MỞ ĐẦU Cephalotaxaceae là một họ các loài cây lá kim, với 3 chi và khoảng 20 loài. Cephalotaxaceae đƣợc phân bố nhiều ở các nƣớc Đông Á, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan ,. Theo Sách đ Việt Nam, loài Cephalotaxaceae thƣờng đƣợc tìm thấy ở Việt Nam là các cây lâu năm, phân bố chủ yếu ở khu vực miền núi của tỉnh Hà Tây (Ba Vì), Thanh Hóa (Lũng Văn), …. Các nghiên cứu trên toàn thế giới đã chỉ ra một số alkaloid có hoạt tính chống ung thƣ đƣợc tìm thấy trong các cây thuộc họ này, Cephalotaxus harringtonia, Cephalotaxus hainanensis, Cephalotaxus wilsoniana.
Cephalotaxine là chất đứng đầu của nhóm alkaloid chiết xuất từ Cephalotaxus, đƣợc phân lập từ Cephalotaxus harringtonia. Nhóm này đƣợc quan tâm nhờ có hoạt tính sinh học đa dạng chống lại bệnh bạch cầu, kháng u và HIV. Các alkaloid tách từ cây Cephalotaxus, nhƣ là homoharringtonine và isohomo-harringtonine, đã đƣợc chứng minh rằng có tính chất ức chế sự khởi đầu của quá trình tổng hợp protein. Bên cạnh đó, homoharringtonine đã đƣợc nghiên cứu trong điều trị bệnh sốt rét và trong nhãn khoa.
Một số quy trình tổng hợp các hợp chất này đã đƣợc đƣa ra, tuy nhiên, chúng có nhƣợc điểm là bao gồm nhiều bƣớc và hiệu suất thấp. Do đó, việc tách chiết và phân lập các hoạt chất nói trên từ nguyên liệu thực vật và bán tổng hợp có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng. Nghiên cứu này nhằm mục đích để tách chiết, phân lập cephalotaxine và homoharingtonine từ cây Cephalotaxus harringtonia bằng cách sử dụng kết hợp các phƣơng pháp sắc ký cột và phƣơng pháp phân tích hiện đại HPLC. Thứ nhất, nghiên cứu để đƣa ra đƣợc quy trình tách chiết alkaloid thô và làm giàu các chất có hoạt tính sinh học từ cây Cephalotaxus harringtonia.
Thứ hai, nghiên cứu để đƣa ra chƣơng trình HPLC để tách hiệu quả homoharringtonine và cephalotaxine trong mẫu thực vật. Thứ ba, nghiên cứu để định lƣợng đƣợc hàm lƣợng của các alkaloid nói trên trong thành phần của cây Cephalotaxus harringtonia. 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn đƣợc hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hóa học hữu cơ III, Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và khoa Công nghệ hóa học, Trƣờng Đại học Osaka Prefecture Nhật Bản). Công trình đƣợc sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thƣ Việt – Pháp, mã số 42/2011/HĐ-NĐT của Bộ KH&CN.
2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.Khái quát về chi Cephalotaxus Cephalotaxus, còn gọi là đỉnh tùng, là loại thực vật lá kim thƣờng mọc đơn lẻ hoặc mọc thành bụi, thuộc họ Cephalotaxaceae (đỉnh tùng). Trƣớc đây họ cây này đƣợc liệt vào họ Thanh tùng, hay còn gọi là họ Thông đ (Taxaceae). Chi Cephalotaxus thƣờng đƣợc coi là đại diện duy nhất của họ thực vật Cephalotaxaceae, đƣợc cấu thành từ 6-12 loài [26]. Một trong số đó, Cephalotaxus harringtonia (trƣớc đây đƣợc gọi là C.
Chi Cephalotaxus đƣợc phân bố ở vùng Đông Á hoặc Nam Á: Trung Quốc, bao gồm cả Đài Loan và đảo Hải Nam, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam. Một số loài đã đƣợc coi là có nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là ở Trung Quốc, do tác động quá mức của con ngƣời và thời gian trƣởng thành của hạt giống dài, hoặc tỷ lệ tái sinh thấp trong tự nhiên [25]. Cephalotaxus thƣờng đƣợc tìm thấy trên các vùng đất giàu mùn ở các khu rừng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới ấm ƣớt. Chúng chủ yếu phân bố ở các vùng núi thấp, hoặc trung bình, nhƣng có một vài loại biến thể đƣợc tìm thấy ở vùng núi cao và trên những vách đá vôi.
