Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV tăng sinh tổng hợp tinh bột

Nghiên cứu phân lập, thiết kế vector chuyển gen ssiv mã hóa enzyme starch synthase. Tăng cường sinh tổng hợp tinh bột, mở ra tiềm năng ứng dụng nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Mậu Hưng
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bích Ngọc
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• Mục đích nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• Ý nghĩa khoa học
• 1. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột
• 1.1.1. Giới thiệu về tinh bột
• 1.1.2. Cấu trúc của tinh bột
• 1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT
• 1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT
• 1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp
• 1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan
• 1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột
• 1.2. Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam
• 1.3. Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp
• 1.4. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật
• 1.5. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật
• 1.6. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ
• 2. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu , hóa chất và thiết bị
• 2.2. Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng
• 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV
• 2.3.2. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140
• 2.3.3. Phản ứng RT-PCR
• 2.3.4. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO
• 2.3.5. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc
• 2.3.6. Tách chiết plasmid
• 2.3.7. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank
• 2.3.8. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway
• 2.3.9. Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
• 2.3.10. Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc
• 2.3.11. Phƣơng pháp xử lí số liệu
• 3. CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase ở sắn
• 3.2. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140
• 3.3. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA
• 3.4. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn
• 3.5. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tƣơng ứng
• 3.6. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway
• 3.7. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen đã thiết kế
• 3.8. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV
• 3.9. Phân tích các dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật PCR
• 3.10. Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• Tài Liệu Tham Khảo
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu SSIV Tăng Cường Sinh Tổng Hợp

Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ chính của cây trồng, có ý nghĩa quan trọng đối với đời sống nhân loại. Tinh bột là chất rắn không hòa tan, có cấu trúc dạng polymer được tạo ra từ các monomer là glucose. Tùy thuộc vào dạng liên kết của các phân tử glucose mà tạo thành dạng mạch thẳng amylose, hoặc dạng mạch nhánh amylopectin. Tinh bột được tích lũy chủ yếu ở cơ quan củ của thực vật: củ sắn, củ khoai tây, củ khoai lang, củ rong giềng… Tinh bột có vai trò quan trọng trong đời sống, là nguồn cung cấp carbohydrate hay năng lượng chính cho con người. Ngoài ra, tinh bột còn được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp như thực phẩm, dược. Trung bình trên thế giới sử dụng tới 60 triệu tấn tinh bột hàng năm bao gồm bột mỳ, bột ngô, bột khoai tây, bột gạo, bột sắn, bột khoai lang. Hầu hết tinh bột được sử dụng cho các ngành công nghiệp chế biến như: sử dụng làm chất nền cho quá trình lên men của vi sinh vật (chủ yếu cho sản xuất mỳ chính), công nghiệp dệt vải sợi, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác. Hàm lượng tinh bột, kích thước hạt tinh bột và hàm lượng amylose là những tính chất quan trọng của tinh bột có ảnh hưởng nhiều đến các sản phẩm trong các ngành công nghiệp thực phẩm (mì sợi, bánh bì và bánh cookies) và phi thực phẩm (dệt, giấy, và dược phẩm). Các tính chất này quyết định độ nở của bột mì và tinh bột lúa mì, đó là các chỉ số quan trọng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm giàu tinh bột như mì sợi và mì ăn liền. Đặc tính tinh bột chịu ảnh hưởng của gen cũng như môi trường tăng trưởng. Sự hiểu biến đổi của tính chất tinh bột được quyết định bởi hai yếu tố là giống và điều kiện môi trường xung quanh. Cùng một điều kiện, tính chất tinh bột có thể thay đổi ở các giống khác nhau. Tương tự, cùng một giống trồng ở môi trường khác nhau tính chất tinh bột cũng thay đổi, từ đó sẽ gây khó khăn cho các nhà dinh dưỡng và nhà chế biến thực phẩm trong việc dự đoán thành phần hóa học và quá trình chế biến. Các nghiên cứu về chọn lọc các giống cho hàm lượng tốt đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống cho chất lượng tinh bột tốt và ổn định. Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang còn ít và chưa cụ thể. Xuất phát từ thực tiễn đó, cùng với sự phát triển công nghệ và các nghiên cứu lâu năm của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhóm nghiên cứu tiến hành tập trung đánh giá cụ thể hoạt động của gen Starch Synthase IV. Đây là một trong 5 gen quyết định lớn đến sinh tổng hợp và cấu trúc của tinh bột. Để có được Starch Synthase IV cũng như đánh giá gen này chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột”.

