Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học quercetin từ một số loài thực vật ở việt nam

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học quercetin từ một số loài thực vật ở việt nam, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Trần Thị Kiều Oanh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Quang Huy
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Tách Chiết Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Của Quercetin Từ Một Số Loài Thực Vật Ở Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về flavonoid
• 1.2. Giới thiệu chung về flavonoid
• 1.3. Sinh tổng hợp flavonoids
• 1.4. Các dạng khác nhau của flavonoid
• 1.5. Quercetin và một số tính chất đặc trưng
• 1.5.1. Định danh và đặc tính của quercetin
• 1.5.2. Đặc tính chống oxi hóa của Quercetin
• 1.6. Các phương pháp tách chiết hợp chất
• 1.6.1. Khái quát về phương pháp tách chiết
• 1.6.2. Các phương pháp tách chiết
• 1.7. Giới thiệu một số thực vật nghiên cứu
• 1.7.1. Cây đinh lăng
• 1.7.2. Rau đắng biển
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết bị thí nghiệm
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp định tính các nhóm chất của loài thực vật bằng phản ứng màu
• 2.4. Phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm thu dịch chiết dùng cho phân tích HPLC, TLC và hoạt tính sinh học
• 2.5. Phương pháp thủy phân mẫu dịch chiết trong HCL
• 2.6. Phương pháp sắc ký bản mỏng trong phân tích định tính dịch thủy phân
• 2.7. Xây dựng phương pháp phân tích HPLC
• 2.8. Phương pháp thử hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH
• 2.9. Phương pháp xác định tổng năng lực khử
• 2.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xác định các nhóm hợp chất thứ sinh có trong các mẫu
• 3.2. Kết quả phân tích TLC của các dịch chiết trước và sau khi thủy phân
• 3.3. Kết quả khảo sát DPPH và năng lực khử của các dịch chiết thực vật
• 3.4. Hoạt tính DPPH
• 3.5. Khảo sát khả năng lực khử của các mẫu thực vật
• 3.6. Khảo sát điều kiện phân tích HPLC trên mẫu dược liệu chuẩn hoa hòe
• 3.7. Đánh giá độ ổn định của phương pháp HPLC được thiết lập
• 3.8. Xác định quercetin trong dịch chiết mẫu thực vật trước và sau thủy phân
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tách chiết quercetin từ thực vật Việt Nam

Quercetin là một flavonoid quan trọng, có mặt trong nhiều loại thực vật ở Việt Nam. Việc tách chiết quercetin từ thực vật không chỉ giúp khai thác giá trị dinh dưỡng mà còn có ý nghĩa trong y học. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về quercetin, nguồn gốc và lợi ích của nó trong sức khỏe con người.

1.1. Quercetin và vai trò của nó trong y học

Quercetin được biết đến với nhiều lợi ích sức khỏe, bao gồm khả năng chống oxy hóa và chống viêm. Nghiên cứu cho thấy quercetin có thể giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính như tim mạch và tiểu đường.

1.2. Các loại thực vật chứa quercetin phổ biến ở Việt Nam

Nhiều loại thực vật Việt Nam như hoa hòe, hành tây và táo chứa hàm lượng quercetin cao. Việc nhận diện và khai thác các nguồn thực vật này là rất quan trọng cho nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.

II. Thách thức trong việc tách chiết quercetin từ thực vật

Mặc dù quercetin có nhiều lợi ích, việc tách chiết nó từ thực vật gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như độ tinh khiết, hiệu suất chiết xuất và chi phí là những yếu tố cần được xem xét.

2.1. Độ tinh khiết của quercetin trong quá trình chiết xuất

Độ tinh khiết của quercetin là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu. Việc sử dụng các phương pháp chiết xuất không phù hợp có thể dẫn đến sự nhiễm bẩn và giảm hiệu quả của quercetin.

2.2. Chi phí và hiệu suất trong tách chiết quercetin

Chi phí tách chiết quercetin từ thực vật có thể cao, đặc biệt khi sử dụng các phương pháp hiện đại. Cần tìm kiếm các phương pháp chiết xuất hiệu quả và tiết kiệm chi phí hơn.