Toàn bộ các loài thuộc chi Cephalotaxus phân bố rải rác kéo dài từ vùng nhiệt đới tới vùng khí hậu ôn đới, và sức chịu lạnh của từng loài tƣơng ứng với xuất xứ của chúng. Các loài Cephalotaxus thƣờng có đặc điểm hình thái chung dễ nhận thấy. Chúng là các loại cây bụi hay cây thân gỗ nh có nhiều cành. Lá của chúng thƣờng sắp xếp theo vòng xoắn, thƣờng vặn xoắn lại tại gân để xuất hiện theo kiểu hai hàng lá.
Lá có hình dáng từ thẳng tới mũi mác, có màu xanh lục nhạt, có phấn trắng ở mặt dƣới. Các loài trong họ hoặc là đơn tính cùng gốc hoặc là đơn tính cận khác gốc hay đơn tính khác gốc. Các nón đực dài khoảng 4–25 mm và phát tán phấn vào đầu mùa xuân. Các nón cái bị thoái hóa, với 1 hoặc một số lá noãn, và một hạt trên một lá noãn.
Khi hạt phát triển đầy đủ thì lá noãn cũng phát triển thành một dạng 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com v hạt nhiều xơ, bao phủ toàn bộ hạt. V hạt phát triển đầy đủ thuộc loại m ng thịt có màu lục, tía hay đ , mềm và có chứa nhựa. Mỗi lá noãn nằm rời rạc, vì thế nón cái phát triển thành một cọng ngắn với một hay vài hạt trông tựa nhƣ một loại quả mọng. Chúng có thể bị chim hay một số loài động vật khác ăn để sau đó phát tán phần hạt cứng không bị phân hủy, nhƣng cơ chế phát tán hạt hiện nay vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng [26].
Các cá thể Cephalotaxus ngày càng khan hiếm và đang bị đe dọa tuyệt chủng trong khu vực phân bố của chúng [14].Thời gian trƣởng thành hạt giống dài, kết hợp với hình thức sinh sản đơn tính khác gốc và sự phân bố tự nhiên thƣa thớt trong một vùng địa lý, dẫn tới tần số tái sinh thực tế thấp của chi này trong tự nhiên. Ngoài ra sự thoái hóa của các loài Cephalotaxus còn do các hoạt động của con ngƣời gây ra. Các cây thuộc họ này đƣợc khai thác lấy gỗ, củi hoặc sử dụng nhƣ các phƣơng thuốc truyền thống. Đôi khi các nón cái đƣợc khai thác để lấy dầu.
Phân bố của các loài Cephalotaxus ở Việt Nam Ở Việt Nam loài Cephalotaxus đƣợc biết chắc chắn có ở Hà Tây (Ba Vì), Thanh Hóa (Lũng văn), Quảng Trị (giữa Hòn Rao và A Dua), Thừa Thiên Huế, Kontum (Đắc Glây, Đắc Tô: Ngọc Pan, Sa Thầy), Gia Lai, Lâm Đồng (Di Linh: núi Braian)… Các cá thể đƣợc tìm thấy là cây gỗ mọc đứng, tƣơng đối chịu bóng râm với thân thẳng và tán hẹp, cao tới 20 ‐30 m và đƣờng kính (ngang ngực) 50‐110 cm. Cây mọc rải rác thành từng đám nh ở vùng núi đất, đất phong hoá từ silicát và trên cả núi đá vôi, ở độ cao 500‐2000 m so với mực nƣớc biển, trong các rừng nguyên sinh rậm, thƣờng có nhiều cây lá rộng. Khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình năm 13‐210C, lƣợng mƣa trên 1500 mm/năm). Họ Cephalotaxus thƣờng mọc cùng với Kim giao núi đất (Nageia wallichiana), Thông đỏ nam (Taxus wallichiana), Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) và Thông nàng núi đá silicát (Dacrycarpus imbricatus), chủ yếu ở miền Trung và Nam Việt Nam.
