Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh vibrio choleare trong nguồn nước sinh hoạt

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh vibrio choleare trong nguồn nước sinh hoạt, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn

• Tác giả: Trần Thị Thanh Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Tâm Thư
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Que Thử Phát Hiện Nhanh Vibrio cholerae Trong Nước
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về Vibrio cholerae
• 1.2. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học
• 1.3. Khả năng gây bệnh
• 1.4. Tình hình dịch bệnh tả
• 1.5. Các phương pháp xác định Vibrio cholerae
• 1.5.1. Phương pháp soi kính
• 1.5.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập
• 1.5.3. Phương pháp xác định nhóm huyết thanh
• 1.5.4. Phương pháp PCR
• 1.5.5. Phương pháp lai khuẩn lạc với đầu dò DNA hoặc RNA
• 1.5.6. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ
• 1.5.7. Phương pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang trực tiếp - Đếm trực tiếp
• 1.5.8. Phương pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp
• 1.5.9. Phương pháp ELISA
• 1.5.10. Phương pháp sắc ký miễn dịch
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 2.2. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Lấy mẫu để phân lập vi khuẩn
• 2.3.2. Phân lập Vibrio cholerae
• 2.3.3. Xác định trình tự gen 16S rARN của chủng vi khuẩn phân lập được
• 2.3.4. Xác định môi trường dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V.
• 2.3.5. Đánh giá phản ứng giữa V. cholerae - kháng thể bằng phương pháp ELISA
• 2.3.6. Phương pháp cố định kháng thể lên màng nitrocellulose
• 2.3.7. Phương pháp cộng hợp vàng vào kháng thể
• 2.3.8. Xác định nồng độ tối ưu của kháng thể gắn lên màng nitrocellulose
• 2.3.9. Phân tích mẫu bằng que thử
• 2.3.10. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của que thử
• 2.3.11. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của que thử
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập vi khuẩn V.
• 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn V. cholerae từ một số nguồn ô nhiễm
• 3.3. Xác định trình tự gen 16S rARN của chủng vi khuẩn phân lập được
• 3.4. Xác định môi trường dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V.
• 3.5. Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể phù hợp bằng phương pháp ELISA để phát hiện vi khuẩn V.
• 3.6. Chế tạo que thử phát hiện V. cholerae trong nguồn nước sinh hoạt
• 3.6.1. Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose
• 3.6.2. Tạo dung dịch hạt vàng có kích thước nano và cộng hợp vào kháng thể
• 3.6.3. Tối ưu nồng độ kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng
• 3.6.4. Tối ưu nồng độ kháng thể gắn lên vạch thử nghiệm
• 3.7. Đánh giá một số chỉ tiêu kỹ thuật của que thử
• 3.7.1. Ngưỡng và thời gian phát hiện
• 3.7.2. Đánh giá độ đặc hiệu của que thử
• HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae trong nước

Que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae trong nước là một công cụ quan trọng trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm và nước sinh hoạt. Vi khuẩn Vibrio cholerae là tác nhân chính gây ra bệnh tả, một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Việc phát hiện sớm sự có mặt của vi khuẩn này trong nguồn nước giúp ngăn chặn sự bùng phát dịch bệnh. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường tốn thời gian và không thể áp dụng nhanh chóng tại hiện trường. Do đó, que thử phát hiện nhanh đã được phát triển để đáp ứng nhu cầu này.

1.1. Đặc điểm của Vibrio cholerae và nguy cơ gây bệnh

Vibrio cholerae là vi khuẩn gram âm, có hình dạng cong như dấu phẩy. Chúng có khả năng gây bệnh tả, một bệnh nhiễm trùng cấp tính, lây lan nhanh chóng qua nước và thực phẩm ô nhiễm. Thời gian ủ bệnh ngắn, từ 2 đến 5 ngày, có thể dẫn đến tình trạng mất nước nghiêm trọng và tử vong nếu không được điều trị kịp thời.

1.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện nhanh Vibrio cholerae

Việc phát hiện nhanh Vibrio cholerae trong nước là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Các phương pháp phát hiện truyền thống thường không đủ nhanh để ứng phó với các tình huống khẩn cấp. Que thử phát hiện nhanh giúp xác định sự có mặt của vi khuẩn trong thời gian ngắn, từ đó có biện pháp xử lý kịp thời.

