoặc đồng thời sử dụng thuốc kháng corticosteroid [65]. Yếu tố khác (khói thuốc lá, ăn uống, ô nhiễm môi trường): Theo Kurata và cs (1997), 23 % bệnh nhân viêm loét dạ dày do sử dụng thuốc lá [52]. Thuốc lá làm tăng nguy cơ xuất hiện các ổ loét mới và làm chậm sự lành sẹo hoặc gây đề kháng với điều trị. Đến nay, cơ chế gây loét của thuốc lá vẫn chưa được biết rõ.

Có nhiều nghiên cứu cho rằng thói quen ăn uống vội vàng, vừa ăn vừa xem tivi hoặc đọc sách khiến dạ dày phải làm việc, tiết acid quá mức làm niêm mạc dạ dày bị ăn mòn, lâu dần dẫn đến viêm loét và một số bệnh khác. Chẩn đoán bệnh viêm loét dạ dày Bệnh nhân viêm loét dạ dày không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng cụ thể, thường gặp nhất là cơn đau âm ỉ vùng thượng vị nhưng không có tính chất chu kì.