Cephlotaxus mọc với Thiết sam giả (Pseudotsuga sinensis), Thông Pà Cò (Pinus kwangtungensis), Kim giao núi đá (Nageia fleuryi), Thông tre lá ngắn (Podocarpus pilgeri), Pơ mu (Fokienia hodginsii), Thông đỏ bắc 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.1: Cây Cephalotaxus hainanensis tại xã Nam Động, huyện Quan Hóa, tỉnh Thanh Hóa [1] Họ Cephalotaxus đƣợc ghi nhận với các quần thể nh ở một loạt các Vƣờn Quốc Gia (VQG) và khu Bảo tồn thiên nhiên (BTTN) nhƣ VQG Ba Vì, VQG Bạch Mã, khu BTTN Pù Luông, khu BTTN Pù Huống, VQG Chƣ Mom Ray và phần lớn các khu bảo tồn quanh núi Bì Đúp ở Lâm Đồng. Thông tin từ VQG Tam Đảo cần đƣợc kiểm tra. Các quần thể lớn nhất ở Lâm Đồng (khoảng 100 cây) gặp trên các sƣờn của Núi Voi ‐ huyện Đức Trọng, là khu vực đƣợc xếp vào rừng phòng hộ đầu nguồn. Năm 1999, tại Cao nguyên đá Đồng Văn, TS.
Lê Trần Chấn đã tìm thấy duy nhất một cá thể cây Họ Cephalotaxus tại xã Thài Phìn Tủng, huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang [5]. 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.2: Cây Đỉnh tùng Cephalotaxus manniinon ở khu vực Pha Luông [7] Cuối tháng 11 năm 2011, hạt Kiểm lâm huyện Quan Hóa (tỉnh Thanh Hóa) mới phát hiện 4 loài cây hạt trần quý hiếm gồm Thông Pà cò, Cephalotaxus, thông Tre lá ngắn và Dẻ tùng sọc trắng. Các loài cây hạt trần này phân bố tập trung trên diện tích gần 500 ha ở địa bàn xã Nam Động (huyện Quan Hóa, tỉnh Thanh Hóa), trong đó họ Cephalotaxus hainanensis có 260 cây [3]. Giữa tháng 12/2012, nhóm các nhà nghiên cứu thuộc Trung tâm Con ngƣời và Thiên nhiên (Pan Nature) phát hiện một khu vực rừng dƣới chân đỉnh núi Pha Luông thuộc địa phận Khu Bảo tồn Thiên nhiên Xuân Nha (Sơn La) có các loài cây lá kim quí hiếm, trong đó gồm Cephalotaxus [6].
Quần thể Cephalotaxus (mannii Hook.) tại Pha Luông ƣớc tính có khoảng 10 cá thể trƣởng thành, một số cây cao 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com tới 25m, đƣờng kính ngang ngực tới 80 cm. Một số cây mọc trên vách đá thì kém phát triển hơn, thân chính bị gãy, mọc lên nhiều nhánh nh. Ngoài các cây trƣởng thành, nhóm nghiên cứu cũng bắt gặp nhiều cây Đỉnh tùng tái sinh tốt ở những nơi ẩm ƣớt, chúng mọc trên lớp mùn đƣợc tạo bởi xác thực vật của rừng. Thân cây Đỉnh tùng có v màu nâu đ , bong rời thành các lớp m ng.
Lá có mặt trên màu xanh đậm, mặt dƣới có các dải lỗ khí khổng màu trắng xanh [6]. Qua phân tích ở trên cho thấy, Đỉnh tùng là loài cây lá kim quý hiếm, hiện đƣợc đánh giá ở mức Sẽ nguy cấp (VU) trong Sách Đ Việt Nam (2007) cũng nhƣ trong Danh lục đ của IUCN. Loài này cũng đƣợc liệt kê trong danh mục IIA của Nghị định 32 của Chính phủ về các loài Thực vật rừng, động vật rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thƣơng mại. Khái quát về loài Cephalotaxus harringtonia Hình 1.3: Cephalotaxus harringtonia Cephalotaxus harringtonia (C.
harringtonia), hay còn đƣợc gọi là Inugaya trong tiếng Nhật, là một loài thực vật điển hình thuộc chi Cephalotaxus. Đây là loài Đỉnh tùng đầu tiên đƣợc thu thập và đƣợc trồng lâu nhất ở các nƣớc phƣơng Tây. Loài này phổ biến ở Nhật Bản từ vùng bắc Kyushu tới Hokkaido và cũng đƣợc tìm thấy trong các khu vực đông bắc Trung Quốc và Hàn Quốc. Ở những nơi ấm áp, 7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com chúng thƣờng đƣợc tìm thấy ở dạng các cây nh , trong khi đó tại khu vực lạnh hơn chúng thƣờng là loại cây bụi tròn, dáng thấp đến trung bình.
Cũng vì đặc điểm phát triển phụ thuộc vào khí hậu đó mà chúng thƣờng đƣợc trồng ở châu Âu và Bắc Mỹ.