CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu chung về độc tố vi nấm nhóm Alternaria 1. Khái niệm và phân loại độc tố vi nấm nhóm Alternaria Alternaria là một chi nấm thường gặp gồm nhiều loài vừa hoại sinh trên vật liệu hữu cơ vừa gây bệnh trên các loài thực vật với khả năng thích nghi môi trường tốt, gây ra các đại dịch nghiêm trọng ở cả khu vực ẩm ướt và bán khô hạn. Một số loài Alternaria có thể lây nhiễm và gây ra các triệu chứng trên cây trồng trong giai đoạn phát triển hoặc trong quá trình bảo quản, vận chuyển, chế biến sau khi thu hoạch.
Độc tố vi nấm nhóm Alternaria là nhóm độc tố gồm hơn 70 hợp chất là các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của các loài nấm Alternaria xuất hiện trong thực phẩm [12]. Độc tố vi nấm nhóm Alternaria được phân loại dựa trên tính chọn lọc với vật chủ hoặc cấu trúc hóa học. • Phân loại theo tính chọn lọc với vật chủ, gồm 2 nhóm: - Độc tố chọn lọc vật chủ: Độc tố chỉ gây độc cho thực vật và nấm sản sinh ra độc tố. Ví dụ như ToxA gây hại trên lúa mì; AM-I, II, III gây hại trên táo; AAL-TA, TB gây hại trên cà chua; AF-I, II, III gây hại trên dâu tây [35].
- Độc tố không chọn lọc vật chủ: Độc tố có thể gây ảnh hưởng đến nhiều loài thực vật bao gồm cả vật chủ sinh ra độc tố và loài không phải là vật chủ. Một số độc tố không chọn lọc vật chủ gây ra tác động có hại trên động vật bao gồm cả độc tính trên thai nhi và nguy cơ gây quái thai như alternariol (AOH), alternariol monomethyl ete (AME), acid tenuazonic (TeA) [10]. • Phân loại theo cấu trúc hóa học, gồm 5 nhóm [10]: - Nhóm 1: Các dibenzo-α-pyron bao gồm AOH, AME, altenuene (ALT). - Nhóm 2: TeA và acid iso-tenuazonic (iso-TeA).
- Nhóm 3: Các perylen quinon bao gồm altertoxin I, II, III (ATX-I, ATX-II, ATX-III) và stemphyltoxin III. - Nhóm 4: Các độc tố AAL gồm 2 phân nhóm AAL-TA và AAL-TB: • AAL-TA bao gồm hai este (C13 hoặc C14) của acid 1,2,3-propan-tricarboxylic và 1-amino-11,15-dimetylheptadeca-2,4,5,13,14 pentol. 3 • AAL-TB bao gồm hai este (C13 hoặc C14) của acid 1,2,3-propan-tricacboxylic và 1-amino-11,15-dimetylheptadeca-2,4,13,14-tetrol. - Nhóm 5: Các chất khác như tentoxin (TEN).
Sự hình thành độc tố vi nấm nhóm Alternaria Nấm Alternaria có thể gây bệnh trên cây trồng và gây thối rữa nhiều loại trái cây, ngũ cốc, rau quả, hạt có dầu sau thu hoạch. Do có khả năng phát triển ngay cả ở nhiệt độ thấp nên Alternaria có thể gây hỏng những sản phẩm này trong quá trình vận chuyển và bảo quản lạnh [10]. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm là khoảng 18 - 25ºC, bào tử có thể nảy mầm và lây nhiễm trong khoảng từ 4 - 35ºC. Sau khi lây nhiễm, các loài Alternaria cần môi trường có hàm lượng nước tương đối cao (trên 20%) để xâm nhập vào các mô thực vật.