II. Vấn đề và thách thức trong việc phát hiện Vibrio cholerae

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện Vibrio cholerae, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc áp dụng chúng. Các phương pháp như PCR và ELISA yêu cầu thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ cao, điều này hạn chế khả năng sử dụng tại hiện trường. Hơn nữa, việc phát hiện vi khuẩn trong môi trường nước có thể gặp khó khăn do nồng độ vi khuẩn thấp và sự hiện diện của các vi sinh vật khác.

2.1. Những hạn chế của các phương pháp truyền thống

Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường mất nhiều thời gian và không thể phát hiện nhanh chóng. Điều này có thể dẫn đến sự bùng phát dịch bệnh nếu không có biện pháp kịp thời.

2.2. Khó khăn trong việc phát hiện vi khuẩn trong nước

Nồng độ Vibrio cholerae trong nước thường rất thấp, điều này làm cho việc phát hiện trở nên khó khăn. Hơn nữa, sự hiện diện của các vi sinh vật khác có thể gây nhiễu trong quá trình phát hiện.

III. Phương pháp chế tạo que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae

Que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae được chế tạo dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch. Phương pháp này cho phép phát hiện vi khuẩn trong thời gian ngắn, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng que thử có thể phát hiện vi khuẩn ở nồng độ từ 10^6 đến 10^7 CFU/ml.

3.1. Nguyên lý hoạt động của que thử

Que thử hoạt động dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch, trong đó kháng thể được cố định trên màng nitrocellulose. Khi mẫu nước được thêm vào, nếu có sự hiện diện của Vibrio cholerae, sẽ xảy ra phản ứng tạo thành vạch màu trên que thử.

3.2. Quy trình chế tạo que thử

Quy trình chế tạo que thử bao gồm các bước như cố định kháng thể lên màng, tạo dung dịch hạt vàng nano và tối ưu nồng độ kháng thể. Các bước này cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử.

IV. Ứng dụng thực tiễn của que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae

Que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu và thực tiễn. Chúng cho phép phát hiện vi khuẩn trong các mẫu nước sinh hoạt, từ đó giúp các cơ quan chức năng có biện pháp xử lý kịp thời. Việc sử dụng que thử cũng giúp nâng cao nhận thức của cộng đồng về an toàn thực phẩm và nước uống.

4.1. Kết quả nghiên cứu về độ nhạy và độ đặc hiệu

Nghiên cứu cho thấy que thử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện Vibrio cholerae trong các mẫu nước ô nhiễm. Điều này chứng tỏ que thử là một công cụ hữu ích trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm.

4.2. Ứng dụng trong kiểm soát an toàn thực phẩm

Que thử có thể được sử dụng tại các cơ sở chế biến thực phẩm, chợ, và nhà hàng để kiểm tra nhanh sự có mặt của Vibrio cholerae. Điều này giúp ngăn chặn sự lây lan của bệnh tả và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và tương lai của que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae

Que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae là một bước tiến quan trọng trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm và nước sinh hoạt. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, que thử có thể giúp phát hiện vi khuẩn trong thời gian ngắn, từ đó có biện pháp xử lý kịp thời. Tương lai của que thử này hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Triển vọng phát triển que thử trong tương lai

Nghiên cứu và phát triển que thử sẽ tiếp tục được đẩy mạnh để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu. Các công nghệ mới có thể được áp dụng để nâng cao hiệu quả của que thử trong việc phát hiện vi khuẩn.