1.1. Tầm quan trọng của tinh bột trong sản xuất lương thực

Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác. Ngoài sử dụng làm thực phẩm ra, tinh bột còn được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, rượu, băng bó xương. Tinh bột được tách ra từ hạt như ngô và lúa mì, từ rễ và củ như sắn, khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong công nghiệp. Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi. Tuy nhiên nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên. Đặc biệt tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên do đặc tính dễ lên men.

1.2. Vai trò của gen Starch Synthase IV SSIV

Các starch synthase (SS) của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký hiệu là GBSS (granule-bound starch synthase), SSI, SSII, SSIII, và SSIV. GBSS gắn chặt với hạt tinh bột và chịu trách nhiệm tổng họp amylose. Các biến thể khác nhau của SS (thường gọi là SS hòa tan) tạo ra các chuỗi amylopectin (1 dạng tinh bột đã polyme hóa) có thể tan hoặc trong các plastic hoặc một phần hòa tan một phần gắn với hạt tinh bột. Số liệu di truyền và sinh hóa chỉ ra rằng mỗi biến thể enzyme SS có các cấu thành khác nhau và vai trò nhất định trong tổng hợp amylopectin.

II. Vấn Đề Nghiên Cứu SSIV Thách Thức Cải Tạo Năng Suất

Các nghiên cứu về chọn lọc các giống cho hàm lượng tốt đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống cho chất lượng tinh bột tốt và ổn định. Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang còn ít và chưa cụ thể. Tinh bột nguồn gốc khác nhau, enzyme nguồn gốc khác nhau thì khả năng thủy phân cũng khác nhau. Trong kế hoạch 5 năm 2011-2015, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đưa ra chủ trương giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn. Kế hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha, năng suất đạt khoảng 178 tạ/ha. Nếu đạt được theo kế hoạch thì với mức sản lượng 8,9 triệu tấn vẫn sẽ xảy ra tình trạng tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản xuất ethanol với các nhà máy thức ăn chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn và lượng sắn dùng cho xuất khẩu. Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải tạo cây sắn theo hướng các tính trạng có lợi như năng suất cao, chất lượng phù hợp mục đích sử dụng nhằm phục vụ công nghiệp và xuất khẩu là một vấn đề cấp thiết ở nước ta. Phần lớn các nghiên cứu về sắn ở Việt Nam trong thời gian gần đây chủ yếu sử dụng các phương pháp truyền thống để chọn tạo, lai tạo giống sắn mới từ các giống nhập nội và giống địa phương nhằm cải tiến năng suất. Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong nghiên cứu về sắn đang ở giai đoạn khởi đầu và sử dụng các phương pháp đơn giản như nuôi cấy mô để giữ giống, nhân nhanh in vitro một số giống mới. Các hướng nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử và di truyền học chưa được quan tâm và phát triển. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ các giống sắn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn bằng công nghệ gen.

2.1. Hạn chế của phương pháp chọn giống truyền thống

Không giống những cây trồng chủ yếu khác trên thế giới, sắn đặc biệt không thể cải tạo về mặt di truyền qua lai hữu tính. Nhiều giống sắn hiếm khi ra hoa và năng suất hạt thường rất là thấp. Sắn thường được nhân lên bằng sinh sản sinh dưỡng dựa vào các đoạn thân. Đặc điểm tự nhiên này gây hạn chế về mặt lai tạo nhưng đem lại thuận lợi đối với việc sử dụng sinh học phân tử để cải tạo giống, vì mỗi cây đều được nhân lên từ một dòng, phân ly hoặc di chuyển của gen qua lại giữa các loài là rất hạn chế.

