Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng hbv rna huyết tương ở bệnh nhân viêm gan b mạn tính

Nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và chẩn đoán.

• Tác giả: Triệu Thị Nguyệt
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Hữu Thọ
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về HBV
• 1.2. Đặc điểm phân loại HBV
• 1.3. Đặc điểm hình thái HBV
• 1.4. Cấu trúc hệ gen HBV
• 1.5. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe
• 1.6. Chu trình nhân lên của HBV
• 1.7. Con đường lây nhiễm của virus HBV
• 1.8. Tổng quan về viêm gan B mạn tính
• 1.9. HBV và viêm gan B
• 1.10. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới
• 1.11. Tình hình nghiên cứu HBV
• 1.12. Trên thế giới
• 1.13. Tính mới và tính sáng tạo của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu, hóa chất
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Thiết kế nghiên cứu
• 2.6. Thu thập, bảo quản mẫu
• 2.7. Tách chiết acid nucleic
• 2.8. Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương
• 2.9. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 2.9.1. Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược
• 2.9.2. Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược
• 2.9.3. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
• 2.9.4. Tối ưu thời gian luân nhiệt
• 2.9.5. Tối ưu nồng độ mồi
• 2.9.6. Tối ưu nồng độ probe
• 2.10. Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR
• 2.11. Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 2.12. Phân tích, xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.2. Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh
• 3.3. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định
• 3.4. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn trước khi hoàn thiện
• 3.5. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.6. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA
• 3.7. Tối ưu quy trình realtime RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.8. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc độ thay đổi nhiệt độ của phản ứng RT-qPCR
• 3.9. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi và probe
• 3.10. Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm
• 3.11. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 3.12. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR
• 3.13. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm
• 3.14. Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.15. Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.16. Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình định lượng HBV RNA huyết tương

Quy trình định lượng HBV RNA huyết tương là một phương pháp quan trọng trong việc theo dõi và đánh giá tình trạng viêm gan B. Việc xác định nồng độ HBV RNA giúp đánh giá mức độ hoạt động của virus và hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về quy trình này, từ nguyên lý đến ứng dụng thực tiễn.

1.1. Định nghĩa và vai trò của HBV RNA trong viêm gan B

HBV RNA, hay RNA tiền gen, là một chỉ số quan trọng trong việc đánh giá tình trạng nhiễm virus viêm gan B. Nồng độ HBV RNA trong huyết tương phản ánh mức độ nhân lên của virus và có thể dự đoán được sự tiến triển của bệnh.

1.2. Tại sao cần định lượng HBV RNA huyết tương

Việc định lượng HBV RNA huyết tương giúp bác sĩ theo dõi hiệu quả điều trị, phát hiện tái phát bệnh và điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh điều trị viêm gan B mạn tính.

II. Những thách thức trong quy trình định lượng HBV RNA huyết tương

Mặc dù quy trình định lượng HBV RNA huyết tương mang lại nhiều lợi ích, nhưng cũng gặp phải một số thách thức. Các yếu tố như độ chính xác của phương pháp, sự ổn định của mẫu và khả năng phát hiện nồng độ thấp của HBV RNA đều là những vấn đề cần được giải quyết.

2.1. Độ chính xác và độ nhạy của phương pháp định lượng

Độ chính xác của quy trình định lượng HBV RNA phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm chất lượng mẫu, phương pháp tách chiết và kỹ thuật RT-qPCR. Việc tối ưu hóa các bước này là cần thiết để đảm bảo kết quả chính xác.

2.2. Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản mẫu đến kết quả

Điều kiện bảo quản mẫu huyết tương có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của HBV RNA. Việc bảo quản không đúng cách có thể dẫn đến sự phân hủy RNA, làm giảm độ chính xác của kết quả định lượng.

III. Phương pháp RT qPCR trong định lượng HBV RNA huyết tương

Phương pháp RT-qPCR là kỹ thuật chính được sử dụng để định lượng HBV RNA huyết tương. Kỹ thuật này cho phép phát hiện và định lượng nồng độ RNA với độ nhạy cao, giúp theo dõi tình trạng bệnh nhân một cách hiệu quả.

