MỞ ĐẦU Ngày nay, khi nhu cầu cuộc sống ngày càng cao, các loại sản phẩm chức năng ra đời với mục đích hỗ trợ, cải thiện, nâng cao sức khỏe của con người là luôn là một vấn đề được xã hội đặc biệt quan tâm. Việc bổ sung prebiotic vào các loại thực phẩm bổ sung, thực phẩm chức năng đã trở nên khá quen thuộc trong đời sống cũng như trong nghiên cứu khoa học. Pectic oligosaccharide (POS) là một hợp chất cacbonhydrate, có nguồn gốc từ pectin là một trong những prebiotic được nghiên cứu trong thời gian gần đây. POS đã được nghiên cứu và chứng minh là một loại prebiotic tốt, không những kích thích sự phát triển của vi khuẩn có lợi trong hệ tiêu hóa như Bifidobacterium, Lactobacillus [29] .mà còn có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh như E.coli O157:H7, làm giảm tác hại của độc tố gây bệnh trong thực phẩm, phòng chống ung thư [3] , tăng cường chuyển hóa lipid và hypercholesterol [33],.
Với các hoạt tính sinh học có lợi như vậy, POS được ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức năng và thức ăn chăn nuôi. Trong một vài trường hợp, POS còn được ứng dụng là chất kích thích cho quả chín [25]. Hiện nay POS được tạo ra bởi một số phương pháp như: tổng hợp hóa học, phân cắt pectin bằng chiếu xạ và sử dụng enzym pectinase thủy phân giới hạn pectin. Trong đó, phương pháp sử dụng pectinase thủy phân được coi là có hiệu quả tốt nhất do điều kiện phản ứng enzym êm dịu, thân thiện với môi trường, cường lực xúc tác của enzym mạnh.
Bên cạnh đó, Việt Nam là nước nông nghiệp, có các nguồn nguyên liệu từ phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin: vỏ cam, vỏ chanh, vỏ bưởi, vỏ chanh dây v. Cho tới nay, chưa có công trình nào trong nước công bố về công nghệ thủy phân pectin tạo POS nhờ các enzym thủy phân giới hạn. Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển hóa pectin tạo Pectic oligosaccharide (POS) bằng Endo- polygalacturonase và khảo sát một số hoạt tính sinh học”. -1- Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: - Hoàn thiện công nghệ tách chiết pectin từ chanh dây - Xác định điều kiện thủy phân pectin từ chanh dây bằng Endo – polygalacturonase tạo Pectic – oligosaccharide: nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy và thời gian thủy phân - Tối ưu hóa điều kiện thủy phân pectin tạo POS - Khảo sát một số hoạt tính prebiotic của chế phẩm POS -2- Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Phần 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm Prebiotic Prebiotic là nguồn thức ăn cho probiotic (vi sinh vật sống hữu ích trong đường ruột vật chủ).
Nhờ có prebiotic mà vi sinh hữu ích có điều kiện phát triển mạnh mẽ hơn, do đó cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ. Năm 1995, Gibson và Roberfroid lần đầu tiên đã được ra khái niệm prebiotic như sau: “ Prebiotics là những thành phần thực phẩm không tiêu hóa được có tác dụng có lợi cho vật chủ bằng cách kích thích sự phát triển và tăng cường hoạt động của một số loài vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa của vật chủ” [45]. Tuy nhiên, hiện nay, prebiotic đã được định nghĩa lại một cách chính xác và đầy đủ hơn: “Prebiotics là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm cacbonhydate mà cơ thể vật chủ không tiêu hóa được (oligosaccharide), kích thích sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong ruột” Prebiotic có những tác động vô cùng hữu ích đối với hệ tiêu hóa của con người. Thông thường các vi khuẩn có hại có khả năng liên kết với bề mặt niêm mạc ruột bằng việc sử dụng các thụ thể oligosaccharide trong ruột và gây nên các bệnh về dạ dày.1: Mô tả sự gắn vi sinh vật bệnh vào thành ruột -3- Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Tuy nhiên các prebiotic có thể mô phỏng các thụ thể ở ruột, tạo ra “cái bẫy” cho các vi khuẩn có hại, khiến chúng liên kết với các prebiotic thay vì các thụ thể chuẩn (oligosaccharide ở ruột), từ đó tạo ra một lớp màng bảo vệ niêm mạc ruột.2 : Mô tả tác dụng của prebiotic Chúng góp phần tái tạo sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột (chống tại các vi khuẩn gây bệnh).
Các vi khuẩn hữu ích sống trong đường ruột như Bifidobacterium và Lactobacillus có thể ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Campylobacter và Salmonella. Nghiên cứu cho thấy thức ăn trẻ sơ sinh có bổ sung Galacto-oligosaccharides (GOS) và Fructo- oligosaccharides (FOS) làm tăng vi khuẩn bifidobacteria (có ích) trong phân. Một số nghiên cứu trên động vật cho thấy prebiotic giúp tăng hấp thụ canxi tại ruột già, FOS tăng cường hấp thu canxi, magie, sắt, đồng và kích thích các vi khuẩn thủy phân phytic acid giúp nâng cao sự hấp thụ khoáng chất. Ngoài ra prebiotic còn có khả năng phòng tránh các vấn đề cholesterol trong máu, sâu răng cũng như hạn chế khả năng bị dị ứng của trẻ [48] -4- Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Hình 1.3 Đường đi của prebiotic trong cơ thể người Prebiotic chủ yếu là oligosaccharide.