2.2. Nhu cầu cấp thiết ứng dụng công nghệ sinh học vào cây sắn

Chính vì vậy mà áp dụng những tiến bộ của công nghệ gen đối với cây sắn trở nên cần thiết và là một trong những yêu cầu mà thực tiễn sản xuất đòi hỏi. Công nghệ gen có thể tạo ra những giống sắn mới mang những tính trạng mong đợi. Thêm vào đó công nghệ này có thể chuyển những tính trạng tốt từ các giống sắn dại vào giống sắn đang canh tác mà điều này thường gặp trở ngại rất lớn do các yếu tố về di truyền khi sử dụng phương pháp lai truyền thống.

III. Phân Lập Gen SSIV Quy Trình Đánh Giá Mức Độ Phiên Mã

Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế để khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn đã tổng hợp bằng phản ứng PCR dưới sự xúc tác của enzyme Pfu DNA polymerase. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công 1 đoạn DNA có kích thước gần 3,5 kb tương đương với kích thước đoạn CDS của gen SSIV theo lý thuyết. Đoạn DNA này sau đó được tinh sạch và gắn vào vector pENTRTM/D- TOPO trong dung dịch muối đệm tạo thành vector pENTR/SSIV. Sản phẩm của phản ứng TOPO cloning được sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli One Shot TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Sàng lọc các dòng khuẩn lạc trên đĩa biến nạp bằng phương pháp colony-PCR sử dụng cặp mồi M13F/R, chúng tôi đã chọn được 3 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính với kích thước băng DNA đúng như tính toán là > 3,5 kb. 3 dòng này sau đó được nuôi lượng lớn để tách chiết plasmid phục vụ cho việc giải trình tự gen. Kết quả giải trình tự cho thấy gen SSIV của giống sắn KM140 đã phân lập có kích thước 3189 bp mã hóa cho 1063 axit amin, có độ tương đồng 99% so với trình tự gen SSIV trên phytozome với mã cassava4.1_000719m, chứng tỏ chúng tôi đã phân lập thành công gen SSIV từ giống sắn KM140. Trình tự gen SSIV phân lập được từ giống sắn KM140 đang được đăng kí trên ngân hàng GenBank với mã số dự kiến là KT033500.

3.1. Tổng hợp cDNA và thiết kế mồi đặc hiệu SSIV

Để tăng hiệu suất cũng như độ đặc hiệu của phản ứng PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn, chúng tôi tiến hành tổng hợp cDNA từ RNA tổng số tách chiết từ củ sắn sử dụng mồi đặc hiệu. Theo đó, cDNA được tổng hợp theo kít ―RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit‖ (Thermo Scientific). Chúng tôi sử dụng trình tự CDS của gen SSIV sắn trên phytozome với mã cassava4.1_000719m để thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen SSIV từ cDNA củ sắn là SSIV_F và SSIV_R. Trên mồi xuôi có chứa trình tự CACC ở đầu 5’ giúp quá trình nối ghép gen đích vào vector pENTR được đơn giản hóa nhờ phản ứng TOPO cloning - một phương pháp tạo dòng của Invitrogen.

3.2. Quy trình tách dòng và xác định trình tự gen SSIV

Sản phẩm PCR được gắn vào vector pENTR theo pENTR™/D-TOPO® Cloning Kit. Hỗn hợp phản ứng được ủ 5’ ở nhiệt độ phòng (22-23oC). Đặt phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào E.coli One Shot Competent. Bổ sung 2 µl phản ứng TOPO Cloning vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Ủ trong đá 10 phút. Sốc nhiệt tế bào 30s,ở 42oC rồi chuyển ngay ống vào đá. Bổ sung 250 µl môi trường S.C ở nhiệt độ phòng. Nuôi lắc 200v/p, 37oC, 1h. Cấy trải 50-200 µl dịch biến nạp lên đĩa môi trường LB đặc chứa 100 µg/ml Kanamycin và ủ qua đêm ở 37oC. Các mẫu plasmid tái tổ được xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Gentic Analyzer. Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit, BLAST để so sánh các trình tự gen.

