Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng qui trình real time pcr phát hiện vi khuẩn rickettsia gây bệnh ở người

Nghiên cứu qui trình real time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hằng
• Người hướng dẫn: TS.BS Bùi Tiến Sỹ
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Qui Trình Real-Time PCR Phát Hiện Vi Khuẩn Rickettsia
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: Giới thiệu về Rickettsiaceae
• 1.1. Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae
• 1.2. Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra
• 1.3. Các vector lây truyền
• 1.4. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae
• 1.4.1. Spotted Fever Group
• 1.4.2. Scrub Typhus Group
• 1.5. Đặc điểm lâm sàng, cơ chế gây bệnh do Rickettsiaceae
• 1.5.1. Spotted fever Group
• 1.5.2. Scrub Typhus Group
• 1.6. Các phương pháp pháp chẩn đoán Rickettsiaceae
• 1.6.1. Phương pháp Weil – Felix
• 1.6.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập mầm bệnh
• 1.6.3. Phương pháp ELISA
• 1.6.4. Phương pháp kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
• 1.6.5. Phương pháp PCR, nested PCR
• 1.6.6. Phương pháp real-time PCR
• 1.7. Tình hình bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp thiết kế mồi, probe
• 2.5. Tách chiết ADN
• 2.6. Khuếch đại gen của vi khuẩn bằng phản ứng PCR
• 2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.8. Phương pháp giải trình tự xác định loài
• 2.9. Phương pháp nhân dòng
• 2.10. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR
• 2.11. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật real-time PCR
• 2.12. Áp dụng hai kĩ thuật real-time PCR để chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm O. tsutsugamushi và Rickettsia
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O. tsutsugamushi và các loài Rickettsia
• 3.2. Thiết kế primer, probe đặc hiệu cho phản ứng PCR, real-time PCR
• 3.3. Thiết kế plasmid chuẩn dương cho phản ứng real-time PCR
• 3.4. Đánh giá độ đặc hiệu của kĩ thuật real-time PCR
• 3.5. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật Real-time PCR
• 3.6. Ứng dụng real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae trên các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ
• 3.7. Một số đặc điểm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae
• 3.8. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae bằng kỹ thuật real-time PCR
• 3.9. Một số đặc điểm của bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về qui trình real time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia

Qui trình real-time PCR là một phương pháp hiện đại và hiệu quả trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia, một trong những tác nhân gây bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và điều trị kịp thời. Việc áp dụng real-time PCR giúp giảm thiểu thời gian chờ đợi kết quả và tăng cường độ nhạy, độ đặc hiệu trong chẩn đoán.

1.1. Định nghĩa và nguyên lý của phương pháp real time PCR

Real-time PCR, hay còn gọi là PCR định lượng, là một kỹ thuật cho phép theo dõi quá trình khuếch đại DNA trong thời gian thực. Nguyên lý hoạt động dựa trên việc sử dụng các mồi đặc hiệu và các chất phát huỳnh quang để phát hiện sự khuếch đại của DNA mục tiêu. Khi DNA được khuếch đại, tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên, cho phép xác định số lượng bản sao của DNA trong mẫu.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng real time PCR trong phát hiện Rickettsia

Sử dụng real-time PCR trong phát hiện vi khuẩn Rickettsia mang lại nhiều lợi ích. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phát hiện vi khuẩn ngay cả khi số lượng vi khuẩn trong mẫu rất thấp. Thời gian trả kết quả nhanh chóng, chỉ trong vài giờ, giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời. Hơn nữa, real-time PCR cũng giúp giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm trong quá trình xét nghiệm.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia

Việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia gặp nhiều thách thức do tính chất nội bào của chúng. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường không hiệu quả, vì Rickettsia không thể phát triển trong môi trường nuôi cấy thông thường. Hơn nữa, triệu chứng lâm sàng của bệnh do Rickettsia gây ra thường dễ nhầm lẫn với các bệnh truyền nhiễm khác, dẫn đến chẩn đoán sai. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán mới là rất cần thiết.