5.2. Vai trò của que thử trong phòng chống dịch bệnh

Que thử phát hiện nhanh sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc phòng chống dịch bệnh, đặc biệt là trong các tình huống khẩn cấp. Việc sử dụng que thử sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện và ứng phó với các dịch bệnh do Vibrio cholerae gây ra.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tả do vi khuẩn Vibrio cholerae gây ra là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có khả năng bùng phát dịch nhanh và gây tử vong cao nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm trên toàn cầu có khoảng 3 - 5 triệu trường hợp mắc bệnh tả và khoảng 100.000 trường hợp tử vong. Ở Việt Nam, bệnh tả đã xuất hiện từ năm 1850 và từng bùng phát thành dịch lớn, đặc biệt là đợt dịch năm 2007 tại 19 tỉnh, thành phố phía Bắc với hàng ngàn ca mắc. Vi khuẩn V. cholerae tồn tại trong nguồn nước sinh hoạt và thực phẩm, là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm và bệnh tiêu chảy cấp tính.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là chế tạo que thử phát hiện nhanh vi khuẩn Vibrio cholerae trong nguồn nước sinh hoạt, nhằm cung cấp công cụ phát hiện đơn giản, nhanh chóng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp với điều kiện hiện trường và các cơ sở y tế, phòng chống dịch bệnh. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các mẫu nước sinh hoạt tại một số địa phương như đầm tôm Hải Phòng và nước thoát cống Hà Nội trong giai đoạn nghiên cứu năm 2018. Việc phát triển que thử sắc ký miễn dịch giúp rút ngắn thời gian phát hiện từ vài ngày xuống còn 5-10 phút, góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh tả và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

• Đặc điểm sinh học và phân loại của Vibrio cholerae: Vi khuẩn gram âm, hình que cong, di động nhờ roi, phát triển tốt trong môi trường kiềm pH 8-9,5 và nhiệt độ 16-42°C. Có khoảng 200 nhóm huyết thanh, trong đó nhóm O1 và O139 là tác nhân gây dịch tả.
• Cơ chế gây bệnh của V. cholerae: Vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non, tiết độc tố cholera (CTX) gồm tiểu phần A và B, làm tăng AMP vòng nội bào, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước nghiêm trọng.
• Phương pháp sắc ký miễn dịch (Immunochromatography test): Dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, que thử sử dụng màng nitrocellulose cố định kháng thể bắt giữ và kháng thể phát hiện gắn hạt nano vàng, cho kết quả nhanh trong 5-10 phút với độ nhạy cao.
• Khái niệm về độ nhạy và độ đặc hiệu: Độ nhạy thể hiện khả năng phát hiện đúng mẫu dương tính, độ đặc hiệu thể hiện khả năng loại trừ mẫu âm tính không liên quan.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu nước sinh hoạt được lấy ngẫu nhiên tại đầm tôm Hải Phòng và nước thoát cống Hà Nội theo tiêu chuẩn TCVN 8880:2011.
• Phương pháp phân tích:
  • Phân lập vi khuẩn trên môi trường chọn lọc thạch TCBS, xác định gen 16S rRNA bằng PCR và giải trình tự để định danh chính xác chủng V. cholerae.
  • Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn trong môi trường pepton kiềm pH 8,5 để đạt nồng độ 10^6 - 10^7 CFU/ml, phù hợp ngưỡng phát hiện của que thử.
  • Đánh giá phản ứng bắt cặp kháng nguyên-kháng thể bằng ELISA để lựa chọn cặp kháng thể đơn dòng phù hợp (KT1, KT2) và kháng thể đa dòng kiểm chứng (KT3).
  • Chế tạo que thử sắc ký miễn dịch với màng nitrocellulose cố định kháng thể, cộng hợp kháng thể phát hiện với hạt nano vàng kích thước ~20 nm.
  • Tối ưu nồng độ kháng thể cố định trên màng và kháng thể cộng hợp vàng để đảm bảo tín hiệu rõ nét, tiết kiệm chi phí.
  • Đánh giá ngưỡng phát hiện, thời gian phát hiện và độ đặc hiệu của que thử với các chủng V. cholerae và vi khuẩn gây bệnh khác.
• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện trong năm 2018, bao gồm các bước lấy mẫu, phân lập, nuôi cấy, chế tạo que thử và đánh giá kỹ thuật.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và định danh vi khuẩn V. cholerae: Từ các mẫu nước đầm tôm Hải Phòng và nước thoát cống Hà Nội, đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn có đặc điểm khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy 2 chủng có độ tương đồng 99% với V. cholerae O1, chủng còn lại tương đồng 65%, xác nhận thành công vi khuẩn mục tiêu (Hình 3.4).

