Nghiên cứu phân lập Saponin từ hải sâm Cercodemas anceps kháng ung thư

Luận văn nghiên cứu phân lập hợp chất saponin từ hải sâm Cercodemas anceps, đánh giá hoạt tính và tiềm năng kháng các dòng tế bào ung thư.

• Tác giả: Nguyễn Khắc Sinh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cường
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập một số hợp chất Saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Saponin từ hải sâm và hoạt tính kháng ung thư

Saponin từ hải sâm là các hợp chất thiên nhiên có tiềm năng chữa trị cao trong lĩnh vực oncology. Hải sâm Cercodemas anceps chứa nhiều saponin có hoạt tính kháng ung thư được chứng minh qua các nghiên cứu khoa học. Những hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế sinh học khác nhau. Nghiên cứu từ Đại học Quốc gia Hà Nội đã thành công trong việc phân lập các hợp chất saponin từ hải sâm và đánh giá hiệu quả chúng. Các saponin này thể hiện hoạt tính mạnh mẽ đối với nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, đặc biệt là ung thư mô liên kết Sarcoma-180, ung thư vú MCF7 và ung thư biểu mô ruột kết HCT116.

1.1. Nguồn gốc và đặc điểm của hải sâm Cercodemas anceps

Hải sâm Cercodemas anceps là loài hải sâm quý hiếm được tìm thấy ở vùng biển Đông bắc Việt Nam. Loài này chứa hàm lượng saponin cao với đa dạng cấu trúc hóa học. Những hợp chất saponin tự nhiên trong hải sâm được tích lũy qua quá trình sống trong môi trường biển khắc nghiệt. Các saponin này được cơ thể hải sâm sử dụng để tự bảo vệ và chống lại tác động của kỵ thú. Chính vì thế, chúng sở hữu những tính chất sinh học độc đáo và mạnh mẽ.

1.2. Cơ chế kháng ung thư của saponin

Saponin kháng ung thư hoạt động thông qua nhiều cơ chế sinh học phức tạp. Chúng có khả năng ức chế tế bào ung thư bằng cách gây apoptosis - quá trình tự chết tế bào. Các saponin cũng làm gián đoạn chu kỳ tế bào, ngăn chặn sự phân chia không kiểm soát của tế bào ung thư. Ngoài ra, hoạt tính kháng ung thư của saponin còn liên quan đến khả năng ức chế angiogenesis - quá trình hình thành mạch máu nuôi dưỡng khối u.

II. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc saponin

Việc phân lập hợp chất saponin từ hải sâm yêu cầu các kỹ thuật hiện đại và chuyên sâu. Các nhà khoa học sử dụng sắc kí lớp mỏng (TLC) để phân tách ban đầu các hợp chất saponin khác nhau. Sau đó, các phương pháp sắc kí chất lỏng hiệu năng cao (HPLC) được áp dụng để tinh khiết hóa các saponin đã phân tách. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là công cụ quan trọng để xác định cấu trúc hóa học của các saponin phân lập. Kỹ thuật này cho phép các nhà nghiên cứu hiểu rõ về vị trí của các nhóm chức năng trên phân tử saponin, từ đó liên hệ được giữa cấu trúc và hoạt tính kháng ung thư.

2.1. Kỹ thuật sắc kí phân tách saponin

Sắc kí lớp mỏng (TLC) là phương pháp đầu tiên để phân tách các hợp chất saponin theo sắc độ cực khác nhau. Phương pháp này nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và cho phép đánh giá sơ bộ về số lượng saponin có trong mẫu. Để tinh khiết hóa từng hợp chất riêng lẻ, các nhà khoa học sử dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao để thu nhận các saponin với độ tinh khiết cao nhất, phục vụ cho việc xác định cấu trúc tiếp theo.

2.2. Phổ NMR trong xác định cấu trúc hóa học

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc 3D của các saponin. Thông qua phân tích phổ ¹H-NMR và phổ ¹³C-NMR, các nhà khoa học có thể xác định vị trí các nhóm thay thế trên bộ xương glycone và aglycone. Dữ liệu NMR kết hợp với các phương pháp phổ khác như khối phổ (MS) giúp xác nhận hoàn toàn cấu trúc của mỗi saponin phân lập.

III. Các mô hình nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư

Để đánh giá hoạt tính kháng ung thư của saponin từ hải sâm, các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều mô hình thí nghiệm khác nhau. Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào là phương pháp cơ bản nhất, cho phép theo dõi tác động trực tiếp của saponin lên tế bào ung thư trong điều kiện kiểm soát. Mô hình này sử dụng các dòng tế bào như MCF7 (ung thư vú), HCT116 (ung thư ruột kết) và Sarcoma-180 để đánh giá độ nhạy cảm của từng loại ung thư với saponin. Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào mô phỏng điều kiện sống thực tế của tế bào ung thư tốt hơn, với hoạt tính kháng ung thư được kiểm tra trong môi trường ba chiều.