3.1. Nguyên lý hoạt động của RT qPCR

RT-qPCR kết hợp giữa phiên mã ngược và phản ứng chuỗi polymerase để khuếch đại RNA. Quá trình này cho phép phát hiện nồng độ thấp của HBV RNA trong mẫu huyết tương.

3.2. Các bước thực hiện quy trình RT qPCR

Quy trình RT-qPCR bao gồm các bước tách chiết RNA, phiên mã ngược, và khuếch đại DNA. Mỗi bước cần được tối ưu hóa để đạt được kết quả chính xác và đáng tin cậy.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quy trình định lượng HBV RNA huyết tương

Quy trình định lượng HBV RNA huyết tương có nhiều ứng dụng trong lâm sàng, từ việc theo dõi hiệu quả điều trị đến dự đoán tiến triển bệnh. Việc áp dụng quy trình này giúp cải thiện chất lượng chăm sóc sức khỏe cho bệnh nhân viêm gan B.

4.1. Theo dõi hiệu quả điều trị viêm gan B

Định lượng HBV RNA giúp bác sĩ đánh giá hiệu quả của các phương pháp điều trị, từ đó điều chỉnh phác đồ điều trị phù hợp với từng bệnh nhân.

4.2. Dự đoán tiến triển bệnh và nguy cơ tái phát

Nồng độ HBV RNA trong huyết tương có thể dự đoán nguy cơ tái phát bệnh. Việc theo dõi thường xuyên giúp phát hiện sớm các dấu hiệu tái phát và can thiệp kịp thời.

V. Kết luận và tương lai của quy trình định lượng HBV RNA huyết tương

Quy trình định lượng HBV RNA huyết tương là một công cụ quan trọng trong việc quản lý bệnh viêm gan B. Tương lai của quy trình này hứa hẹn sẽ có nhiều cải tiến về độ chính xác và độ nhạy, giúp nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

5.1. Xu hướng phát triển công nghệ trong định lượng HBV RNA

Công nghệ mới trong định lượng HBV RNA như kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) có thể mở ra hướng đi mới trong việc theo dõi và điều trị viêm gan B.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình và phát triển các biomarker mới để cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị viêm gan B.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm virus viêm gan B (HBV) là một vấn đề y tế toàn cầu với khoảng 248 triệu người mang virus và hơn 600,000 ca tử vong mỗi năm do các biến chứng liên quan như xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính cao, với ước tính hơn 10 triệu người mang HBV mạn tính, chiếm tỷ lệ HBsAg dương tính từ 15% đến 26% tùy vùng. Viêm gan B mạn tính (CHB) là nguyên nhân chính gây ra các bệnh gan nghiêm trọng, đòi hỏi các phương pháp chẩn đoán và theo dõi hiệu quả để kiểm soát bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu là thiết lập và tối ưu quy trình định lượng HBV pregenomic RNA (pgRNA) trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính bằng kỹ thuật RT-qPCR với độ nhạy cao. Nghiên cứu tập trung vào bệnh nhân đang điều trị bằng các thuốc đồng đẳng nucleoside (NAs) tại Việt Nam, nhằm cung cấp công cụ đánh giá hoạt tính phiên mã của cccDNA – một dạng DNA vòng kép tồn tại bền vững trong nhân tế bào gan, là nguồn gốc của sự tái phát bệnh khi ngừng điều trị.

Phạm vi nghiên cứu bao gồm 77 bệnh nhân viêm gan B mạn tính và 50 người khỏe mạnh làm nhóm chứng, tiến hành thu thập mẫu huyết tương và phân tích tại phòng thí nghiệm chuyên sâu. Ý nghĩa nghiên cứu thể hiện qua việc cung cấp phương pháp định lượng pgRNA huyết tương, giúp đánh giá hiệu quả điều trị, dự báo chuyển đảo huyết thanh và quản lý bệnh nhân CHB một cách chính xác hơn, góp phần giảm gánh nặng bệnh tật do HBV gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Chu trình nhân lên của HBV: HBV có bộ gen DNA dạng vòng không kín (rcDNA), chuyển đổi thành cccDNA trong nhân tế bào gan, từ đó phiên mã ra các RNA virus, trong đó có pregenomic RNA (pgRNA) làm khuôn cho quá trình phiên mã ngược tạo DNA mới. pgRNA trong huyết tương phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA, là dấu ấn sinh học quan trọng để đánh giá sự nhân lên của virus.