2. Môi trường nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn: Môi trường pepton kiềm pH 8,5 được xác định là môi trường tối ưu để tăng sinh V. cholerae chuẩn và chủng phân lập, đạt nồng độ 10^6 - 10^7 CFU/ml sau 8 giờ nuôi cấy, cao hơn so với môi trường LB kiềm và canh thang kiềm (Hình 3.5 - 3.7).

3. Lựa chọn cặp kháng thể phát hiện: Phương pháp ELISA cho thấy kháng thể đơn dòng KT1 và KT2 đều bắt cặp tốt với vi khuẩn V. cholerae và kháng thể đa dòng KT3, cho phép sử dụng KT3 làm kháng thể kiểm chứng, KT1 hoặc KT2 làm kháng thể phát hiện (Hình 3.8).

4. Chế tạo và tối ưu que thử sắc ký miễn dịch: Kháng thể KT3 được cố định lên màng nitrocellulose với nồng độ tối ưu 0,2 µg/mm, kháng thể KT1 hoặc KT2 cố định tại vị trí vạch thử nghiệm với nồng độ 0,2 µg/mm. Hạt nano vàng kích thước ~20 nm được cộng hợp thành công với kháng thể phát hiện, đảm bảo di chuyển tốt trên màng sau xử lý phủ BSA 1% và SDS 0,05% (Hình 3.9 - 3.14).

5. Đánh giá ngưỡng và thời gian phát hiện: Que thử loại 1 (KT1 phát hiện, KT2 bắt giữ) phát hiện được V. cholerae ở ngưỡng 10^5 CFU/ml trong 5 phút, que thử loại 2 phát hiện ở ngưỡng 10^6 CFU/ml. Sau 6-8 giờ nuôi cấy tăng sinh, que thử có thể phát hiện vi khuẩn ở nồng độ 3-4 CFU/ml, phù hợp với yêu cầu phát hiện nhanh tại hiện trường (Hình 3.15 - 3.16, Bảng 3.1).

6. Độ đặc hiệu của que thử: Que thử không phản ứng chéo với các vi khuẩn gây bệnh khác như Salmonella, Shigella, Listeria, Klebsiella, Staphylococcus aureus, đảm bảo độ đặc hiệu kỹ thuật cao.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các công trình quốc tế về phát triển que thử sắc ký miễn dịch phát hiện V. cholerae với ngưỡng phát hiện từ 10^6 - 10^7 CFU/ml sau nuôi cấy. Việc lựa chọn môi trường pepton kiềm giúp tăng sinh vi khuẩn hiệu quả, nâng cao độ nhạy của que thử. Sự kết hợp kháng thể đơn dòng và đa dòng tạo nên hệ thống phát hiện đặc hiệu, giảm thiểu phản ứng không đặc hiệu.

So sánh với phương pháp PCR, que thử sắc ký miễn dịch có ưu điểm về thời gian nhanh (5-10 phút so với vài giờ), thao tác đơn giản, không cần thiết bị phức tạp, phù hợp với điều kiện hiện trường và các cơ sở y tế tuyến cơ sở. Tuy nhiên, que thử yêu cầu bước nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn để đạt ngưỡng phát hiện, điều này cần được cân nhắc trong ứng dụng thực tế.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tăng sinh vi khuẩn trên các môi trường khác nhau, bảng so sánh ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu của que thử, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả kỹ thuật.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai ứng dụng que thử tại các cơ sở y tế tuyến cơ sở và hiện trường: Đào tạo nhân viên y tế sử dụng que thử để phát hiện nhanh V. cholerae trong nguồn nước sinh hoạt, giảm thời gian chẩn đoán và xử lý dịch bệnh. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng.

2. Phát triển bộ kit hoàn chỉnh tích hợp bước nuôi cấy tăng sinh: Thiết kế bộ kit bao gồm môi trường pepton kiềm và que thử sắc ký miễn dịch, giúp người dùng dễ dàng thực hiện tại hiện trường. Chủ thể thực hiện: các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

3. Mở rộng nghiên cứu phát hiện các chủng V. cholerae khác và vi sinh vật gây bệnh đường ruột: Nâng cao phạm vi ứng dụng que thử, tăng cường kiểm soát dịch bệnh đường tiêu hóa. Thời gian nghiên cứu: 1-2 năm.