2.1. Những hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn và huyết thanh học có nhiều hạn chế. Nuôi cấy vi khuẩn Rickettsia rất khó khăn và nguy hiểm, trong khi huyết thanh học chỉ có thể phát hiện vi khuẩn sau một thời gian dài nhiễm bệnh. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn và làm tăng nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân.

2.2. Tình hình dịch tễ học và sự lây lan của Rickettsia

Dịch tễ học của bệnh do Rickettsia gây ra rất phức tạp. Vi khuẩn này có thể lây lan qua nhiều loại vector khác nhau, như ve và bọ chét, và có thể gây ra các đợt bùng phát dịch bệnh. Sự biến đổi của các chủng vi khuẩn cũng làm cho việc phát hiện và điều trị trở nên khó khăn hơn.

III. Phương pháp xây dựng qui trình real time PCR phát hiện Rickettsia

Qui trình real-time PCR để phát hiện vi khuẩn Rickettsia bao gồm nhiều bước quan trọng, từ việc thiết kế mồi cho đến phân tích kết quả. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cũng là một yếu tố quan trọng trong việc nâng cao hiệu suất của phương pháp.

3.1. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng PCR

Thiết kế mồi và probe là bước đầu tiên và quan trọng trong qui trình real-time PCR. Mồi cần phải đặc hiệu với gen mục tiêu của vi khuẩn Rickettsia, đảm bảo không phản ứng chéo với các gen khác. Việc lựa chọn vị trí thiết kế cũng cần phải dựa trên các trình tự gen đã được công bố để đảm bảo tính chính xác.

3.2. Tách chiết ADN và khuếch đại gen

Tách chiết ADN từ mẫu bệnh phẩm là bước tiếp theo trong qui trình. Các phương pháp tách chiết cần đảm bảo thu được ADN nguyên vẹn và không bị nhiễm bẩn. Sau đó, ADN sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR, trong đó điều kiện phản ứng cần được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất cao nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của qui trình real time PCR trong chẩn đoán Rickettsia

Qui trình real-time PCR đã được áp dụng thành công trong việc phát hiện vi khuẩn Rickettsia từ các mẫu bệnh phẩm tại nhiều cơ sở y tế. Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp chẩn đoán sớm và chính xác các trường hợp nhiễm Rickettsia. Điều này không chỉ giúp cải thiện kết quả điều trị mà còn giảm thiểu tỷ lệ biến chứng và tử vong.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng real time PCR

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng real-time PCR có thể phát hiện vi khuẩn Rickettsia trong các mẫu bệnh phẩm với độ nhạy lên đến 90%. Kết quả này cho thấy tiềm năng lớn của phương pháp trong việc chẩn đoán sớm và chính xác các trường hợp nhiễm bệnh.

4.2. Tác động của việc chẩn đoán sớm đến điều trị

Chẩn đoán sớm bệnh do Rickettsia có ý nghĩa rất lớn trong việc điều trị. Việc phát hiện kịp thời giúp bác sĩ có thể chỉ định điều trị đặc hiệu ngay từ đầu, từ đó giảm thiểu nguy cơ biến chứng và tử vong cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của qui trình real time PCR

Qui trình real-time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia đã chứng minh được hiệu quả và tính ứng dụng cao trong chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, vẫn cần tiếp tục nghiên cứu và cải tiến để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Tương lai, việc kết hợp real-time PCR với các công nghệ mới như giải trình tự gen có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện và điều trị bệnh do Rickettsia.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực chẩn đoán Rickettsia

Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh dựa trên real-time PCR, giúp nâng cao khả năng tiếp cận và giảm chi phí cho các cơ sở y tế. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu các chủng vi khuẩn mới cũng cần được chú trọng để đảm bảo tính chính xác trong chẩn đoán.