IV. Thiết Kế Vector SSIV Gateway Giải Pháp Chuyển Gen

Kỹ thuật Gateway là một phương pháp nhân dòng phổ biến và tiện ích dựa trên cơ sở phản ứng tái tổ hợp đặc hiệu vị trí giữa các điểm chuyên biệt ở DNA của phage và vi khuẩn được gọi là các điểm gắn (attachment sites). Với kỹ thuật này, một hoặc nhiều gen đích có thể di chuyển từ entry clone vào bất kì vector đích biểu hiện nào theo đúng chiều và khung đọc chỉ trong một bước thao tác mà không phải sử dụng bất kỳ enzyme cắt giới hạn nào. pK7WG2D là một vector thuộc hệ thống Gateway với cấu trúc gồm 1 vùng chứa cassette attR1- ccdB-attR2. Vì vậy, sản phẩm của phản ứng LR là một plasmid có chứa 1 vị trí tái tổ hợp mang gen đích có chiều mong muốn. Thành phần và các bước thực hiện phản ứng LR được thực hiện theo hướng dẫn của bộ Kit Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix của Invitrogen với vector đích là pK7WG2D và entry clone chính là vector pENTR/SSIV đã thiết kế thành công. Sản phẩm của phản ứng được sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli One Shot TOP10 và chọn lọc trên môi trường có bổ sung Spectinomycin 100 µg/ml.

4.1. Ưu điểm của kỹ thuật Gateway trong chuyển gen

Kỹ thuật Gateway cho phép chuyển đoạn gen quan tâm vào destination vector pK7GWG2D. Vector này chứa tất cả trình tự cần biểu hiện như các điểm tái tổ hợp (attR1 và attR2) ở giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính ccdB, các gen chọn lọc (Spectinomicin hay Streptomycin, Kanamycin). Hai sự tái tổ hợp: một là giữa attL1 và attR1, hai là attL2 và attR2 tạo ra dòng biểu hiện.

4.2. Tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium mang vector chuyển gen

Vector chuyển gen pK7WG2D/SSIV đã thiết kế được sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến chủng A. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường YMB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l Spectinomycin, ủ ở 28oC. Sau 2 ngày thu được một lượng lớn khuẩn lạc trên đĩa thạch. Sau khi sàng lọc bằng phương pháp colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R, các dòng Agrobacterium mang cấu trúc chuyển gen sau đó sẽ được nuôi lỏng trong 3 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc ở 28oC qua đêm, và bảo quản trong Glycerol 20% trong tủ -84oC.

V. Chuyển Gen SSIV Tạo Rễ Tơ Khoai Lang Phương Pháp Mới

Thí nghiệm này chúng tôi chọn hệ thống nuôi cấy rễ tơ với mục đích đánh giá khả năng tăng cường sinh tổng hợp tinh bột của gen SSIV trên mô hình cây khoai lang KB1. Đối với mỗi cấu trúc gen SSIV, chúng tôi sử dụng 216 mảnh lá và đoạn thân khoai lang. Sau khi lây nhiễm và đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium, các mảnh khoai lang được đặt trên môi trường chọn lọc có bổ sung kanamycin ở nồng độ cao (30 - 50 mg/L). Do trong quá trình xâm nhiễm, ngoài các cấu trúc gen SSIV, gen SSIV trên vector chuyển gen mã hóa cho enzyme phân hủy kanamycin cũng đƣợc tích hợp vào genome thực vật chủ nên chỉ những mô lá, thân đƣợc chuyển gen mới có thể sống sót trên môi trƣờng kháng sinh kanamycine và cảm ứng tạo rễ.

5.1. Đánh giá tiềm năng của hệ thống nuôi cấy rễ tơ

Nuôi cấy rễ tơ có nhiều ưu điểm do rễ tơ có thể sinh trưởng nhanh, phân nhánh mạnh trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa, rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Không giống với các dạng tế bào thực vật khác như tế bào huyền phù và mô sẹo thường có xu hướng không ổn định về mặt di truyền và hóa sinh, rễ tơ là cơ quan biệt hóa nên có sự di truyền ổn định hơn và có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và protein tái tổ hợp.