4. Tăng cường giám sát và kiểm tra chất lượng nguồn nước sinh hoạt: Sử dụng que thử làm công cụ sàng lọc nhanh, phối hợp với các phương pháp xét nghiệm chuyên sâu để đảm bảo an toàn vệ sinh môi trường. Chủ thể thực hiện: cơ quan y tế, quản lý môi trường.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhân viên y tế tuyến cơ sở và cán bộ phòng chống dịch: Nắm bắt công nghệ phát hiện nhanh vi khuẩn V. cholerae, áp dụng trong giám sát dịch tễ và xử lý kịp thời các ổ dịch.

2. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học, vi sinh vật học, công nghệ sinh học: Tham khảo phương pháp chế tạo que thử sắc ký miễn dịch, kỹ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn, ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm sinh học.

3. Doanh nghiệp sản xuất thiết bị y tế và kit xét nghiệm: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh, mở rộng thị trường trong lĩnh vực y tế và an toàn thực phẩm.

4. Cơ quan quản lý môi trường và an toàn thực phẩm: Sử dụng que thử làm công cụ kiểm tra nhanh chất lượng nước sinh hoạt, thực phẩm, góp phần nâng cao hiệu quả quản lý và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Que thử phát hiện Vibrio cholerae hoạt động dựa trên nguyên lý nào?
   Que thử sử dụng phương pháp sắc ký miễn dịch, dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên trên bề mặt vi khuẩn và kháng thể đơn dòng được cố định trên màng nitrocellulose, kết hợp với kháng thể phát hiện gắn hạt nano vàng để tạo vạch màu dễ quan sát.

2. Ngưỡng phát hiện của que thử là bao nhiêu và thời gian cho kết quả?
   Que thử loại 1 có ngưỡng phát hiện khoảng 10^5 CFU/ml, cho kết quả rõ nét trong vòng 5 phút. Sau bước nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 6-8 giờ, que thử có thể phát hiện nồng độ thấp đến 3-4 CFU/ml.

3. Que thử có thể phân biệt được các chủng V. cholerae gây bệnh và không gây bệnh không?
   Que thử được thiết kế để phát hiện chủng V. cholerae O1, nhóm huyết thanh chính gây dịch tả. Việc phân biệt các chủng khác cần kết hợp với các phương pháp phân tích gen hoặc huyết thanh học chuyên sâu.

4. Độ đặc hiệu của que thử đối với các vi khuẩn khác như thế nào?
   Que thử không phản ứng chéo với các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác như Salmonella, Shigella, Listeria, đảm bảo độ đặc hiệu cao và giảm thiểu sai số trong phát hiện.

5. Que thử có thể sử dụng trực tiếp trên mẫu nước sinh hoạt không?
   Que thử có thể sử dụng trực tiếp nhưng để đạt độ nhạy cao, mẫu nước nên được nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn trong môi trường pepton kiềm khoảng 6-8 giờ trước khi thử, giúp tăng nồng độ vi khuẩn lên ngưỡng phát hiện.

Kết luận

• Đã phân lập và xác định chính xác vi khuẩn Vibrio cholerae từ các mẫu nước sinh hoạt tại Hải Phòng và Hà Nội bằng phương pháp PCR gen 16S rRNA.
• Môi trường pepton kiềm pH 8,5 được lựa chọn là môi trường tối ưu để tăng sinh vi khuẩn, đạt nồng độ 10^6 - 10^7 CFU/ml sau 8 giờ.
• Chế tạo thành công que thử sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh V. cholerae với ngưỡng phát hiện 10^5 CFU/ml, thời gian cho kết quả 5 phút, độ đặc hiệu cao.
• Que thử phù hợp sử dụng tại hiện trường và các cơ sở y tế tuyến cơ sở, góp phần nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh tả.
• Đề xuất triển khai ứng dụng que thử, phát triển bộ kit tích hợp và mở rộng nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng phát hiện và kiểm soát dịch bệnh trong tương lai.