• Mô hình RT-qPCR định lượng: Kỹ thuật RT-qPCR sử dụng mồi và probe đặc hiệu vùng gen S bảo thủ của HBV để khuếch đại và định lượng pgRNA trong huyết tương. Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng chính xác với ngưỡng phát hiện thấp, độ đặc hiệu cao, phù hợp cho theo dõi bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

• Khái niệm chính:

  • cccDNA: DNA vòng kép tồn tại bền vững trong nhân tế bào gan, là khuôn mẫu phiên mã RNA virus.
  • pgRNA: RNA tiền bộ gen, bản sao RNA của HBV, phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA.
  • RT-qPCR: kỹ thuật phiên mã ngược kết hợp khuếch đại định lượng thời gian thực, dùng để đo tải lượng RNA virus.
  • HBeAg: kháng nguyên e của HBV, chỉ thị hoạt động nhân lên của virus.
  • NAs: thuốc đồng đẳng nucleoside, ức chế enzyme phiên mã ngược của HBV.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu huyết tương của 77 bệnh nhân viêm gan B mạn tính được thu thập tại các cơ sở y tế, cùng 50 mẫu huyết tương của người khỏe mạnh làm nhóm chứng. Ngoài ra, 5 mẫu bệnh nhân viêm gan C được sử dụng để đánh giá độ đặc hiệu.

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả, tiến hành xây dựng và tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương. Quy trình bao gồm thiết kế mồi/probe đặc hiệu vùng gen S, tổng hợp RNA chuẩn in-vitro, tối ưu các điều kiện phản ứng (nhiệt độ phiên mã ngược, nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước, nồng độ mồi và probe), đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ ổn định của quy trình.

• Phương pháp phân tích: Sử dụng phần mềm Clustalx để đánh giá tính đa hình vùng gen S, phần mềm Oligo Primer Analysis để thiết kế mồi/probe. Phân tích RT-qPCR trên máy RotorGene với các chu trình nhiệt tối ưu. Đánh giá ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng, hệ số biến thiên (CV), độ lệch phép đo (ME) để xác định độ chính xác và lặp lại. Phân tích số liệu bằng phần mềm thống kê chuyên dụng.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và tách chiết RNA trong vòng 2 giờ sau lấy mẫu, bảo quản ở -80°C. Tối ưu quy trình RT-qPCR trong khoảng 3 tháng, đánh giá độ ổn định mẫu chuẩn qua các mốc 2 tuần, 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng. Phân tích kết quả và hoàn thiện quy trình trong vòng 6 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế mồi/probe đặc hiệu vùng gen S: Vùng đầu N-terminal của gen S được xác định là vùng bảo thủ nhất, phù hợp để thiết kế mồi/probe cho RT-qPCR. Phân tích đa hình cho thấy vùng này có tính ổn định cao, giảm thiểu sai số do đột biến.

2. Ngưỡng phát hiện và định lượng: Quy trình RT-qPCR đạt ngưỡng phát hiện là 1,25 copy/phản ứng với độ nhạy trên 95%, ngưỡng định lượng là 2,5 copy/phản ứng với độ chính xác 100%. Dải đo rộng từ 10^4 đến 1,25 copy/phản ứng, phù hợp với nhu cầu định lượng tải lượng pgRNA trong huyết tương.

3. Độ chính xác và lặp lại: Hệ số biến thiên (CV) của các lần lặp lại dưới 5%, độ lệch phép đo (ME) thấp, chứng tỏ quy trình có độ lặp lại và chính xác cao. Đánh giá độ ổn định mẫu chuẩn cho thấy mẫu ổn định trong vòng 3 tháng bảo quản ở -80°C.