5.2. Quy trình chuyển gen SSIV vào khoai lang và tạo rễ tơ

Chủng khuần A.rhizogenes K599/SSIV gốc được cấy ria trên môi trường YMB đặc bổ sung 100 mg/l spectinomycine và 100 mg/l Streptomycine, nuôi trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ. Lấy một khuẩn lạc nuôi phục hồi trong trong 20 ml YMB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc (100 mg/l spectinomycine và 100 mg/l Streptomycine) nuôi lắc 200 vòng/phút qua đêm . Nuôi nhân thu sinh khối: lấy 5 ml dịch khuẩn phục hồi cho vào 45 ml YMB lỏng (không chứa kháng sinh chọn lọc), nuôi lắc 200 vòng/phút, 28o C trong 4 -6 giờ. Các môi trường nuôi khuẩn đều không bổ sung kháng sinh do vector pRi 15834 không có gen kháng kháng sinh. Dịch khuẩn được đem ly tâm 6500 vòng/phút ở 4o C thu sinh khối, loại bỏ môi trường nuôi cấy. Cặn khuẩn được hòa tan trong môi trường MS lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn. Các mẫu lá khoai lang được cắt tạo tổn thương sau đó được lây nhiễm bằng cách ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn . Sau khi lây nhiễm, mẫu biến nạp được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng rồi được đặt vào môi trường đồng nuôi cấy.

VI. Phân Tích Rễ Tơ PCR Xác Nhận Chuyển Gen SSIV Thành Công

Để khẳng định các rễ tơ khoai lang chuyển gen sống sót trên môi trường chọn lọc có mang gen SSIV, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của 47 dòng rễ tơ khoai lang. Sản phẩm tách được định lượng DNA bằng máy quang phổ, sau đó sản phẩm được tiến hành điện di trên gel agarose 0,8 %. Kết quả định lượng DNA bằng máy đo quang phổ cho thấy các mẫu DNA tách chiết có nồng độ cao, chỉ số A260/280 đạt trong khoảng 1,8-2, điều đó chứng tỏ các mẫu tách chiết đảm bảo độ tinh sạch cho các thí nghiệm tiếp theo. Tiếp đó, chúng tôi tiến hành kỹ thuật điện di DNA tổng số trên agarose0,8% để kiểm tra chất lượng của DNA. Sau khi tiến hành kỹ thuật điện di các mẫu DNA tổng số chúng tôi thấy rằng, DNA tổng số các rễ tơ khoai lang chuyển gen được chọn để tiến hành kỹ thuật PCR

6.1. Tối ưu quy trình tách chiết DNA từ rễ tơ

DNA genome tạp nhiễm sau đó được loại bỏ bằng cách xử lý mẫu với DNase I và RNA tổng số được tinh sạch bằng phương pháp tủa sử dụng Lithium chloride (LiCl). Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số trên gel agarose cho thấy RNA tổng số thu được có tính toàn vẹn, không bị đứt gẫy, đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.

6.2. Phân tích PCR xác nhận sự có mặt của gen SSIV

Sau khi tách chiết DNA, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để xác định sự có mặt của gen SSIV trong các dòng rễ tơ đã chuyển gen. Kết quả phân tích PCR sẽ chứng minh liệu quá trình chuyển gen có thành công hay không.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ chính của cây trồng, là hợp chất cao phân tử có hàm lƣợng lớn trong tự nhiên và có ý nghĩa quan trọng đối với đời sống nhân loại. Tinh bột là chất rắn không hoà tan, có cấu trúc dạng polymer đƣợc tạo ra các monomer là glucose. Tùy thuộc vào dạng liên kết của các phân tử glucose mà tạo thành dạng mạch thẳng amylose, hoặc dạng mạch nhánh amylopectin. Tinh bột đƣợc tích lũy chủ yếu ở cơ quan củ của thực vật: củ sắn, củ khoai tây, củ khoai lang, củ rong giềng … Tinh bột có vai trò quan trọng trong đời sống, đây là nguồn cung cấp cacbonhydrat hay năng lƣợng chính cho con ngƣời.

Ngoài ra, tinh bột còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc. Trung bình trên thế giới sử dụng tới 60 triệu tấn tinh bột hàng năm bao gồm bột mỳ, bột ngô, bột khoai tây, bột gạo, bột sắn, bột khoai lang. Hầu hết tinh bột đƣợc sử dụng cho các ngành công nghiệp chế biến nhƣ: sử dụng làm chất nền cho quá trình lên men của vi sinh vật (chủ yếu cho sản xuất mỳ chính), công nghiệp dệt vải sợi, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác. Hàm lƣợng tinh bột, kích thƣớc hạt tinh bột và hàm lƣợng amylose là những tính chất quan trọng của tinh bột có ảnh hƣởng nhiều đến các sản phẩm trong các ngành công nghiệp thực phẩm (mì sợi, bánh bì và bánh cookies) và phi thực phẩm (dệt, giấy, và dƣợc phẩm).