III. Phương pháp tách chiết quercetin hiệu quả từ thực vật

Có nhiều phương pháp tách chiết quercetin từ thực vật, bao gồm chiết xuất bằng dung môi, siêu âm và thủy phân. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng.

3.1. Phương pháp chiết xuất bằng dung môi

Chiết xuất bằng dung môi là phương pháp truyền thống, sử dụng các dung môi như ethanol hoặc methanol để tách quercetin. Phương pháp này đơn giản nhưng có thể không đạt được độ tinh khiết cao.

3.2. Kỹ thuật chiết xuất siêu âm

Kỹ thuật chiết xuất siêu âm giúp tăng hiệu suất chiết xuất quercetin bằng cách sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào thực vật, từ đó giải phóng quercetin dễ dàng hơn.

3.3. Thủy phân để thu nhận quercetin

Thủy phân là phương pháp hiệu quả để chuyển đổi rutin thành quercetin tự do. Phương pháp này thường được áp dụng cho các loại thực vật chứa rutin cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quercetin trong y học

Quercetin có nhiều ứng dụng trong y học, từ việc điều trị bệnh đến việc sử dụng trong thực phẩm chức năng. Nghiên cứu cho thấy quercetin có thể giúp cải thiện sức khỏe tổng thể.

4.1. Quercetin trong điều trị bệnh

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng quercetin có thể giúp điều trị các bệnh như viêm, dị ứng và thậm chí là ung thư. Việc sử dụng quercetin trong điều trị cần được nghiên cứu thêm để xác định liều lượng và hiệu quả.

4.2. Quercetin trong thực phẩm chức năng

Quercetin được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm chức năng nhờ vào khả năng chống oxy hóa và hỗ trợ sức khỏe. Việc bổ sung quercetin vào chế độ ăn uống có thể mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu quercetin

Nghiên cứu về quercetin từ thực vật Việt Nam đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học và dinh dưỡng. Cần tiếp tục nghiên cứu để khai thác tối đa tiềm năng của quercetin.

5.1. Tương lai của nghiên cứu quercetin

Nghiên cứu về quercetin cần được mở rộng để khám phá thêm nhiều nguồn thực vật mới và phát triển các phương pháp chiết xuất hiệu quả hơn.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học của quercetin và các phương pháp chiết xuất mới để tối ưu hóa quy trình thu nhận quercetin từ thực vật.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong những năm gần đây, nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là flavonoid, đã trở thành lĩnh vực phát triển mạnh mẽ do tiềm năng ứng dụng trong y học và công nghiệp dược phẩm. Tại Việt Nam, với hệ động thực vật đa dạng, việc khai thác các hợp chất sinh học từ thực vật bản địa có ý nghĩa quan trọng. Quercetin, một flavonoid phổ biến, được biết đến với hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ và nhiều tác dụng sinh học khác như chống viêm, chống dị ứng, bảo vệ tim mạch và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính. Mức tiêu thụ quercetin trung bình hàng ngày khoảng 25-50 mg/người, chủ yếu được thu nhận từ các loại thực vật như hoa hòe, rau đắng biển, đinh lăng, bụp giấm và rau má.

Luận văn tập trung nghiên cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin từ một số loài thực vật ở Việt Nam, nhằm xác định đặc tính hóa lý và sinh học của dịch chiết methanol chứa quercetin, đồng thời xây dựng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích quercetin trong dịch chiết. Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu thu thập tại Hà Nội và một số tỉnh miền Bắc trong năm 2018, góp phần mở rộng hiểu biết về nguồn nguyên liệu quercetin tự nhiên và nâng cao hiệu quả khai thác, ứng dụng trong thực phẩm chức năng và dược phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết về flavonoid và sinh tổng hợp quercetin trong thực vật. Flavonoid là nhóm hợp chất polyphenol có cấu trúc vòng thơm đa dạng, được tổng hợp từ axit phenylalanin và malonyl-CoA qua con đường phenylpropanoid. Quercetin thuộc nhóm flavonol, có cấu trúc đặc trưng với năm nhóm hydroxyl, đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa. Các nhóm hydroxyl ở vòng B và vòng A là vị trí chính tham gia phản ứng loại bỏ gốc tự do, giúp quercetin trở thành chất chống oxy hóa hiệu quả.