4. Đánh giá trên mẫu bệnh nhân CHB: Tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân HBeAg dương tính trung bình cao hơn đáng kể so với nhóm HBeAg âm tính (p < 0,05). Kết quả phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, cho thấy pgRNA là dấu ấn sinh học phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân của các phát hiện trên xuất phát từ việc lựa chọn vùng gen S bảo thủ làm đích thiết kế mồi/probe, giúp tăng tính đặc hiệu và giảm ảnh hưởng của đột biến gen HBV. Việc tối ưu các điều kiện phản ứng RT-qPCR như nhiệt độ phiên mã ngược 50°C trong 10 phút, nhiệt độ gắn mồi 63°C, thời gian gắn mồi 30 giây đã nâng cao hiệu suất khuếch đại và độ nhạy của phương pháp.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả ngưỡng phát hiện và định lượng tương đương hoặc vượt trội, chứng tỏ quy trình phù hợp với đặc điểm virus HBV tại Việt Nam. Việc phát hiện pgRNA trong huyết tương giúp đánh giá hoạt tính cccDNA mà không cần sinh thiết gan, giảm thiểu rủi ro cho bệnh nhân.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường chuẩn RT-qPCR, bảng so sánh tải lượng pgRNA giữa nhóm HBeAg dương tính và âm tính, cũng như biểu đồ thể hiện độ ổn định mẫu chuẩn theo thời gian. Những kết quả này góp phần nâng cao hiệu quả theo dõi điều trị và dự báo đáp ứng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA trong lâm sàng: Khuyến nghị các cơ sở y tế triển khai kỹ thuật này để theo dõi hoạt tính virus, đặc biệt ở bệnh nhân điều trị bằng NAs, nhằm đánh giá hiệu quả điều trị và dự báo tái phát. Thời gian thực hiện: trong vòng 12 tháng tới.

2. Đào tạo nhân viên kỹ thuật và chuyên gia y tế: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật RT-qPCR và phân tích dữ liệu pgRNA cho cán bộ phòng xét nghiệm và bác sĩ chuyên khoa gan mật. Chủ thể thực hiện: các bệnh viện, viện nghiên cứu. Thời gian: 6 tháng.

3. Xây dựng hướng dẫn chuẩn quốc gia về sử dụng pgRNA làm dấu ấn sinh học: Phối hợp giữa Bộ Y tế và các hiệp hội chuyên ngành để ban hành hướng dẫn sử dụng pgRNA trong chẩn đoán và theo dõi viêm gan B mạn tính. Thời gian: 18 tháng.

4. Nghiên cứu mở rộng và theo dõi dài hạn: Tiếp tục nghiên cứu trên mẫu bệnh nhân đa dạng hơn, theo dõi biến động pgRNA trong quá trình điều trị và sau ngừng thuốc để hoàn thiện mô hình dự báo đáp ứng điều trị. Chủ thể: các viện nghiên cứu, trường đại học. Thời gian: 24 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa gan mật: Nắm bắt kỹ thuật định lượng pgRNA giúp cải thiện chẩn đoán, theo dõi và điều chỉnh phác đồ điều trị viêm gan B mạn tính hiệu quả hơn.

2. Nhân viên phòng xét nghiệm y học phân tử: Áp dụng quy trình RT-qPCR tối ưu trong xét nghiệm định lượng pgRNA, nâng cao chất lượng và độ tin cậy của kết quả xét nghiệm.

3. Nhà nghiên cứu y sinh học và vi sinh vật học: Tham khảo phương pháp thiết kế mồi/probe, tối ưu kỹ thuật RT-qPCR và phân tích dữ liệu để phát triển các nghiên cứu liên quan đến virus HBV và các virus khác.

4. Cơ quan quản lý y tế và chính sách: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách, hướng dẫn và chương trình giám sát viêm gan B mạn tính, góp phần giảm thiểu gánh nặng bệnh tật trong cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần định lượng HBV pgRNA trong huyết tương?
   Định lượng pgRNA giúp phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA trong tế bào gan mà không cần sinh thiết gan, hỗ trợ đánh giá hiệu quả điều trị và dự báo tái phát viêm gan B mạn tính.

2. Quy trình RT-qPCR được tối ưu như thế nào để đạt độ nhạy cao?
   Quy trình được tối ưu về nhiệt độ phiên mã ngược (50°C), nhiệt độ gắn mồi (63°C), thời gian các bước, nồng độ mồi (0,5 µM) và probe (0,1-0,2 µM), cùng việc sử dụng enzyme UNG để ngăn ngừa nhiễm chéo.