3.1. Mô hình tế bào đơn lớp và khối cầu đa bào

Mô hình nuôi cấy đơn lớp cho phép các nhà khoa học quan sát rõ ràng tác động của saponin lên tế bào ung thư MCF7, HCT116 và Sarcoma-180. Trong mô hình này, khả năng ức chế tế bào ung thư được đo lường thông qua các chỉ tiêu sinh học như sự giảm khả năng sinh sản, tăng apoptosis. Mô hình khối cầu đa bào là bước tiến quan trọng, tái tạo được môi trường ba chiều gần giống như khối u thực tế, cho kết quả đánh giá hoạt tính saponin chính xác hơn.

3.2. Mô hình động vật thí nghiệm và các chỉ tiêu đánh giá

Chuột nhắt trắng Swiss được sử dụng trong các thí nghiệm in vivo để đánh giá hoạt tính kháng ung thư của saponin ở mức toàn thể. Các chuột được cấy ghép tế bào Sarcoma-180 để tạo lập khối u, sau đó được điều trị bằng saponin phân lập. Hoạt tính kháng ung thư được đánh giá qua sự thay đổi kích thước khối u, tỷ lệ sống sót và các chỉ tiêu sinh hóa máu.

IV. Ứng dụng và triển vọng phát triển saponin từ hải sâm

Saponin từ hải sâm sở hữu tiềm năng lớn trong phát triển các thuốc chống ung thư mới. Các hợp chất này không chỉ thể hiện hoạt tính kháng ung thư mạnh mẽ mà còn có nguồn gốc thiên nhiên, thường có độc tính thấp hơn so với các thuốc hóa học tổng hợp. Các nghiên cứu từ Phòng Dược liệu biển - Viện Hóa sinh biển đã chứng minh hiệu quả của saponin kháng ung thư trong điều trị nhiều loại ung thư khác nhau. Trong tương lai, saponin từ hải sâm có thể được phát triển thành các thuốc mới hoặc kết hợp với các liệu pháp khác để tăng cường hiệu quả điều trị. Việc khai thác bền vững nguồn tài nguyên hải sâm cũng là mục tiêu quan trọng của các nhà khoa học.

4.1. Tiềm năng phát triển thuốc từ saponin kháng ung thư

Hoạt tính kháng ung thư của saponin từ hải sâm mở ra những khả năng mới trong phát triển dược phẩm. Các công thức dự kiến sẽ kết hợp saponin với các phương pháp phân phối hiện đại như nanoparticles để tăng hiệu quả sinh học. Sự ức chế tế bào ung thư mạnh mẽ kết hợp với độc tính tổn thương ít đối với tế bào bình thường khiến saponin trở thành ứng viên hứa hẹn cho các thử nghiệm lâm sàng trong tương lai gần.

4.2. Hướng nghiên cứu và khai thác bền vững

Các định hướng nghiên cứu tiếp theo tập trung vào việc hiểu rõ hơn các cơ chế chi tiết của saponin kháng ung thư ở cấp độ phân tử. Điều này bao gồm nghiên cứu các mục tiêu sinh học mà saponin tác động, từ đó phát triển các analogue tổng hợp với hiệu quả cao hơn. Đồng thời, việc khai thác bền vững hải sâm từ vùng biển Đông bắc Việt Nam cần được thực hiện có kế hoạch để bảo vệ tài nguyên thiên nhiên cho các thế hệ tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ba tỷ USD là số tiền khổng lồ mà nhà sáng lập mạng xã hội Facebook - Mark Zuckerberg cam kết hiến tặng cho khoa học, nhằm mục đích giải quyết 4 loại bệnh nguy hiểm nhất trong thế kỷ tới. Một trong bốn loại bệnh đó chính là bệnh ung thư. Bệnh ung thư không phải bệnh mới xuất hiện trong những thế kỷ gần đây, nó đã được ghi nhận từ năm 3000 đến 1500 trước Công nguyên. Như vậy, bệnh ung thư đã tồn tại cùng con người trong suốt chiều dài lịch sử.Tuy đã hiểu được bản chất của bệnh ung thư nhưng việc phòng tránh và chữa trị ung thư vẫn luôn là thách thức to lớn cho tất cả chúng ta.

Nhiều năm qua, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học về ung thư, kèm theo những số liệu thống kê đáng lưu ý. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số 297, tháng 2 năm 2011, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Số lượng người tử vong do ung thư năm 2008 là 7,6 triệu người trong tổng số 57 triệu ca tử vong do bệnh tật trên toàn cầu (chiếm 13%). Riêng ở Hoa Kỳ năm 2008 có tới 1,5 triệu ca mắc mới ung thư.