Ngoài ra, luận văn áp dụng các mô hình phân tích sắc ký để tách chiết và định lượng quercetin, bao gồm sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Các phương pháp định tính nhóm hợp chất thứ sinh như glycoside, saponin, tanin, alkaloid và steroid cũng được sử dụng để đánh giá thành phần hóa học của dịch chiết.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu thực vật gồm hoa hòe, rau đắng biển, đinh lăng, bụp giấm và rau má, thu thập tại các chợ Hà Nội và tỉnh miền Bắc. Mẫu được xác định tên loài tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Quá trình nghiên cứu gồm các bước:

• Chiết xuất hỗ trợ siêu âm với dung môi methanol, thu dịch chiết dùng cho phân tích TLC, HPLC và đánh giá hoạt tính sinh học.
• Thủy phân dịch chiết trong dung dịch HCl để chuyển quercetin dạng liên hợp thành dạng tự do.
• Định tính các nhóm hợp chất bằng phản ứng màu đặc trưng.
• Phân tích định tính quercetin bằng sắc ký bản mỏng so sánh với chuẩn.
• Xây dựng và tối ưu hóa phương pháp HPLC với cột pha đảo ZORBAX SB-C18, pha động methanol, acetonitril và nước chứa 1% axit axetic, phát hiện ở bước sóng 370 nm.
• Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH và đo năng lực khử.
• Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng, đánh giá độ ổn định và hiệu quả phân tích của hệ thống sắc ký.

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 5 loài thực vật, mỗi loài được chiết xuất và phân tích nhiều lần để đảm bảo tính lặp lại và độ tin cậy của kết quả. Thời gian nghiên cứu kéo dài trong năm 2018.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xác định nhóm hợp chất thứ sinh: Tất cả các mẫu đều chứa flavonoid, trong đó hoa hòe, bụp giấm và rau đắng biển có hàm lượng flavonoid cao hơn, đồng thời rau đắng và đinh lăng có alkaloid, còn hoa hòe, bụp giấm và rau má có glycoside. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học của các loài thực vật này.

2. Phân tích TLC: Quercetin dạng tự do chỉ phát hiện được trong dịch chiết hoa hòe trước thủy phân, còn sau thủy phân, tất cả các mẫu đều cho kết quả dương tính với quercetin, chứng tỏ quercetin tồn tại chủ yếu dưới dạng liên hợp trong các mẫu thực vật khác.

3. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH: Ở nồng độ 0,1 mg/ml, dịch chiết hoa hòe có khả năng khử gốc tự do cao nhất với 75,3%, tiếp theo là rau đắng (74,32%) và bụp giấm (65,14%), trong khi rau má và đinh lăng có hoạt tính thấp hơn nhiều (7,75% và 15,66%). Hoạt tính DPPH của hoa hòe ổn định ở các nồng độ thử nghiệm, trong khi các mẫu khác tăng dần theo nồng độ.

4. Năng lực khử: Tương tự, năng lực khử của hoa hòe cao gấp 2,5-3 lần so với các mẫu còn lại ở nồng độ thấp nhất (0,1 mg/ml), khẳng định hoa hòe là nguồn quercetin có hoạt tính sinh học mạnh nhất trong nghiên cứu.

5. Phương pháp HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được thiết lập với cột ZORBAX SB-C18, pha động methanol:acetonitril:nước (15:20:65) chứa 1% axit axetic, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, phát hiện ở bước sóng 370 nm. Thể tích tiêm mẫu tối ưu là 20 µl. Thời gian lưu của quercetin khoảng 8 phút ở áp suất 35 bar, có thể giảm xuống khoảng 4 phút khi tăng áp suất lên 56-60 bar mà vẫn đảm bảo độ ổn định và độ phân giải cao (Rs > 1,5). Kết quả thêm chuẩn quercetin vào dịch chiết hoa hòe xác nhận đỉnh quercetin trong mẫu thử.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy quercetin tồn tại chủ yếu dưới dạng liên hợp trong các loài thực vật nghiên cứu, trừ hoa hòe có lượng quercetin tự do đáng kể. Điều này phù hợp với đặc điểm sinh học của quercetin trong thực vật, thường liên kết với đường tạo thành glycoside. Hoạt tính chống oxy hóa cao của dịch chiết hoa hòe phản ánh hàm lượng quercetin và flavonoid tổng hợp cao, đồng thời khẳng định tiềm năng ứng dụng làm nguyên liệu dược liệu và thực phẩm chức năng.