5.2. Tương lai của phương pháp real time PCR trong y học

Real-time PCR có tiềm năng lớn trong việc phát hiện nhiều loại mầm bệnh khác nhau. Việc áp dụng công nghệ này trong y học có thể giúp cải thiện đáng kể chất lượng chẩn đoán và điều trị bệnh truyền nhiễm, từ đó nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Rickettsiaceae gây ra là một trong những thách thức lớn đối với y tế toàn cầu, đặc biệt tại các vùng lưu hành ở Đông Nam Á. Ước tính mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp sốt mò (Scrub Typhus Group - STG) và hơn 1 tỷ người sống trong vùng có nguy cơ nhiễm bệnh. Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae được báo cáo khoảng 9,14%, trong đó nhóm Spotted Fever Group (SFG) chiếm 6,5%, Scrub Typhus Group chiếm 1,1% và Typhus Group chiếm 1,7%. Bệnh có biểu hiện lâm sàng đa dạng, dễ nhầm lẫn với các bệnh truyền nhiễm khác, gây khó khăn trong chẩn đoán và điều trị kịp thời. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như Weil-Felix, nuôi cấy vi khuẩn, ELISA, IFA đều có những hạn chế về độ nhạy, độ đặc hiệu hoặc thời gian trả kết quả. Do đó, việc phát triển kỹ thuật real-time PCR với độ nhạy và đặc hiệu cao, cho phép phát hiện sớm vi khuẩn Rickettsia và Orientia tsutsugamushi là rất cần thiết. Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng quy trình real-time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người, áp dụng trên các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 trong giai đoạn từ tháng 6/2016 đến tháng 9/2017. Nghiên cứu góp phần nâng cao khả năng chẩn đoán chính xác, nhanh chóng, từ đó hỗ trợ điều trị hiệu quả, giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong do bệnh gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình phân tử về vi khuẩn Rickettsiaceae, bao gồm ba nhóm chính: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG). Các khái niệm chính gồm:

• Vi khuẩn nội bào bắt buộc: Rickettsiaceae là vi khuẩn sống nội bào bắt buộc, không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo, sinh sản chậm, kích thước gen dao động từ 1-2,7 Mbp tùy loài.
• Gen đích phân tử: Gen gltA (mã hóa citrate synthase) được chọn làm gen đích cho Rickettsia do tính bảo thủ cao; gen 56kDa đặc hiệu cho O. tsutsugamushi, có khả năng biến đổi kháng nguyên cao, được dùng làm mục tiêu phát hiện.
• Phương pháp real-time PCR: Kỹ thuật khuếch đại ADN với tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận sau mỗi chu kỳ, cho phép định tính và định lượng chính xác, giảm nguy cơ ngoại nhiễm và rút ngắn thời gian chẩn đoán so với PCR truyền thống.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 87 mẫu bệnh phẩm máu và mô từ bệnh nhân nghi ngờ sốt do Rickettsiaceae tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 (6/2016 - 9/2017).
• Thiết kế mồi và probe: Thu thập trình tự gen gltA và 56kDa từ GenBank, thiết kế mồi và probe đặc hiệu theo nguyên tắc nhiệt độ gắn mồi, độ dài sản phẩm khuếch đại (75-200 bp), sử dụng phần mềm BioEdit và Clone Manager 9.
• Tách chiết ADN: Sử dụng kit tách chiết ADN máu và mô, quy trình chuẩn hóa với kiểm soát nội bộ.
• Khuếch đại gen: Thực hiện nested PCR và semi-nested PCR để xác định gen đích, sau đó tạo plasmid chuẩn dương.
• Phân tích real-time PCR: Thực hiện phản ứng với thành phần chuẩn, đánh giá độ đặc hiệu bằng mẫu đối chứng âm và dương, đánh giá độ nhạy qua pha loãng plasmid chuẩn dương với 50 lần lặp lại.
• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và thực hiện thí nghiệm trong 15 tháng, từ tháng 6/2016 đến tháng 9/2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế và xây dựng thành công kỹ thuật real-time PCR: Các cặp mồi và probe đặc hiệu cho gen gltA (Rickettsia) và 56kDa (O. tsutsugamushi) được thiết kế dựa trên 54 và 15 trình tự gen tham khảo, tạo ra sản phẩm khuếch đại 83 bp và 109 bp tương ứng.
2. Độ đặc hiệu cao: Thí nghiệm trên 9 mẫu ADN vi khuẩn khác nhau và mẫu ADN người khỏe mạnh không phát hiện tín hiệu dương tính, trong khi mẫu dương tính và plasmid chuẩn cho kết quả rõ ràng, chứng tỏ độ đặc hiệu đạt gần 100%.
3. Độ nhạy và lặp lại tốt: Ngưỡng phát hiện tối thiểu là 1 bản sao/µl plasmid chuẩn, với 50 lần lặp lại cho thấy tỷ lệ dương tính trên 95%, đảm bảo độ nhạy cao cho chẩn đoán sớm.
4. Tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae trên mẫu bệnh phẩm: Áp dụng real-time PCR trên 87 mẫu bệnh phẩm, tỷ lệ dương tính với Rickettsiaceae là khoảng 20-30%, trong đó O. tsutsugamushi chiếm phần lớn, phù hợp với đặc điểm dịch tễ tại Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Kỹ thuật real-time PCR phát triển trong nghiên cứu đã khắc phục được các hạn chế của phương pháp chẩn đoán truyền thống như Weil-Felix, ELISA hay PCR nested, nhờ khả năng phát hiện sớm, độ nhạy và đặc hiệu cao. So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả tương đồng với báo cáo của Kramme và cộng sự (2009) tại Việt Nam và các nghiên cứu khu vực Đông Nam Á. Việc sử dụng gen gltA và 56kDa làm mục tiêu khuếch đại được chứng minh là phù hợp, giúp phân biệt chính xác các nhóm vi khuẩn gây bệnh. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường chuẩn tuyến tính của plasmid chuẩn, biểu đồ tỷ lệ dương tính theo giới tính, độ tuổi và địa lý, giúp minh họa rõ ràng phân bố bệnh. Nghiên cứu góp phần nâng cao năng lực chẩn đoán tại các cơ sở y tế, đặc biệt trong bối cảnh bệnh có biểu hiện lâm sàng không đặc hiệu và dễ nhầm lẫn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai kỹ thuật real-time PCR tại các bệnh viện tuyến tỉnh: Đào tạo nhân viên và trang bị máy móc để áp dụng kỹ thuật này, nhằm nâng cao khả năng chẩn đoán sớm, giảm tỷ lệ tử vong do Rickettsiaceae trong vòng 1-2 năm tới.
2. Xây dựng quy trình chuẩn và hướng dẫn kỹ thuật: Ban hành tài liệu hướng dẫn chi tiết về lấy mẫu, bảo quản, tách chiết ADN và thực hiện real-time PCR, đảm bảo tính đồng nhất và chính xác trong chẩn đoán.
3. Tăng cường giám sát dịch tễ học: Sử dụng kết quả real-time PCR để theo dõi tình hình lưu hành bệnh, phân tích xu hướng theo mùa, địa lý, từ đó đề xuất các biện pháp phòng chống phù hợp.
4. Nghiên cứu mở rộng về đa dạng chủng loại vi khuẩn: Phát triển thêm các bộ mồi và probe cho các loài Rickettsia khác, nâng cao khả năng phát hiện đa dạng tác nhân gây bệnh, phục vụ cho nghiên cứu và chẩn đoán toàn diện.
5. Hợp tác liên ngành và quốc tế: Kết nối với các trung tâm nghiên cứu trong khu vực để trao đổi dữ liệu, cập nhật kỹ thuật mới, nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia truyền nhiễm: Nắm bắt kỹ thuật chẩn đoán mới, nâng cao khả năng phát hiện sớm và điều trị hiệu quả bệnh do Rickettsiaceae.
2. Nhân viên phòng xét nghiệm y học phân tử: Áp dụng quy trình real-time PCR chuẩn, đảm bảo kết quả chính xác, giảm sai sót trong chẩn đoán.
3. Nhà nghiên cứu dịch tễ học và vi sinh y học: Sử dụng dữ liệu và phương pháp nghiên cứu để phân tích dịch tễ, phát triển các nghiên cứu sâu hơn về đa dạng chủng loại và cơ chế bệnh sinh.
4. Cơ quan quản lý y tế và hoạch định chính sách: Dựa trên kết quả nghiên cứu để xây dựng chiến lược phòng chống bệnh truyền nhiễm, phân bổ nguồn lực hợp lý và nâng cao năng lực chẩn đoán tại các tuyến y tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Real-time PCR có ưu điểm gì so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống?
   Real-time PCR cho kết quả nhanh, độ nhạy và đặc hiệu cao, giảm nguy cơ ngoại nhiễm và có khả năng định lượng vi khuẩn trong mẫu, giúp chẩn đoán sớm và chính xác hơn so với Weil-Felix hay ELISA.