3. Ngưỡng phát hiện và định lượng của quy trình là bao nhiêu?
   Ngưỡng phát hiện là 1,25 copy/phản ứng với độ nhạy trên 95%, ngưỡng định lượng là 2,5 copy/phản ứng với độ chính xác 100%, phù hợp cho theo dõi tải lượng pgRNA trong huyết tương.

4. Tải lượng pgRNA có liên quan thế nào đến tình trạng bệnh?
   Bệnh nhân HBeAg dương tính có tải lượng pgRNA huyết tương cao hơn đáng kể so với nhóm HBeAg âm tính, phản ánh hoạt tính phiên mã cccDNA và mức độ nhân lên của virus.

5. Làm thế nào để áp dụng kết quả nghiên cứu vào thực tế lâm sàng?
   Cần triển khai kỹ thuật RT-qPCR định lượng pgRNA tại các phòng xét nghiệm, đào tạo nhân viên, xây dựng hướng dẫn sử dụng và phối hợp với bác sĩ để theo dõi và điều chỉnh điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao, ngưỡng phát hiện 1,25 copy/phản ứng và độ chính xác cao.
• Vùng gen S đầu N-terminal được xác định là vùng bảo thủ, phù hợp làm đích thiết kế mồi/probe cho phản ứng RT-qPCR.
• Tải lượng pgRNA huyết tương phản ánh chính xác hoạt tính phiên mã của cccDNA, có giá trị trong theo dõi và dự báo đáp ứng điều trị viêm gan B mạn tính.
• Quy trình có độ lặp lại và độ ổn định tốt, phù hợp áp dụng trong thực hành lâm sàng tại Việt Nam.
• Khuyến nghị triển khai kỹ thuật này rộng rãi, đào tạo nhân lực và xây dựng hướng dẫn sử dụng để nâng cao hiệu quả quản lý bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Tiếp theo, cần mở rộng nghiên cứu trên quy mô lớn hơn và theo dõi dài hạn để hoàn thiện mô hình dự báo đáp ứng điều trị, đồng thời phối hợp với các cơ quan y tế để đưa kỹ thuật vào ứng dụng thực tế. Để biết thêm chi tiết và hỗ trợ triển khai, vui lòng liên hệ với nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu AUG khác nhau [92]. Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107]. Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV 1. Các protein HBV Hệ gen HBV mã hóa cho 7 protein: HBx, core, polymerase, L-, M- và S- HBsAg.

Trong số các protein này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào hình thành cấu trúc của virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc của virion và protein này được giải phóng một cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệm cho quá trình nhân lên của cả hệ gen, và protein core và HBsAg có chức năng hình thành cấu trúc của virion. Chức năng của từng protein của virus HBV sẽ được nhắc đến chi tiết hơn ở phần dưới đây. Kháng nguyên E HBeAg là sản phẩm cuối cùng của quá trình sau dịch mã ORF precore. Là một trong những protein được mã hóa bởi sản phẩm phiên mã từ bộ gen của virus, 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] sự biểu hiện của protein này phụ thuộc vào vùng khởi động của bộ gen virus.

ORF HBeAg mã hóa cho một trình tự với đích là lưới nội chất (endoplasmic reticulum - ER) và đồng thời cũng dịch mã ra các peptide hướng ngoài ER, nơi mà protein sau khi hoàn thiện tồn tại ở dạng 15kD HBeAg - chính là các kháng nguyên được tiết ra từ các tế bào nhiễm HBV [113]. Kháng nguyên bề mặt HBsAg là protein vỏ của virion HBV. Như sự tồn tại của HBsAg ở các virion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa một lượng dư các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg không có khả năng gây nhiễm cũng tồn tại trong huyết thanh của họ. Những tiểu thể này được tiết ra nhiều hơn (100 -100,000 lần) khi so với số lượng các virus trưởng thành được tiết ra [107].

Có một số báo cáo đã chỉ ra rằng lý do các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg được tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane có thể là cái bẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, sự nhiễm mạn tính có thể được hình thành [30, 35]. HBsAg không chỉ được tạo ra bởi quá trình dịch mã của mRNA mà còn từ các DNA tích hợp với bộ gen của người. Điều kiện này có thể giúp chúng ta biết được trạng thái nhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [107]. Chức năng chính của các kháng nguyên bề mặt đó là hình thành nên lớp vỏ của virus.