Phương pháp HPLC được thiết lập có độ nhạy và độ chính xác cao, phù hợp để phân tích quercetin trong dịch chiết thực vật, đồng thời rút ngắn thời gian phân tích nhờ điều chỉnh áp suất đầu cột. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về phân tích quercetin, đồng thời bổ sung dữ liệu về điều kiện phân tích phù hợp với mẫu thực vật Việt Nam.

Các kết quả hoạt tính sinh học và phân tích hóa học có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh khả năng DPPH và năng lực khử của các mẫu, bảng tổng hợp kết quả định tính nhóm hợp chất và sắc ký đồ HPLC minh họa sự phân tách quercetin và rutin.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình chiết xuất quercetin: Áp dụng phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm với dung môi methanol và thủy phân trong HCl để thu nhận quercetin dạng aglycon trực tiếp từ các loài thực vật, đặc biệt là hoa hòe, nhằm nâng cao hiệu quả thu nhận và giảm chi phí sản xuất. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng; chủ thể: các viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược liệu.

2. Ứng dụng phương pháp HPLC chuẩn hóa: Triển khai phương pháp HPLC đã thiết lập để kiểm soát chất lượng nguyên liệu và sản phẩm chứa quercetin, đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy trong phân tích. Thời gian: 3-6 tháng; chủ thể: phòng kiểm nghiệm, nhà sản xuất dược phẩm.

3. Nghiên cứu mở rộng hoạt tính sinh học: Tiếp tục đánh giá các hoạt tính sinh học khác của quercetin từ các loài thực vật như chống viêm, chống dị ứng, bảo vệ tim mạch để phát triển sản phẩm đa chức năng. Thời gian: 12-18 tháng; chủ thể: các trung tâm nghiên cứu y sinh.

4. Khuyến khích khai thác và bảo tồn nguồn nguyên liệu: Xây dựng mô hình trồng và khai thác bền vững các loài thực vật chứa quercetin có giá trị cao như hoa hòe, rau đắng biển, góp phần phát triển kinh tế địa phương và bảo vệ đa dạng sinh học. Thời gian: 1-3 năm; chủ thể: chính quyền địa phương, nông dân, doanh nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học thực nghiệm, dược học: Luận văn cung cấp dữ liệu chi tiết về thành phần hóa học, phương pháp chiết xuất và phân tích quercetin, hỗ trợ nghiên cứu chuyên sâu về flavonoid và các hợp chất tự nhiên.

2. Doanh nghiệp sản xuất dược liệu và thực phẩm chức năng: Thông tin về quy trình chiết xuất, chuẩn hóa và đánh giá hoạt tính sinh học giúp nâng cao chất lượng sản phẩm, phát triển nguyên liệu mới có giá trị gia tăng.

3. Cơ quan kiểm nghiệm và quản lý chất lượng: Phương pháp HPLC được thiết lập có thể áp dụng trong kiểm soát chất lượng nguyên liệu và sản phẩm chứa quercetin, đảm bảo an toàn và hiệu quả sử dụng.

4. Chính quyền và tổ chức phát triển nông nghiệp bền vững: Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc khai thác, bảo tồn và phát triển nguồn nguyên liệu thực vật bản địa, góp phần phát triển kinh tế địa phương và bảo vệ môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Quercetin là gì và có vai trò gì trong thực vật?
   Quercetin là một flavonoid thuộc nhóm flavonol, có cấu trúc đặc trưng với năm nhóm hydroxyl. Nó đóng vai trò chống oxy hóa, bảo vệ thực vật khỏi tác động của tia UV và các tác nhân gây hại, đồng thời tham gia vào quá trình chuyển hóa thứ sinh.