Tổ chức Y tế thế giới dự đoán đến năm 2030, loài người sẽ phải đối mặt với số người tử vong do các bệnh ung thư tăng lên hơn 11 triệu người trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, theo thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII vào năm 2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000 người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ ngày và con số này dự báo sẽ ngày càng tăng cao. Nếu chúng ta có dịp đặt chân đến Bệnh viện K sẽ thấy rõ ung thư đã trở thành vấn nạn của xã hội ra sao. Căn cứ vào những hiểu biết của con người về ung thư, các nhà khoa học trên thế giới định hướng nghiên cứu theo nhiều hướng khác nhau.

Trong đó, xu hướng sàng lọc các chất tách chiết từ động vật, thực vật diễn ra mạnh mẽ và luôn nổi bật nhất. Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tế bào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể có khả năng chữa trị nhất định cho một số người và một số loại ung thư nên việc phối hợp nhiều loại thuốc sẽ mang đến hiệu quả cao hơn, tránh được việc quen thuốc của các tế bào ung thư. Hơn nữa, ung thư lại là nhóm bệnh vô cùng phức tạp, có thể tác động đến hầu khắp các cơ quan trong cơ thể, nên việc tiếp tục tìm ra các chất mới và bổ sung hoàn thiện cho các chất đang được nghiên cứu vẫn là việc vô cùng quan trọng và được ưu tiên hàng đầu. 1 Nguyễn Khắc K22-Sinh học thực Luận văn cao Trong đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng hợp chất saponin có tiềm năng gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư người.Nhưng saponin là nhóm hợp chất có cấu trúc rất phức tạp và tác dụng cũng rất khác nhau giữa các nhóm hợp chất saponin.

Để góp phần làm rõ hơn về tác dụng của hợp chất saponin, Tiến sĩ Nguyễn Xuân Cường của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu về loài hải sâm với tiềm năng mang nhiều hợp chất saponin. Cùng với nhóm Nghiên cứu Ung thư học thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps” với mục đích: 1. Phân lập và xác định cấu trúc từ 1 đến 3 hợp chất saponin từ loài hải sâm Cercodemas anceps 2. Đánh giá được hoạt tính diệt tế bào ung thư của các chất phân lập được trên một số dòng tế bào ung thư và trên mô hình động vật in vivo.

2 Nguyễn Khắc K22-Sinh học thực Luận văn cao Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1. Saponin và khả năng kháng u Saponin là một nhóm hợp chất được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, có đặc tính hoạt động bề mặt và không bay hơi. Cái tên saponin có nguồn gốc tiếng Latin là từ “sapo”, có nghĩa là “xà phòng” vì chất này tạo bọt dạng như xà phòng khi rung lắc mạnh với nước. Hiện tượng trên được giải thích về mặt cấu trúc là do saponin gồm các aglycone không phân cực kết hợp với một hoặc nhiều gốc monosaccharide.

Sự kết hợp giữa thành phần cấu trúc phân cực và không phân cực trong các phân tửcủa chúng giải thích vì sao chúng tạo bọt trong nước. Saponin thông thường có trong thực vật và thường có nhiều trong rễ, thân, lá, hoa và hạt. Cụ thể hơn, hợp chất này được ghi nhận là có trong hơn 100 họ thực vật và có ít nhất 150 saponin tự nhiên được cho là có khả năng kháng ung thư (anti- cancer) [11]. Bộ khung của saponin đều có nguồn gốc từ tiền chất oxidosqualene (Hình 1.1) đặc trưng bởi 30 carbon gắn thêm glycosyl.Dựa trên bộ khung carbon, saponin được chia thành triterpenes và steroid.Sự khác nhau giữa 2 lớp này là do steroid bị mất đi 3 nhóm methyl nên bộ khung chỉ có 27 carbon, trong khi triterpenes có đủ 30 carbon.

Các thành phần glycone của chúng thường là oligosaccharide, chúng được sắp xếp dạng thẳng hoặc phân nhánh, và thường liên kết với nhóm hydroxyl thông qua liên kết acetal [16]. Dựa trên bộ khung carbon, kết hợp với con đường sinh tổng hợp ra triterpenes và steroid, Jean-Paul Vincken và cộng sự đã chia thành 11 lớp saponin khác nhau bao gồm: dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes, taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes và steroids [11](Hình 1.Các nhóm này luôn cho thấy hiệu quả kháng u thông qua nhiều con đường khác nhau. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế của saponin cũng như sự tương quan giữa cấu trúc và chức năng dưới cấp độ phân tử và tế bào để hiểu về cơ chế tác động hóa sinh học của saponin. Một số saponin đặc biệt với khả năng kháng u mạnh như ginsenoside thuộc loại dammarane đã cho thấy khả năng ức chế hình thành khối u bằng cách kìm giữ một số thành phần như các tế bào nội mô mạch máu và ngăn cản sự neo bám, xâm lấn và di căn của các tế bào khối u.