Các oligosaccharide này không được thủy phân trong ruột non nên còn được gọi là chất xơ trong khẩu phần ăn là thành phần thực phẩm không tiêu hóa được. Chỉ có một phần nhỏ oligosaccharide được thủy phân tại dạ dày cho ra các đường đơn và hấp thu tại ruột non. Một phần các đường đơn này sẽ được tiêu thụ ngay tại đường ruột như là nguồn năng lượng để duy trì và tái tạo các tế bào ruột. Phần lớn oligosaccharide được đưa xuống ruột già và lên men tại đây.
Từ đó, người ta có định nghĩa về một loại thực phẩm mới – “thực phẩm tiêu hóa” (colonic foods) là các hợp chất không bị hấp thụ ở dạ dày mà có khả năng đi vào ruột già để cung cấp thức ăn cho các loại vi sinh vật ở ruột già. Hầu hết chúng được lên men không đặc hiệu trong ruột, nghĩa là một khi đã được tiêu hóa, chúng sẽ kích thích sự phát triển hoặc kích thích sự hoạt động của các loài vi sinh vật khác nhau, bao gồm cả loài có lợi và có hại [45, 46]. -5- Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Với những đặc tính trên, một oligosaccharide được cho là một prebiotic thì phải đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn sau: • Không bị thủy phân bởi các enzym tiêu hóa đường ruột và không làm ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa. • Chúng phải được lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi đường ruột.
• Sản phẩm của sự lên men này có ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe của vật chủ. Với những lợi ích to lớn trong việc nâng cao sức khỏe con người, việc sử dụng các prebiotic để bổ sung vào thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung dinh dưỡng (sữa bột trẻ em.) hiện nay đang được khuyến khích và áp dụng rộng rãi.2 Một số prebiotic thường gặp • Fructo – oligosaccharide (FOS) FOS được cấu tạo từ một saccharose liên kết với 1-3 gốc fructose theo liên kết β – 2,1 glucoside. Tùy theo số gốc fructose mà có tên gọi khác nhau: Saccharose + 1 fructose (GF2): Kestose, Saccharose + 2 fructose (GF3): Nystose, Saccharose + 3 fructose (GF4): Fructosyl Nystose,… FOS có độ ngọt ~ 30% so với saccharose. FOS không bị tiêu hóa ở dạ dày trên, do đó có khả năng kích thích sự phát triển của chủng Lactobacillus và Bifidobacterium ở ruột già nhưng không kích thích các mầm bệnh.
FOS làm tăng khả năng hấp thụ canxi và magie đồng thời làm giảm triglycerit và cholesterol. Ở động vật, FOS cho thấy khả năng ngăn ngừa ung thư ruột kết, làm giảm đáng kể sự hình thành các khối u đường ruột và kháng khuẩn (như vi khuẩn gây sâu răng,. -6- Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Hình 1.4 Mô hình biểu diễn thành phần của FOS • Malto – oligosaccharide Malto-oligosaccharide là một hỗn hợp gồm các oligo mạch thẳng có từ 2-10 gốc glucose liên kết với nhau qua liên kết α – 1,4 glucoside như: maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose (G5), maltohexanose (G6),… Trong đó có hoạt tính prebiotic từ Maltotriose. Độ ngọt của Malto-oligosaccharide thấp, chỉ bằng 30% so với đường saccharose.
Malto-oligosaccharide được sản xuất từ tinh bột và có tác dụng chống táo bón, giúp cơ thể giữ ổn định độ đường trong máu thời gian dài, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể cũng như khả năng làm việc. • Inulin Inulin là một chuỗi oligosaccharide cấu tạo bởi D (-) fructose nên còn được gọi là fructan. Inulin có nhiều ở củ mẫu đơn, rễ cải đắng và một số cây họ hòa thảo. Ở các thực vật này inulin thay thế cho tinh bột.
Trong phân tử inulin, các gốc fructose liên kết với nhau nhờ liên kết 2→1. Phần tận cùng của phân tử là gốc disaccharide saccharose. Inulin có khả năng giữ nước, thay thế chất béo và đóng góp năng lượng tối thiểu, đồng thời có hương vị ngọt nên được bổ sung vào rất nhiều loại thực phẩm khác nhau, sử dụng làm chất thay thế đường, tạo độ cứng và ổn định bọt,… Ngoài ra còn có một số loại oligosaccharide thông dụng khác được xếp vào loại prebiotic như: Galacto oligosaccharide (GOS), Xylo oligosaccharide (XOS), -7- Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Isomalto oligosaccharides (IMO), Pectic oligosaccharide (POS), Mano oligosaccharide (MOS), Pyrodextrin,.1 Cấu tạo pectic oligosaccharide Pectic oligosaccharide (POS) là hợp chất cacbonhydrate, được cấu tạo từ 2- 10 phân tử D-galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside [13]. Cấu tạo của D-galacturonic acid và Pectic oligosaccharide 1.
Tính chất chung của Pectic oligosaccarit POS là những oligosaccharide được cấu tạo bởi sự liên kết của một số ít Galacturonic acid với phân tử lượng không lớn và chúng có một số tính chất của một axit hữu cơ, mang điện tích âm, có độ nhớt thấp và ít ngọt hơn đường sucrose [6]. POS dễ tan trong nước và khi thủy phân bằng axit hoặc enzym sẽ làm đứt các liên kết glucoside, giải phóng các đơn phân Galacturonic acid và các oligosaccharide mạch ngắn hơn.3 Hoạt tính sinh học của Pectic oligosaccharide POS là một prebiotic thế hệ mới [20] với những đặc tính tốt và mang tính ứng dụng cao. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của POS đã chứng minh. POS có tính chất của một prebiotic như: được lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi trong đường ruột và sản phẩm của sự lên men này hỗ trợ tốt cho quá trình cải thiện hệ tiêu hóa của vật chủ.Olano Martin và cộng sự đã khẳng định POS có khả năng kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn Bifidobacterium lactis, B.