2. Tại sao cần thủy phân dịch chiết để phân tích quercetin?
   Quercetin trong thực vật thường tồn tại dưới dạng liên hợp (glycoside). Thủy phân giúp chuyển quercetin dạng liên hợp thành dạng tự do (aglycon), dễ dàng phân tích và định lượng chính xác bằng các phương pháp sắc ký.

3. Phương pháp HPLC được sử dụng có ưu điểm gì?
   Phương pháp HPLC với cột pha đảo ZORBAX SB-C18 và pha động methanol:acetonitril:nước chứa axit axetic cho phép phân tách hiệu quả quercetin và các hợp chất liên quan, có độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn và độ lặp lại tốt.

4. Hoạt tính chống oxy hóa của quercetin được đánh giá như thế nào?
   Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá bằng phương pháp DPPH và đo năng lực khử, dựa trên khả năng quercetin làm mất màu dung dịch DPPH và khử ion Fe3+ thành Fe2+, phản ánh khả năng loại bỏ gốc tự do và bảo vệ tế bào.

5. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu này là gì?
   Nghiên cứu cung cấp quy trình chiết xuất và phân tích quercetin từ thực vật bản địa, hỗ trợ phát triển nguyên liệu dược liệu và thực phẩm chức năng, đồng thời góp phần bảo tồn và khai thác bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên Việt Nam.

Kết luận

• Đã xác định được quercetin tồn tại chủ yếu dưới dạng liên hợp trong các loài thực vật nghiên cứu, với hoa hòe chứa lượng quercetin tự do đáng kể.
• Phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm kết hợp thủy phân trong HCl hiệu quả trong việc thu nhận quercetin dạng aglycon.
• Phương pháp HPLC được thiết lập với điều kiện tối ưu cho phân tích quercetin có độ nhạy cao, độ phân giải tốt và thời gian phân tích ngắn.
• Dịch chiết hoa hòe có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong các mẫu nghiên cứu, phù hợp làm nguyên liệu dược liệu và thực phẩm chức năng.
• Khuyến nghị triển khai ứng dụng quy trình chiết xuất và phân tích trong sản xuất, đồng thời mở rộng nghiên cứu hoạt tính sinh học và phát triển nguồn nguyên liệu bền vững.

Next steps: Tiếp tục nghiên cứu mở rộng hoạt tính sinh học, hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô lớn và xây dựng mô hình trồng trọt bền vững.

Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực dược liệu nên áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm chất lượng cao, góp phần nâng cao giá trị nguồn nguyên liệu bản địa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu những hợp chất tự nhiên (bao gồm tìm kiếm, tách chiết, đ nh gi hoạt t nh) đang ph t triển mạnh mẽ, đặc biệt ở Việt Nam nơi có hệ động thực vật đa dạng, phong phú và có nhiều loại cây cỏ tác dụng sinh dƣợc mạnh. Hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, đối tƣợng trong các hợp chất tự nhiên thực vật đƣợc quan tâm nhiều tập trung ở nhóm hợp chất flavonoid vì số lƣợng các chất nhiều, tác dụng của các hợp chất không chỉ là chữa bệnh mà còn phòng bệnh. Quercetin là một flavonoid thực vật có mặt trong nhiều loài, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, ngay cả ở nồng độ thấp. Trong tự nhiên, quercetin tồn tại ở dạng tự do (dạng aglycon) hoặc dẫn xuất cho một số flavonoid kh c, thƣờng gặp là rutin.

Hiện nay, quercetin đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực kh c nhau nhƣ thực phẩm chức năng, thuốc điều trị. Quercetin tồn tại với h m lƣợng lớn trong thực vật do cơ chế th ch nghi, đƣợc hình thành trong quá trình chuyển hóa thứ sinh trong cơ thể thực vật. Quercetin tồn tại với h m lƣợng cao trong các loại chè, táo, hành tây. Quercetin có mặt trong nhiều loại thực vật khác nhau, nhƣng trong c ng nghiệp dƣợc phẩm chủ yếu đƣợc thu nhận nhờ quá trình thủy phân từ rutin (quercetin-3-O-rutinosid).