2. Tại sao chọn gen gltA và 56kDa làm mục tiêu phát hiện?
   Gen gltA có tính bảo thủ cao giữa các loài Rickettsia, giúp phát hiện đa dạng chủng; gen 56kDa đặc hiệu cho O. tsutsugamushi, có khả năng phân biệt chính xác nhờ tính biến đổi kháng nguyên đặc trưng.

3. Phương pháp tách chiết ADN có ảnh hưởng đến kết quả không?
   Có, quy trình tách chiết ADN chuẩn, sử dụng kit chuyên dụng và kiểm soát nội bộ giúp đảm bảo chất lượng ADN, từ đó nâng cao độ chính xác của phản ứng real-time PCR.

4. Kỹ thuật real-time PCR có thể áp dụng ở đâu?
   Phù hợp cho các phòng xét nghiệm y học phân tử tại bệnh viện tuyến trung ương và tuyến tỉnh có trang thiết bị phù hợp, giúp mở rộng khả năng chẩn đoán trên diện rộng.

5. Làm thế nào để giảm tỷ lệ dương tính giả trong real-time PCR?
   Thiết kế mồi và probe đặc hiệu, sử dụng quy trình chuẩn, kiểm soát chất lượng mẫu và thực hiện phản ứng trong điều kiện vô trùng giúp giảm thiểu dương tính giả.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình real-time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia và O. tsutsugamushi với độ nhạy và đặc hiệu cao.
• Kỹ thuật này cho phép phát hiện sớm, chính xác các tác nhân gây bệnh, hỗ trợ điều trị kịp thời, giảm biến chứng và tử vong.
• Nghiên cứu cung cấp dữ liệu dịch tễ học quan trọng về tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae tại Việt Nam trong giai đoạn 2016-2017.
• Đề xuất triển khai kỹ thuật tại các cơ sở y tế tuyến tỉnh, xây dựng quy trình chuẩn và tăng cường giám sát dịch tễ học.
• Khuyến khích hợp tác nghiên cứu mở rộng và cập nhật kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh truyền nhiễm do Rickettsiaceae.

Hành động tiếp theo là triển khai đào tạo kỹ thuật real-time PCR cho các phòng xét nghiệm, đồng thời tiến hành nghiên cứu mở rộng trên diện rộng để cập nhật tình hình dịch tễ và đa dạng chủng loại vi khuẩn gây bệnh. Các chuyên gia và cơ sở y tế được khuyến khích áp dụng quy trình này nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị bệnh truyền nhiễm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh truyền nhiễm luôn nhận được sự quan tâm của nền y tế toàn cầu. Những mầm bệnh trước đây đã được kiểm soát nhưng nay thường xuyên biến đổi kết hợp với các căn nguyên mới xuất hiện gây khó khăn cho kiểm soát dịch bệnh cũng như điều trị bệnh truyền nhiễm. Theo CDC 4470 ca bệnh Spotted fever group được báo cáo ở Mỹ năm 2012, 18000 trường hợp Scrub typhus group (sốt mò) được báo cáo trong chiến tranh thế giới thứ II. Trong thời gian gần đây, ước tính mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp sốt mò và có tới 1 tỷ người sống trong các vùng lưu hành bệnh có nguy cơ lây nhiễm thì Rickettsia là căn nguyên gây bệnh đáng được chú ý.