Hành động tiếp theo là phối hợp với các cơ quan y tế và doanh nghiệp để đưa que thử vào sử dụng thực tế, đồng thời tiếp tục nghiên cứu cải tiến sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh đường ruột khác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vi khuẩn tả Vibrio cholerae đƣợc Robert Koch tìm ra năm 1884 ở Đức [27]. Thế kỷ XIX đã xảy ra 6 vụ dịch lớn ở châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu ngƣời tử vong. Ở Việt Nam, bệnh tả cũng đã xuất hiện từ năm 1850 và bùng phát thành dịch ở nhiều tỉnh, thành trong nhiều năm khiến hàng trăm ngƣời tử vong. Năm 2007 dịch lại bùng phát ở 19 tỉnh/thành phố phía Bắc và có hàng ngàn trƣờng hợp mắc bệnh.

Ngày nay, vi khuẩn này cũng là một trong những tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm và nƣớc uống. Hàng năm, trên thế giới ƣớc tính khoảng 3 - 5 triệu trƣờng hợp mắc bệnh và 100.000 trƣờng hợp tử vong do bệnh tả [51]. Thời gian ủ bệnh ngắn khoảng từ 2 giờ đến 5 ngày, nhiều khả năng bùng phát dịch bệnh. Bệnh tả dễ truyền nhiễm qua phân và chất nôn của ngƣời bệnh hoặc từ các ổ chứa thiên nhiên nhƣ một số động vật thủy sinh, nhất là các loài nhuyễn thể (cá, cua, trai sò, ngao.) ở vùng cửa sông và ven biển.

Vi khuẩn tả gây tiêu chảy cấp tính, nếu không phát hiện và chữa trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong. Vì vậy, việc phát hiện sự có mặt của vi khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nƣớc và thực phẩm là hết sức cần thiết. Hiện nay ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới có rất nhiều phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn tả nhƣ: soi tƣơi, phân lập vi khuẩn, xét nghiệm huyết thanh học, PCR, ELISA, sắc ký miễn dịch.

Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu nhƣợc điểm riêng. Trong đó phƣơng pháp PCR là phƣơng pháp đƣợc áp dụng khá phổ biến, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiện nay trên thị trƣờng đã có các bộ kit phát hiện vi khuẩn tả V. cholerae bằng phƣơng pháp PCR nhƣ bộ kit của hãng: VeTeKTM, Genesig.

Tuy nhiên, phƣơng pháp này đòi hỏi máy móc, trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ chuyên môn cao, khó áp dụng ngoài hiện trƣờng. Mặt khác, tình trạng ngộ độc thực phẩm đang có nguy cơ xảy ra rất cao và ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con ngƣời do thực phẩm ô nhiễm ngày càng nhiều và việc kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm còn chƣa thực sự chặt chẽ. Chính vì vậy, những phƣơng pháp đơn giản, có thể áp dụng trực tiếp ngay tại hiện trƣờng hay các 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] bếp ăn để phát hiện các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nói chung và vi khuẩn tả nói riêng là rất cần thiết. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này vẫn phải đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Do đó, sắc ký miễn dịch là phƣơng pháp phù hợp. Một số công trình nghiên cứu đã chế tạo thành công que thử phát hiện V. cholerae trong các mẫu nƣớc dựa trên phƣơng pháp sắc ký miễn dịch. Que thử cho phép phát hiện vi khuẩn ở nồng độ 106 - 107 CFU/ml với độ nhạy và độ đặc hiệu cao [12, 21].

Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có công trình nghiên cứu nào về việc tạo que thử phát hiện nhanh vi khuẩn tả V. cholerae bằng phƣơng pháp sắc ký miễn dịch, đây là lý do để chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài này nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nƣớc sinh hoạt. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Giới thiệu chung về Vibrio cholerae 1. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học Vị trí phân loại Vibrio cholerae thuộc: Giới (regnum): Bacteria Ngành (phylum): Proteobacteria Lớp (class): Gamma Proteobacteria Bộ (ordo): Vibrionales Họ (familia): Vibrionaceae Chi (genus) Vibrio Hình 1.1: Hình ảnh tế bào vi khuẩn Vibrio cholerae [57] Loài (species): Vibrio cholerae Vibrio cholerae còn gọi là vi khuẩn tả hay phẩy khuẩn tả, là vi khuẩn gram âm, có hình que hơi cong nhƣ dấu phẩy (Hình 1.1), có kích thƣớc khoảng 0,3 x 3 µm, di chuyển nhanh nhờ roi ở đầu, không có vỏ và không sinh bào tử. Vibrio cholerae có khả năng chuyển hóa hô hấp và lên men, các xét nghiệm sinh hóa và các nghiên cứu tƣơng đồng DNA về V. cholerae đã đƣợc xác định rõ [8].