Tại Việt Nam và một số nƣớc châu Á nhƣ Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn độ quercetin đƣợc thu nhận chủ yếu từ rutin của hoa cây hòe (Sophora japonica L). Tuy nhiên,các loại thực vật kh c cũng đƣợc biết đến có nhiều flavonoid nói chung và quercetin nói riêng tồn tại ở nhiều dạng liên hợp, có mặt trong một số bài thuốc dân gian lại chƣa đƣợc đề cập nghiên cứu. Khi thu nhận quercetin aglycol (quercetin tự do) ở nhóm thực vật này, nếu tiến hành theo cách tinh chế từng dạng quercetin liên hợp v sau đó thủy phân các dạng liên hợp đã tinh chế đó, theo cách nhƣ thu nhận quercetin tự do từ rutin thì sẽ gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu điều kiện chiết xuất, thủy phân để thu nhận quercetinanglycol trực tiếp từ thực vật, kh ng qua giai đoạn trung gian nhờ vào dạng quercetin liênhợp.

Để giải quyết đƣợc vấn đề này thì cần phải nghiên 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] cứu c c phƣơng ph p đ nh giá nhằm x c định quercetin ở dạng tự do và liên hợp, cũng nhƣ độ ổn định của quercetin về hóa lý và sinh học trong quá trình thu nhận. Để góp phần đ p ứng nhu cầu thực tế đó, chúng t i thực hiện đề t i “Nghiên cứu tách chiết v đ nh gi hoạt tính sinh học của quercetin từ một số loài thực vật ở Việt Nam”với mục tiêu: - X c địnhmột số đặc tính hóa lý và sinh học của dịch chiết methanol chứa quercetin từ một số loài thực vật tại Việt Nam. - Xác định các thông số sắc ký phù hợp cho phân tách quercetin trong dịch methanol từ hoa hòe trên cột sắc ký và hệ thống HPLC. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về flavonoid 1.

Giới thiệu chung về flavonoid Hợp chất flavonoid là nhóm các sắc tố m u đỏ, xanh da trời và tím ở thực vật. Từ mô tả đầu tiên về các hiệu ứng axit v bazơ trên c c sắc tố thực vật của Robert Boyle năm 1664 đến sự hình thành các gen cấu trúc v điều tiết hình thành các hợp chất flavonoid vào cuối thế kỷ 20, hiện nay đã thu thập đƣợc rất nhiều thông tin về cấu trúc, hoạt động hóa học và sinh tổng hợp những hợp chất này. Flavonoid là nhóm các phân tử có cấu trúc hợp chất v ng thơm, đa dạng và có nguồn gốc từ axit amin Phenilalanin và malonyl-coenzyme A (CoA; thông qua con đƣờng chuyển hóa axit béo). Các hợp chất flavomoid bao gồm 6 phân nhóm chính đƣợc tìm thấy trong hầu hết các thực vật bậc cao.

Các nhóm này gồm các chalcones, flavon, flavonol, flavandiols, anthocyanin, và tannin (hoặc pro anthocyanidins); nhóm thứ bảy là aurones khá hiếm gặp trong tự nhiên [7,19]. Hơn 6000 loại flavonoid kh c nhau đã đƣợc x c định và số lƣợng phát hiện mới hiện vẫn đang tăng lên. C c flavonoid kh c nhau có chức năng sinh học đa dạng, bao gồm bảo vệ chống lại tia cực tím (UV) và tác nhân gây bệnh thực vật, tín hiệu trong quá trình sần, vận chuyển auxin, cũng nhƣ m u sắc của hoa nhƣ một tín hiệu thu hút côn trùng thụ phấn [43,60,65 ]. Hợp chất Flavonoidgiúp cho việc hiển thị màu sắc mùa thu (chuyển màu lá) ở nhiều loài thực vật, có thể bảo vệ tế bào lá khỏi tổn thƣơng, nâng cao hiệu quả thu hồi chất dinh dƣỡng trong quá trình lão hóa.