Ba dạng khác nhau của hạt virus được giải phóng từ tế bào nhiễm HBV là kết quả của quá trình biểu hiện không đồng đều của ba kháng nguyên bề mặt này. S- HBsAg là protein có mức biểu hiện cao nhất trong các kháng nguyên bề mặt của virus HBV và protein này chính là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus [25]. Protein lõi (protein core) Protein core (protein lõi) (21 kD) hay còn gọi là HBcAg, là protein có vai trò định hình cho virion. Khi được biểu hiện trong tế bào, protein này thường tồn tại ở dạng nhị hợp, hoặc ở dạng capsid nhị thập diện đều T = 3 hoặc T = 4.

Khoảng 95% các nucleocapsid được phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid T = 4 tạo nên khoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% còn lại là các capsid T = 3 với 90 nhị hợp. 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Protein lõi được dịch mã từ pgRNA và 149 axit amin đầu tiên hình thành nên vùng lắp ráp, có chức năng cho sự hình thành in vitro của capsid, capsid này sẽ có sự khác biệt với capsid được phân lập từ tiểu thể Dane [16]. Khoảng 34 - 36 axit amin còn lại sẽ tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); quá trình phosphoryl hóa của một số axit amin trong vùng CTD có chức năng điều hòa một số giai đoạn trong chu trình sống của virus [57, 65, 73, 81]. Polymerase/Reverse transcriptase (RTase) Không lâu sau khi xác định được dạng virus giống HBV ở vịt [69], mô hình DHBV đã được sử dụng để xác định bộ gen của DHBV có trải qua trung gian RNA, cho thấy HBV nhân đôi thông qua quá trình phiên mã ngược (RT) [99].

Trong khi quá trình phiên mã ngược là một cơ chế đã được nhiều virus sử dụng, HBV trải qua quá trình sao chép bộ gen với nhiều đặc điểm độc đáo. Protein polymerase (reverse transcriptase/RTase/Pol/P) là protein 90kD và có khoảng 838 axit amin được tạo thành từ 3 vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi. Ở vùng N-terminal là vùng TP (terminal protein), là vùng có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình sao chép bộ gen virus. Mặc dù vùng này có vai trò quan trọng giúp polymerase bám vào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết các protein [9, 119, 129], vùng TP là một domain độc đáo không có ở các virus RT không thuộc nhóm HBV.

Một vùng đệm thay đổi có khả năng phân chia TP domain từ RT domain, và đã có một số nghiên cứu cho thấy gần như tất cả axit amin thuộc vùng đệm này có thể bị đột biến mà không làm thay đổi chức năng của P [86]. Thực tế là, chỉ có 3 phân tử cysteine nằm trong vùng C-terminal của vùng đệm, cùng với một phần tư của đầu N-terminal của RT domain là quan trọng đối với chức năng của enzyme RTase/polymerase [53]. RT domain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên mã ngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau đó sợi âm này được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương của DNA. Domain này có độ tương đồng cao đối với các loại retrovirus khác [122].

Hiện nay domain RT là liệu pháp đích duy nhất chống lại HBV [91], dựa trên hiệu quả của các loại thuốc NAs có khả năng ức chế khả năng của enzyme RTase của virus HIV. Thực tế 9 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] là, các thành phần trong HBV RTase có thể được thay thế bằng các thành phần đồng hợp của HIV RTase [116]. Domain cuối cùng, P, là domain của enzyme RNase H. Domain này chịu trách nhiệm cho việc cắt bỏ mạch khuôn pgRNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi âm của hệ gen DNA.

Sự định hướng của các liên kết ion kim loại là rất quan trọng đối với hoạt tính của RNase H, đạt được qua 4 carboxylate được bảo toàn [103]. Một vài nghiên cứu về domain RNase H cho thấy vai trò quan trọng của domain này trong việc đóng gói pgRNA [10]. Protein X HBx là protein có chức năng điều hòa duy nhất được mã hóa bởi HBV. Protein này gồm có 154 axit amin, 17 kD và được mã hóa bởi ORF nhỏ nhất của HBV.