Các tính chất này quyết định độ nở của bột mì và tinh bột lúa mì, đó là các chỉ số quan trọng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm giàu tinh bột nhƣ mì sợi và mì ăn liền (McCormick et al., 1991; Konik et al., 1993; Sasaki & Matsuki 1998; Dennett et al., 2009; Salman et al. Đặc tính tinh bột chịu ảnh hƣởng của gen cũng nhƣ môi trƣờng tăng trƣởng (Rharrabti et al., 2001; Kindred et al., 2008; Weightman et al. Sự hiểu biến đổi của tính chất tinh bột đƣợc quyết định bởi hai yếu tố là giống và điều kiện môi trƣờng xung quanh. Cùng một điều kiện, tính chất tinh bột có thể thay đổi ở các giống khác nhau.

Tƣơng tự, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 11 Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng cùng một giống trồng ở môi trƣờng khác nhau tính chất tinh bột cũng thay đổi, từ đó sẽ gây khó khăn cho các nhà dinh dƣỡng và nhà chế biến thực phẩm trong việc dự đoán thành phần hóa học và quá trình chế biến. Các nghiên cứu về chọn lọc các giống cho hàm lƣợng tốt đã và đang đƣợc đẩy mạnh nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống cho chất lƣợng tinh bột tốt và ổn định. Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang còn ít và chƣa cụ thể.

Xuất phát từ thực tiễn đó, cùng với sự phát triển công nghệ và các nghiên cứu lâu năm của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhóm nghiên cứu tiến hành tập trung đánh giá cụ thể hoạt động của gen Starch Synthase IV. Đây là một trong 5 gen quyết định lớn đến sinh tổng hợp và cấu trúc của tinh bột. Để có đƣợc Starch Synthase IV cũng nhƣ đánh giá gen này chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột”. Mục đích nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase, đồng thời bƣớc đầu đánh giá hoạt động của gen này đến khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột ở các dòng rễ tơ khoai lang.

Mục tiêu cụ thể: - Phân lập và thiết kế vector mang gen SSIV phục vụ cho mục đich chuyển gen vào cây khoai lang. - Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes và tạo đƣợc các dòng rễ tơ. - Bƣớc đầu đánh giá khả năng hoạt động của gen trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập gen SSIV từ giống sắn KM140.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 12 Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng - Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D mang gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway. - Tạo chủng Agrobacterium rhizogenes mang cấu trúc vector pK7WG2D/SSIV. - Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen và đánh giá hoạt động của gen SSIV trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã. Ý nghĩa khoa học Làm cơ sở cho việc đánh giá hoạt động của các gen chức năng liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột ở các cây lƣơng thực tại Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 13 Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột 1. Giới thiệu về tinh bột Tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu thành từ hai chuỗi polymer (amylopectin và amylase) đƣợc cấu thành từ các tiểu phần là glucose.

Ở thực vật bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp và không quang hợp. Là carbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của thực vật. Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp đƣợc giữ lại trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ không đƣợc chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ phận khác. Dạng tinh bột tạm thời này sẽ đƣợc phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác của cây(McMaugh et al.

Tinh bột, công thức hóa học: (C6H10O5)n) là một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin, tỷ lệ phần trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thƣờng từ 20:80 đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau. Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6). Tinh bột đƣợc thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả, củ nhƣ: ngũ cốc.

Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dƣỡng của loài ngƣời cũng nhƣ nhiều loài động vật khác. Ngoài sử dụng làm thực phẩm ra, tinh bột còn đƣợc dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, rƣợu, băng bó xƣơng. Tinh bột đƣợc tách ra từ hạt nhƣ ngô và lúa mì, từ rễ và củ nhƣ sắn, khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong công nghiệp (Evans et al. Tinh bột lƣu trữ đƣợc tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của cây.

Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài ngƣời phần lớn là cơ quan lƣu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến…) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ than Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 14 Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng (khoai tây, khoai lang, khoai mỡ) và rễ củ (sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu. Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi. Tuy nhiên nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên.

Đặc biệt tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên do đặc tính dễ lên men. Cấu trúc phân tử amylopectin Cấu trúc phân tử amylose Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose 1. Cấu trúc của tinh bột Tinh bột đƣợc cấu tạo bởi 2 loại polysaccharid đƣợc gọi là amylose và amylopectin.

Amylose: phân tử amylose là một chuỗi hiện nay đƣợc biết đến hàng nghìn đơn vị β-D-glucose nối với nhau theo dây nối (1→ 4). Quan niệm trƣớc đây cho rằng chỉ có từ 200-400 đơn vị vì do quá trình chiết xuất và phân tích, mạch bị đứt. Phân tử amylose đa số là các chuỗi thẳng rất ít phân nhánh. Amylopectin: amylopectin có phân tử lƣợng lớn hơn khoảng 106-107 gồm 5000-50.000 đơn vị glucose và phân nhánh nhiều.

Các đơn vị α-D-glucose trong mạch cũng nối với nhau theo dây nối (1→ 4) còn chỗ phân nhánh thì theo dây nối (1→ 6). Để xét mức độ phân nhánh, ngƣời ta methyl hóa toàn bộ các nhóm OH của amylopectin rồi sau đó thủy phân và suy ra từ lƣợng 2, 3 dimethylglucose. Lƣợng 2, 3, 4, 6 tetramethylglucose ứng với những đơn vị tận cùng của mạch còn lƣợng 2, 3, 6 trimethylglucose ứng với những đơn vị glucose trong mạch (Evans et al. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 15 Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng Ngoài ra còn có thể xác định lƣợng glucose cuối mạch dựa vào tính khử của amylopectin không methyl hóa.

Chú ý rằng ở đây là glucose ở cuối mạch có OH bán acetal tự do. Mạch bên trong (mạch giữa 2 điểm phân nhánh) của amylopectin có khoảng 5-9 đơn vị glucose, những mạch bên ngoài có từ 10-18 đơn vị. Trong các loại tinh bột, trung bình tỉ lệ amylose là 25% còn amylopectin là 75%. Tuy nhiên ngƣời ta cũng tạo ra đƣợc những chủng có nhiều amylose, ví dụ ngô, có tinh bột chứa 75% amylose.

Amylose cho với thuốc thử iod màu xanh đậm có cực đại phổ hấp thu khoảng 660nm, còn amylopectin thì có màu tím đỏ và cực đại hấp thụ khoảng 540nm. Màu tạo thành giữa tinh bột và iod đƣợc giải thích do sự hấp phụ. Ngƣời ta cho rằng iod bị hấp phụ vào phía trong hình xoắn ốc. Ứng với một vòng xoắn ốc thì có 1 phân tử iod.

Những phân tử chƣa đủ 6 đơn vị glucose thì không phản ứng với iod(Mason-Gamer, Weil, and Kellogg 1998). SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT Khi thủy phân tinh bột bằng acid thì sản phẩm cuối cùng là glucose C6H12O6 (C6H10O5)n + nH2O -> (1+n) (C6H12O6) Sự thủy phân qua các chặng: dextrin, erythrodextrin, achrodextrin, maltose, glucose. Amylose dễ bị thủy phân hơn amylopectin vì dây nối (1-> 4) dễ bị cắt hơn là dây nối (1-> 6). Thủy phân bằng enzym Enzym amylase.

Có 2 loại chính: a-amylase và β-amylase. Enzym a phổ biến trong cây, nhiều nhất là các hạt ngũ cốc nẩy mầm, ngoài ra còn có trong nấm mốc, nƣớc bọt, dịch tụy. a-amylase chịu đƣợc nhiệt độ đến 70o, ở nhiệt độ này thì các enzym khác mất hoạt tính. Enzymβ-amylase có trong khoai lang, đậu nành và một số hạt ngũ cốc, chịu đƣợc nhiệt độ đến 50onhƣng chịu đƣợc môi trƣờng acid cao hơn so với enzym a (pH = 3,3).