Flavonol có lẽ là chất flavonoid quan trọng nhất tham gia vào phản ứng stress; chúng là những flavonoid có hoạt t nh đƣợc biết đến từ trƣớc, phổ biến và có tác dụng tới hoạt động sinh lý mạnh [59,65,66]. Sinh tổng hợp flavonoids C c đột biến ảnh hƣởng đến tổng hợp flavonoid đã đƣợc phân lập trong một loạt các loài thực vật. Nhiều nỗ lực đã đƣợc thực hiện trong việc làm sáng tỏ các đƣờng sinh tổng hợp của flavonoid từ góc độ di truyền. Ngô (Zea mays), snapdragon (Antirrhinum majus), và cây dã yên thảo (Petunia hybrida) đƣợc xây dựng thành các m hình đầu tiên trong hệ thống này, dẫn đến sự cô lập của nhiều gen flavonoid cấu 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] trúc v điều tiết [60,65].

Gần đây, cây Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) đƣợc nghiên cứu và phân tích sự điều chỉnh và việc chuyển hóa của con đƣờng flavonoid ở thực vật. Việc sử dụng Arabidopsis để nghiên cứu sinh tổng hợp flavonoid có ƣu điểm l c c gen sao chép đơn mã hóa tất cả các enzyme chuyển hóa flavonoid trung tâm, ngoại trừ flavonol synthase (FLS), đƣợc mã hóa bởi 6 gen, nhƣng chỉ có 2 gen (FLS1 và FLS3) có hoạt động đã đƣợc chứng minh locus di truyền cho cả hai gen cấu trúc và điều hòa đƣợc x c định chủ yếu dựa trên đột biến xóa bỏ hoặc giảm sắc tố hạt; do đó loci đƣợc đặt tên là testa trong suốt hoặc đột biến. Hầu hết các gen cấu trúc, cũng nhƣ một số gen điều h a có tƣơng quan với locus đột biến cụ thể trong cây Arabidopsis. Loài này dƣờng nhƣ kh ng sử dụng flavonoid theo c ch tƣơng tự nhƣ một số loài khác tuy nhiên, những đột biến này có ích trong việc x c định vai trò của các hợpFlavonoids Falcone Ferreyra et al.

chất in plants n y trong c c qu trình nhƣ bảo vệ tia cực tím và vận chuyển auxin [14,63,65]. A FLAVONOLS 4-coumaroyl CoA + 3 malonyl CoA QUERCETIN MYB11/12/111 CHS FLS MYB11/12/111 FLS MYB11/12/111 MYB11/12/111 F3H naringenin chalcone naringenin dihydrokaempferol MYB11/12/111 MYB11/12/111 CHI PAP1/PAP2 PAP1/PAP2 DFR TT8/GL3/EGL3 TT8/GL3/EGL3 LAR TTG1 TTG1 leucopelargonin TT2/TT8/TTG1 PAP1/PAP2 ANS TT8/GL3/EGL3 PROANTHOCYANIDINS TTG1 pelargonin TT2/TT8/TTG1 PAP1/PAP2 UFGT TT8/GL3/EGL3 TTG1 PELARGONIN CYANIDIN ANTHOCYANINS 3-GLUCOSIDE 3-GLUCOSIDE 166. Con đƣờng sinh tổng hợp Flavonoids và Quercetin ở A. thaliana [65] PHLOBAPHENES B Chú thích: Enzymes và các chất trung gian đƣợc biểu diễn bằng chữ m u đen, c c 4-coumaroyl CoA chất điều hoà có màu.