Rickettsia được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn nội bào bắt buộc không thể nhận dạng bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Dựa trên đặc điểm hình thái, kháng nguyên, và chuyển hóa, Rickettsia được phân loại thành các nhóm sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG). Dựa vào các tác nhân gây bệnh khác nhau cùng với các cơ chế lan truyền, phân bố địa lý, sự hạn chế trong việc chẩn đoán, tình hình dịch tễ học và đánh giá về mức độ nghiêm trọng của bệnh do Rickettsiaceae gây ra trong khu vực Đông Nam Á được xem là một thách thức khó khăn. Hàng trăm trường hợp tử vong và hàng ngàn trường hợp nhiễm bệnh đã không được chẩn đoán.

Việc chẩn đoán bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam vẫn chủ yếu dựa vào lâm sàng và yếu tố dịch tễ. Bệnh do Rickettsiaceae có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng dễ nhầm lẫn với nhiều bệnh truyền nhiễm khác. Thêm vào đó, bệnh có thể để lại những biến chứng thần kinh nặng nề và có thể gây tử vong cho bệnh nhân. Do vậy, chẩn đoán xác định căn nguyên gây bệnh sớm và chính xác để điều trị sớm có ý nghĩa rất lớn.

Các xét nghiệm chẩn đoán mầm bệnh đã được áp dụng như phương pháp huyết thanh học (phản ứng Weil – Felix), nhưng phương pháp này còn nhiều hạn chế, chỉ chẩn đoán được một vài loài nhất định và dễ xảy ra các phản ứng chéo gây sai lệch kết quả. Phương pháp phân lập mầm bệnh bằng tiêm truyền mầm bệnh, phương pháp này nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn trong tế bào động vật rất khó và nguy TIEU LUAN MOI download : [e-mail] hiểm cho người thực hiện thí nghiệm. Các phương pháp gần đây như ELISA, IFA thao tác dễ, tiết kiệm chi phí, tuy nhiên các phương pháp này chẩn đoán được khi thời gian nhiễm vi khuẩn từ 15-26 ngày, hạn chế trong việc chẩn đoán sớm. Từ đó đặt ra nhu cầu cần những phương pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian trả lời kết quả sớm.

Phương pháp real-time PCR trong chẩn đoán Rickettsiaceae gây bệnh ở người đã cho những kết quả khả quan. Phương pháp này sẽ giúp xác định sớm, chính xác mầm bệnh, định hướng thầy thuốc lâm sàng điều trị đặc hiệu kịp thời, làm giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong của bệnh do Rickettsiaceae. Chính vì những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình real-time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người.” Với hai mục tiêu chính: 1. Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O.

tsutsugamushi và các loài Rickettsia. Áp dụng kĩ thuật real-time PCR xác định các mầm bệnh gây sốt Rickettsiaceae trên mẫu bệnh phẩm thu thập được tại Bệnh viện Trung ương quân đội 108 từ tháng 6/2016 - tháng 9/2017. TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Chƣơng 1. Giới thiệu về Rickettsiaceae 1.

Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae Rickettsia được biết đến như là các căn nguyên gây bệnh ở động vật có xương sống với các vectơ truyền bệnh thuộc nhóm động vật chân đốt. Trước đây Rickettsia được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn không thể nhận dạng bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Rickettsia được đặt tên sau khi nhà bệnh học Howard Taylor Ricketts phát hiện ra mầm bệnh sốt phát ban (1906) và ông bị chết vì nhiễm bệnh này trong thời gian nghiên cứu [20]. Bằng sự phát triển của các kỹ thuật phân tử gần đây, sự phân loại các loài Rickettsia có sự thay đổi lớn.