Vi khuẩn này có phản ứng oxidase dƣơng tính, làm giảm nitrat, lên men không sinh hơi glucose, saccharose, D-mannitol, maltose, không lên men arabinose, phản ứng indol dƣơng tính. Vi khuẩn tả rất hiếu khí, sự phát triển của chúng đƣợc kích thích khi bổ sung NaCl 1%. Tuy nhiên, một sự khác biệt quan trọng của V. cholerae so với các vi khuẩn thuộc cùng một chi là khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng dinh dƣỡng không thêm NaCl [56].

Vì vậy, vi khuẩn tả mọc đƣợc dễ dàng trong môi trƣờng nuôi cấy bình thƣờng ở phòng thí nghiệm, không đòi hỏi các yếu tố tăng trƣởng đặc biệt, ƣa pH từ 8 - 9,5, sống ở nhiệt độ 16 - 42 oC, nhiệt độ tối ƣu là 37 oC. Thông thƣờng các môi trƣờng nhƣ pepton pH 8,5, thạch TCBS (thiosulfate - Citrate - Bile salt) pH 8,6 hay TTGA (Taurocholate - Tellurite - Gelatin Agar) pH 8,5 đƣợc dùng để nuôi cấy phân lập vi khuẩn tả [15]. 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Vi khuẩn tả chết ở nhiệt độ 100 oC hoặc 80 oC trong 5 phút và dễ bị tiêu diệt bởi các chất tẩy uế nhƣ cloramin, cresyl, vôi cục., chết rất nhanh trong môi trƣờng acid, đặc biệt nhạy cảm với sự khô hanh và ánh nắng mặt trời cũng làm vi khuẩn dễ chết, chỉ tồn tại 10 phút ở 55 oC. Tuy nhiên có thể sống 4-7 ngày trên rau trái tƣơi để nơi mát và ẩm, trong nƣớc đá, nƣớc biển, nƣớc ao hồ vi khuẩn sống đƣợc vài ngày.

cholerae có khoảng 200 nhóm huyết thanh và đƣợc chia thành V. Vibrio cholerae O1: thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố ruột và gây ra bệnh dịch tả. cholerae O1 bao gồm type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor. Các sinh type này ngƣng kết với kháng huyết thanh nhóm O1.

Trong nhóm này có 3 type huyết thanh là Ogawa, Inaba và Hikojima [36]. Vibrio cholerae non-O1/ non-O139: bao gồm các nhóm huyết thanh từ O2 - O138 không có khả năng gây dịch tả. Có tính chất sinh hóa tƣơng tự nhƣ V. cholerae O1 nhƣng không ngƣng kết với kháng huyết thanh O1.

Các nhiễm trùng do nhóm này thƣờng liên quan đến viêm ruột cấp nhƣng cơ chế gây bệnh vẫn chƣa đƣợc giải thích [36]. Vibrio cholerae O139: là tác nhân gây ra bệnh dịch tả đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1992 tại Ấn Độ và Bangladesh [36]. Khả năng gây bệnh Trong điều kiện tự nhiên bình thƣờng, V. cholerae chỉ gây bệnh tả cho ngƣời và là một trong số tác nhân gây bệnh phổ biến.

Bệnh tả là một bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc cấp tính, lây lan rất nhanh, gây bùng phát các trận dịch tiêu chảy. Vi khuẩn tả dễ truyền nhiễm qua phân và chất nôn của ngƣời bệnh hoặc từ các ổ chứa thiên nhiên nhƣ một số động vật thủy sinh, nhất là các loài nhuyễn thể (cá, cua, trai sò, ngao.) ở vùng cửa sông và ven biển. Thời gian ủ bệnh ngắn từ 2 đến 5 ngày. Dấu hiệu đặc trƣng của thời kỳ toàn phát của bệnh là tiêu chảy và nôn, phân lỏng và trắng nhƣ nƣớc vo gạo.