Sàn phẩm + 3 malonyl CoA cuối flavan-4-ol cùng là chữ in hoa. CHS, Chalcone synthase; CHI, P1 P1 chalcone isomerase; C1/PL F3H Flavanone CHS P1 3 FNR hydroxylase; C1/PL P1 F3'H, flavonoid-3'-hydroxylase; DFR, R/B C1/PL R/B C1/PL dihydroflavonol 4-reductase; R/B FNR,R/Bflavanone-4-reductase; ANS, anthocyanidin synthase, naringenin chalcone naringenin eriodictyol C1/PL P1 F3’H UFGT, UDP-glucose flavonoid 3-OCHI glycosyltransferase, F3H FLS,F3H flavonol R/B synthase C1/PL FLS F3’H R/B C c KAEMPFEROL flavonoid đƣợc P1 QUERCETIN biến tổng hợp qua đƣờng phenylpropanoid, FLS C1/PL P1 FLAVONOL C1/PL C1/PL FLAVONOL R/B phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA, cuối cùng đi v o con đƣờng sinh tổng hợp R/B R/B flavonoid (Hình 1. Enzyme đầu tiên đặc hiệu cho con đƣờng C1/PL flavonoid là chalcone R/B C1/PL R/B 4 CYANIDIN ANTHOCYANINS 3-GLUCOSIDE TIEU LUAN MOI download : [e-mail] FIGURE 2 | Regulation of the flavonoid pathw ay in Arabidopsisthaliana (A) isomerase; F3H, flavanone 3-hydroxylase; F3′ H, flavonoid-3′ -hydroxylase; DFR, synthase xúc tác cho phản ứng tạo ra các chalcone mà từ đó tất cả c c flavonoid đƣợc tổng hợp [65]. Con đƣờng trung tâm cho sinh tổng hợp flavonoid đƣợc bảo tồn trong thực vật, tùy thuộc vào loài một nhóm c c enzym nhƣ isomerases, reductases, hydroxy-lases, và một số dioxygenases phụ thuộc Fe2+.

Hợp chất 2-oxyglutarate phụ thuộc vào bộ xƣơng flavonoid cơ bản, dẫn đến các phân lớp flavonoid khác nhau. Cuối cùng, tranferases thay đổi xƣơng sống flavonoid với đƣờng, nhóm methyl hoặc acyl moieties, điều chỉnh hoạt động sinh lý của flavonoid kết quả bằng c ch thay đổi độ hòa tan, phản ứng v tƣơng t c với các mục tiêu tế bào [67].3 Các dạng khác nhau của flavonoid Quercetin là một flavonoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Tên n y đã đƣợc sử dụng từ năm 1857 v có nguồn gốc từ quercetum (rừng sồi), sau là Quercus. Quercetin là chất ức chế vận chuyển auxin có tự nhiên[49].

Quercetin là một trong những chất flavonoid đƣợc sử dụng nhiều[16,17] với mức tiêu thụ trung bình hàng ngày khoảng 25-50 miligam/ngƣời. Cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm flavonols (quercetin, kaempferol, myricetin và isorhamnetin) [40] Hình 1. Cấu trúc hóa học của nhóm flavones (luteolin, apigenin) [40] 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Cấu trúc hóa học nhóm flavanones (eridictyol, hesperetin, naringenin) [40] Hình 1.

Cấu trúc nhóm flavan-3-ols (catechins và epicatechins) [40] Hình 1. Cấu trúc hóa học nhóm theaflavins [40] 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Cấu trúc hóa học nhóm anthocyanidins [40] Các nguồn khác của quercetin có thể l nho, dâu đen, v dầu liu. Đồ uống nhƣ tr xanh v rƣợu vang đỏ (4-16mg/l) cũng chứa một lƣợng đ ng kể các quercetin.

Lợi ích chính của quercetin là loại flavonoid này có chất chống oxy hóa mạnh, hỗ trợ chống lại các tế bào gốc tự do [21,35]. Quercetin và một số tính chất đặc trƣn Quercetin, một đại diện lớn của lớp flavonol, chất đã trở th nh đối tƣợng nghiên cứu nhận đƣợc sự chú ý đ ng kể. Quercetin và dẫn xuất của nó trong thực phẩm chứa liên kết đƣờng, đại diện cho 60-75% lƣợng flavonoid trong rau củ, quả [10,31]. Quercetin là một trong những chất có màu vàng tự nhiên.

Nó đƣợc phát hiện đầu tiên ở dạng aglycon của quercetrin có trong vỏ cây Querceus tinctorial khi thuỷ phân trong m i trƣờng axit thu đƣợc quercetin và một phân tử đƣờng rhamonose: C21H20O11 + H2O (thuỷ phân trong HCl)  C15H10O7 + CH3(CHOH)4CHO 1. Định d nh và đặc tính của quercetin Hình 1. Cấu trúc hóa học của quercetin[47] Một phân tử quercetin (hình 1.8) có cấu trúc của năm nhóm hydroxyl, số lƣợng c c nhóm n y đóng vai tr quan trọng trong việc x c định hoạt động sinh học của các dẫn xuất quercetin.