Đã có rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy những bằng chứng xác thực về vai trò cần thiết của HBx trong suốt quá trình nhân lên của HBV. Đặc biệt, có một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng HBx liên kết với cccDNA [13], và HBx là yếu tố cần cho quá trình phiên mã từ cccDNA [94]. Ngoài ra còn một số nghiên cứu về các HBV ở động vật có vú cho thấy vai trò của các protein X đối với quá trình nhân lên của bộ gen virus [128]. Những thử nghiệm về việc ức chế HBx đều cho thấy sự suy giảm về mức độ nhân lên của virus HBV đã cho chúng ta thấy một điều rằng có thể HBx không thật sự cần thiết cho quá trình nhân lên của virus nhưng không thể nghi ngờ gì về khả năng tăng cường mức độ nhân lên của virus [108].

Quan trọng là, sự cần thiết của HBx đã được chứng minh trong các tế bào gan của người trực tiếp nhiễm HBV kiểu dại hoặc HBV có gen HBx bị bất hoạt [64]. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe a) Lựa chọn vùng trình tự ổn định, đặc hiệu cho HBV pgRNA làm đích thiết mồi/probe. HBV là virus rất được quan tâm từ nhiều thập kỷ trước, tuy nhiên cho đến nay HBV vẫn còn là một bí ẩn do hệ gen của HBV chứa nhiều biến dị di truyền và đột biến ngẫu nhiên. Do đó, bước quan trọng trước khi lựa chọn vùng trình tự 10 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] pgRNA để thiết kế mồi, probe là phân tích tính đa dạng di truyền, các đột biến trong hệ gen HBV để từ đó xác định được vùng gen ổn định, đặc hiệu nhất.

Đa dạng di truyền của virus viêm gan B: Như các virus khác, biến dị di truyền và sự tiến hóa của hệ gen là những yếu tố quan trọng trong chu trình sống của virus HBV. Tuy nhiên, khác với những virus có hệ gen là DNA khác, HBV có những đặc tính riêng biệt làm chúng trở nên khác biệt với các virus đó. Đáng chú ý là enzyme polymerase của HBV thiếu đi chức năng đọc sửa, và virus này có một bước trung gian qua RNA (pgRNA) trong chu trình nhân lên của chúng. Hai đặc điểm này làm tăng khả năng xảy ra những sai số ngẫu nhiên trong suốt quá trình nhân lên của hệ gen virus, dẫn đến sự biến đổi của hệ gen [19, 51, 52].

Nói chung, tỉ lệ đột biến thay thế nucleotide của HBV ước tính vào khoảng 1,4 – 5,0 × 10−5 trên từng vị trí mỗi năm, gấp gần 10 lần so với những virus có bản chất hệ gen là DNA và RNA [76]. Mặt khác, nhờ vào cấu trúc xếp chồng phức tạp của các khung đọc mở (open reading frame - ORFs) trong hệ gen của HBV, thuận lợi cho việc phát sinh các biến dị [74, 77]. Đột biến ngẫu nhiên: Đột biến điểm ngẫu nhiên có thể xuất hiện ở những cá thể tùy thuộc vào áp lực chọn lọc khác nhau, như đã đề cập đến ở trên, hoặc xuất hiện trong quá trình nhân lên của hệ gen, phân cắt hoặc nối hệ gen virus hoặc quá trình ghép nối và sửa chữa của pgRNA [29, 98, 112]. Các đột biến ở những vùng khác nhau trên hệ gen xuất hiện xuyên suốt các pha đặc hiệu trong quá trình lây nhiễm, ví dụ như đột biến xảy ra ở vùng precore (đột biến PC), ở vùng lõi nền vùng khởi động (đột biến BCP), thêm hoặc mất ở gen C, preS1 hoặc preS2, thay thế yếu tố quyết định kháng nguyên ‘a’ của HBsAg, đột biến kháng thuốc lamivudine hay các loại thuốc kháng virus khác xảy ra ở protein Pol và đã được nghiên cứu xuyên suốt.

Những loại đột biến này giúp cho virus có thể sống dai dẳng trong các tế bào gan và có khả năng trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch và áp lực của điều trị.