Dioscin là 1 thành phần loại steroid cũng được nghiên cứu sâu với khả năng kháng khối u thông qua ngăn cản chu trình tế bào và apoptosis. Nhiều phân tử quan trọng khác thuộc về 3 Nguyễn Khắc K22-Sinh học thực Luận văn cao oleanane saponin như avicin, platycodon, sailosaponin, soysaponin cùng với tubeimosides cũng cho thấy vai trò quan trọng của mình [11]. Các nghiên cứu hiện đại cho thấy saponin có khả năng kháng khối u trên nhiều dòng tế bào ung thư như LA795 [13], MCF7 và MDA-MB-231 [10]. Vài loại saponin ức chế sự phát triển của tế bào khối u thông qua việc làm dừng chu trình và kích thích apoptosis với giá trị IC 50 khoảng 2,5 µM đến 5 µM [10].

Đối với động vật, một số saponin được nghiên cứu có giá trị LD 50 khác nhau như polyphyllin D thuộc loại steroid có giá trị LD50 là 2,73 mg/kg [10], hay saponin tách chiết từ Citrullus colocynthis có giá trị LD50 là 200 mg/kg [24]. Trong khi đó, saponin kết hợp điều trị trong các liệu pháp kháng u cho kết quả cải thiện hơn rất nhiều. Hơn nữa, sự hiểu biết một cách rõ ràng về mối liên quan giữa cấu trúc của saponin với các yếu tố khác sẽ giúp việc sử dụng saponin hiệu quả hơn. Cơ chế kháng u của một số saponin Saponin rất đa dạng về cấu trúc nên tác động kháng ung thư của từng lớp cũng rất đa dạng.

Nhiều lớp thể hiện tính kháng u rất rõ rệt với nhiều con đường khác nhau. Cycloartanes: Loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư kém nhưng chúng có thể được sử dụng kết hợp trong điều trị hóa trị khối u. Chúng làm giảm biểu hiện của dấu chuẩn ung thư ruột HCC (human colon cancer) là α- fetoprotein và ngăn cản sự phát triển của tế bào HepG2 bằng cách cảm ứng quá trình chết theo chương trình và điều khiển con đường tín hiệu của NF-kB phụ thuộc ERK (ERK-independent NF-kB) [11]. Dammeranes: hầu hết loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư.Những saponin loại này thường có tác dụng mạnh với tế bào ung thư di căn hơn tế bào không ác tính.IC50 đối với tế bào không ác tính gấp tới 40 đến 150 lần IC 50 đối với tế bào ác tính.

Bằng các ảnh chụp hiển vi điện tử và các biện pháp hóa sinh, saponin này được chứng minh là phá hủy màng trong và màng ngoài của ty thể của cả tế bào ung thư tụy và bạch cầu ở người, dẫn đến làm mất khả năng vận chuyển qua màng, làm tăng canxi nội bào, qua đó kích hoạt con đường chết theo chương trình thông qua canxi [11]. Oleananes: là loại được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên và có khả năng kháng ung thư qua nhiều con đường như kháng u, chống lại khả năng di căn, kích thích miễn dịch. Một số chất như Avincin có nguồn gốc từ cây Acacia victoriae ở 4 Nguyễn Khắc K22-Sinh học thực Luận văn cao samạc Australia có khả năng dephosphoryl hóa Stat3 trong nhiều dòng tế bào ung thư và dẫn đến làm giảm hoạt động của Stat3, qua đó làm giảm hoạt động của nhiều protein như c-myc, cyclin D1, Bcl2, survivin và VEGF. Avincin D và G gây ức chế sự phát triển của tế bào lympho T, cảm ứng khởi động con đường chết theo chương trình và đẩy tế bào vào con đường chết kiểu tự thực bào [11].Chất Tubeimoside có hiệu quả gây độc với tế bào ung thử cổ tử cung HeLa thông qua cơ chế làm rối loạn hoạt động của ty thể hoặc gây chết tế bào bằng các ức chế lên lưới nội chất và ức chế trùng hợp tubulin.

Ngoài ra, chất Saikosaponin A làm giảm khả năng sống và khả năng phân chia của tế bào MCF7, khởi phát chết theo chương trình và dừng chu trình tế bào ở pha G1. Hay chất saponin được tách chiết từ cây Platycodon grandiflorumtác động đến hoạt động của thoi vô sắc nên làm dừng phân chia tế bào, ức chế hoạt động của telomerase thông qua can thiệp vào quá trình phiên mã hTERT của telomere. Spirostanes cho thấy khả năng kháng u mạnh và kích thích hệ miễn dịch.