Rickettsia tsutsugamushi đã được chứng minh đủ điều kiện để phân loại thành một chi mới là Orientia [65]. Dựa trên đặc điểm hình thái, kháng nguyên và chuyển hóa, Rickettsia được phân loại thành hai nhóm bệnh: Spotted Fever Group (SFG) và Typhus Group (TG); Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là bệnh sốt mò ở Việt Nam. Theo nghiên cứu của Bechah và cộng sự (2008), chi Rickettsia có 24 loài gây bệnh và Orientia chỉ có một loài duy nhất là Orientia tsutsugamushi (Rickettsia tsutsugamushi). Phân loại các loài Rickettsiaceae được thể hiện như hình 1.1: Phân loại Rickettsiaceae 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.2: Hình ảnh Rickettsia trong tế bào vật chủ [71] Các vi khuẩn trong chi Rickettsia là các loài sống nội bào bắt buộc có chiều dài khoảng 0,8 - 2,0 µm, chiều rộng khoảng 0,3 - 0,5 µm, đa hình thái, hình dạng thay đổi qua các giai đoạn phát triển: cầu khuẩn đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi có khi xếp thành chuỗi ngắn hoặc từng đám trong hoặc ngoài tế bào.

Tế bào chất của các vi khuẩn này chứa ribosome, các sợi ADN và được bao bọc bởi cấu trúc của tế bào Gram âm điển hình với một lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide ở màng ngoài, nhưng không có tiên mao [53]. Bộ gene của các loài thuộc Rickettsia là một ADN đơn dạng vòng, có kích thước lên đến 1-1,4Mbp. Có khoảng 900 - 1500 gene tùy loài, trong đó có 704 protein và 39 RNA chung cho tất cả các loài [4, 45]. Gen đầu tiên được sử dụng cho mục đích phát sinh loài là 16S rDNA [55].

Sau đó, nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các trình tự gen khác bao gồm gltA (gen mã hóa tổng hợp citrate) [57], gen mã hóa protein 17kDa [3] và nhóm gen kháng nguyên bề mặt tế bào (SCA): ompA, ompB, sca4, sca1 và sca2 [18, 44, 56, 43]. Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự gen mã hóa protein 17kDa không cho nhiều giá trị ý nghĩa. Ngược lại, dựa trên trình tự gen gltA có thể xây dựng mối quan hệ phát sinh loài. tsutsugamushi là vi khuẩn có chiều rộng khoảng 0,5 µm và chiều dài từ 1,2 đến 3,0µm, lớn hơn so với các vi khuẩn nhóm SFG và TG [24].

Hơn nữa cấu tạo tế bào của O. tsutsugamushi bị thiếu lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide khác với các loài Rickettsia khác [2]. tsutsugamushi có kích thước hệ gen dao động từ 2,0 đến 2,7 Mb bao gồm 1967 trình tự mã hóa protein và khoảng 46,7% là các trình tự lặp lại [41]. tsutsugamushi chứa nhiều biến thể kháng nguyên, bao gồm Gilliam, 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Kato, Karp, Kawasaki, Kuroki và các loại khác.

Sự thay đổi kháng nguyên này phụ thuộc phần lớn vào sự đa dạng của kháng nguyên đặc hiệu loài 56kDa (TSA) nằm trên bề mặt của màng vi khuẩn [52]. Với một khung đọc mở (ORF) là 1600 bp, TSA 56kDa gồm có 516-541 amino axit và tham gia vào việc xâm nhập vào tế bào chủ thông qua sự kết hợp của fibronektyin. Có bốn domain biến thể trong vùng này, các domain biến thể (VD) I-IV, chịu trách nhiệm về mức độ biến đổi kháng nguyên lớn ở gen [37]. Họ vi khuẩn Rickettsiaceae sinh sản bằng hình thức chia đôi giống như vi khuẩn.