Bệnh nhân mất nƣớc, mất muối rất nhanh, có thể mất 1 lít nƣớc trong 1 giờ do đó chỉ vài giờ là xuất hiện hội chứng mất nƣớc cấp tính làm cho 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] toàn thân sút đi rất nhanh và nguy hiểm. Nếu không đƣợc điều trị, tỷ lệ chết rất cao (50% đến 60%). Bệnh tả có nhiều biểu hiện lâm sàng rất khác nhau từ thể nhẹ dễ bỏ qua cho đến thể nặng với hội chứng tả điển hình [52]. Các vi khuẩn tả xâm nhập cơ thể bằng đƣờng tiêu hóa, chúng phải vƣợt qua hàng rào dịch vị của dạ dày có pH axit để xuống ruột non là nơi có pH thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn.

Độ axit bình thƣờng của dịch vị là một cản trở rất lớn đối với quá trình sinh bệnh của vi khuẩn tả. Vào đến ruột non, V. cholerae bám dính vào tế bào niêm mạc ruột nhờ có các yếu tố bám dính nhƣ kháng nguyên TCP, kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu nhạy cảm với mannose., vi khuẩn nhân lên và tiết ra độc tố ruột. Các vi khuẩn không xâm nhập vào trong các tế bào niêm mạc ruột.

Độc tố ruột của vi khuẩn tả (Cholera toxin viết tắt là CTX, Ctx hoặc CT) (Hình 1.2) là một protein gồm 2 tiểu phần A (Active_28 kDa) và B (Binding_11 kDa) có chức năng riêng biệt, có cấu trúc tƣơng tự nhƣ ngoại độc tố chịu nhiệt của E. coli gây tiêu chảy, chỉ bị phá vỡ cấu trúc khi đun nóng ở 121oC trong 30 phút [34]. Tiểu phần A có hai tiểu đơn vị A1 và A2, tiểu phần B có 5 tiểu đơn vị B1, B2, B3, B4 và B5. Tiểu phần B có chức năng gắn độc tố ruột vào thụ thể ganglioside GM1 ở trên màng của tế bào niêm mạc ruột, còn tiểu phần A mà chủ yếu là A1 xâm nhập vào bên trong tế bào hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng nồng độ AMP vòng nội bào làm cho tế bào niêm mạc ruột giảm hấp thu Na+, tăng tiết nƣớc và Cl-, gây ra ỉa chảy cấp tính (Hình 1.

Nếu không đƣợc điều trị tích cực bệnh nhân sẽ chết vì kiệt nƣớc và mất các chất điện giải. Độc tố tả còn gây nên ức chế miễn dịch tế bào bằng cách tác động trực tiếp lên macrophage và tế bào lympho T [58]. 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.2: Cấu tạo độc tố của Vibrio cholerae [44] Hình 1.3: Cơ chế gây bệnh của Vibrio cholerae [58] 1. Tình hình dịch bệnh tả Vi khuẩn tả V.

cholerae đƣợc Robert Koch tìm ra năm 1884 ở Đức [27]. Thế kỷ XIX đã xảy ra 6 vụ dịch lớn ở châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu ngƣời tử vong. Năm 2011, các trƣờng hợp mắc bệnh tả đã đƣợc công bố từ tất cả các nƣớc trên thế giới. Tổng cộng có 58 quốc gia xuất hiện dịch bệnh tả với tổng số tích luỹ 589.854 trƣờng hợp mắc bệnh trong đó 7.816 ngƣời tử vong (tỷ lệ tử vong là 1,3%), số trƣờng hợp mắc bệnh tăng 85% so với năm trƣớc.

Châu Phi là một trong số 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] những khu có số ca tử vong do bệnh tả chiếm tỷ lệ cao nhất (Bảng 1. Sự gia tăng nhanh chóng số trƣờng hợp mắc bệnh trên toàn cầu so với năm 2010 là kết quả của một đợt dịch lớn, bắt đầu vào tháng 10 năm 2010 tại Haiti (một quốc gia thuộc Châu Mỹ) và vẫn đang tiếp diễn [51].