Tuy nhiên tốc độ sinh sản chậm so với vi khuẩn và virut khác. Trong nuôi cấy tế bào, thời gian 1 thế hệ là 8-10 giờ ở nhiệt độ 32-35oC [53]. Dịch tễ học của các bệnh ở người do Rickettsiaceae gây ra liên quan đến đặc điểm sinh học của vectơ truyền bệnh. Bệnh do Rickettsiaceae rất khác nhau ở mức độ nghiêm trọng từ bệnh nhẹ không cần điều trị đến việc nhiễm trùng đe dọa tính mạng.

Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra Các bệnh gây ra bởi các sinh vật trong nhóm Rickettsiaceae được công nhận và có thể được chia thành 3 nhóm bệnh sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG) [73]. - Nhóm bệnh SFG được chia theo từng bệnh như sau: Rocky Mountain spotted fever (RMSF) do Rickettsia rickettsii gây bệnh; Rickettsialpox do Rickettsia akari gây ra; Boutonneuse fever,… - Nhóm bệnh TG có đặc điểm dịch tễ học giống nhau, do các loài vi khuẩn Rickettsia prowazekii và Rickettsia typhi là căn nguyên gây bệnh chính: Louse- borne typhus, Brill-Zinsser disease, Murine typhus,… - Tác nhân gây bệnh sốt mò (STG) chỉ có một loài duy nhất là O. tsutsugamushi, có ba kiểu huyết thanh học chủ yếu là Karp, Gilliam, Kato. Các vector lây truyền Vật chủ mà Rickettsiaceae kí sinh rất đa dạng, tất cả các loài đều có liên quan đến động vật chân đốt.

Một số loài Rickettsiaceae có thể lan truyền trong động vật có xương sống, một số loài gây bệnh ở người và động vật, do chúng lây truyền 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] bởi các động vật chân đốt như bọ chét, chấy, chấy hoặc ve và hiện nay các loài Rickettsiaceae đã được công bố gần như trên toàn thế giới [49]. Cho đến nay ve, rận và bọ chét trong giới Ixodidea, Phtiraptera, và Siphonaptera tương ứng được biết đến như là các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia. Năm 2012, Socolovschi và cộng sự cho rằng muỗi cũng là một trong số các vector lây truyền R. felis đáng chú ý [62].

Mò Leptotrombidium là vector truyền bệnh của vi khuẩn thuộc chi Orientia [25]. Động vật chân đốt đồng thời cũng là ổ chứa và nơi nhân lên của vi khuẩn chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc lây lan. Tuy nhiên cách thức lây truyền từ động vật chân đốt sang người là khác nhau. Vi khuẩn lây nhiễm vào vật chủ qua nước bọt, vết đốt của côn trùng như ve, bét, chấy rận hoặc mò mạt.

Ngoài ra chúng còn được truyền qua phân qua vết xước ở da vật chủ [50]. Rickettsia và Orientia lây nhiễm sang các tế bào da như lớp nội mạc mạch máu (tế bào bị nhiễm chính), nguyên bào sợi, tế bào nội mô bạch huyết và đại thực bào.3: Các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia [38] Các loài Rickettsiaceae được duy trì trong tự nhiên bằng cách truyền trực tiếp hay gián tiếp tới những con bọ không nhiễm bệnh thông qua đường ruột những con bọ này khi đốt nhưng loài gặm nhấm hay động vật khác bị nhiễm Rickettsiaceae (hình 1. 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.4: Chu kỳ nhiễm bệnh Sốt Mò 1. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae.

Bệnh sốt do Rickettsiaceae được tìm thấy ở mọi châu lục trừ Nam Cực [17] Hình 1.5: Phân bố các loài Rickettsiaceae gây bệnh.