Vì vậy, quá trình thối rữa do nấm Alternaria gây ra thường gặp ở trái cây và rau quả hơn là các sản phẩm được bảo quản ở điều kiện có độ ẩm thấp như các loại hạt và ngũ cốc. Tuy nhiên, Alternaria có thể phát triển trong các loại ngũ cốc được thu hoạch dưới thời tiết ẩm ướt và được bảo quản trong điều kiện ẩm. Trong quá trình bảo quản, Alternaria có thể lây lan từ các sản phẩm có nhiễm nấm sang các sản phẩm khác do nhiễm trùng thứ cấp [5]. Các độc tố vi nấm nhóm Alternaria như AOH, AME và TeA thường được phát hiện trong ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc (lúa mì, lúa mạch), các loại đậu, quả hạch và hạt có dầu (ô liu, hạt hướng dương, bột hạt cải, hạt tiêu), cỏ khô và thức ăn ủ chua, rau quả (táo, cà chua, quả họ cam, nho đỏ, lê Nhật Bản), nước ép trái cây (nước ép táo, nước ép nho), đồ uống có cồn (rượu vang), các loại thảo mộc [10], [20].
Theo Hội đồng các chất gây ô nhiễm trong chuỗi thực phẩm (CONTAM) của Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA), nồng độ của AOH, AME, TeA được tìm thấy cao nhất ở nhóm thực phẩm gồm các loại đậu, quả hạch và hạt có dầu với nồng độ trung bình của AOH là 22 - 26 µg/kg; của AME là 11 - 12 µg/kg và của TeA là 333 - 349 µg/kg [10]. Tính chất lý hóa của một số độc tố vi nấm nhóm Alternaria phổ biến • Acid tenuazonic (TeA): Hình 1.1: Công thức cấu tạo của acid tenuazonic CTPT: C10H15O3N KLPT: 197 Dalton - Tên khoa học: (5S)-3-Acetyl-1,5-dihydro-4-hydroxy-5-[(1S)-1-methylpropyl]-2H- pyrrol-2-on - Dạng dầu, nhớt, không màu, tan trong methanol và cloroform. - TeA là một monoacid với pKa = 4,28; logP = 0,92 tạo phức với các ion của calci, magie, đồng, sắt, niken. Khi để yên, đun nóng hoặc xử lý với kiềm, hoạt tính quang học bị mất và có thể xảy ra hiện tượng kết tinh do hình thành iso-TeA [10].
• Alternariol và alternariol monomethyl ete: - Alternariol (AOH): Hình 1.2: Công thức cấu tạo của alternariol CTPT: C14H10O5 KLPT: 258 Dalton Tên khoa học: 3,7,9-Trihydroxy-1-methyl-6H-dibenzo[b,d]pyran-6-on pKa = 7,63; logP = 3,18 - Alternariol monomethyl ete (AME): Hình 1.3: Công thức cấu tạo của alternariol monomethyl ete 5 CTPT: C15H12O5 KLPT: 272 Dalton Tên khoa học: 3,7-Dihydroxy-9-methoxy-1-methyl-6H-dibenzo[b,d]pyran-6-on pKa = 7,71; logP = 3,32. - AOH và AME kết tinh trong ethanol dạng hình kim, không màu, tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ và cho phản ứng màu tím với sắt clorid trong ethanol, điểm nóng chảy đồng thời xảy ra phân hủy lần lượt là 350°C và 267°C. - Độ ổn định hóa học của AOH, AME đã được nghiên cứu bởi Siegel và cộng sự bằng cách đun hồi lưu các dung dịch trong nước với pH khác nhau trong 5 giờ. Kết quả cho thấy cả 2 hợp chất đều ổn định trong dung dịch đệm phosphat pH 5 (0,15 M), nhưng bị phân hủy hoàn toàn trong dung dịch KOH 0,1 M tạo thành các sản phẩm màu nâu không xác định.
Trong dung dịch đệm phosphat/ citrat pH 7 (0,18 M), AOH và AME bị phân hủy tương ứng thành 6-methylbiphenyl-2,3',4,5'-tetrol và 5'-methoxy-6-methyl biphenyl-2,3',4-triol. Cơ chế phân hủy có liên quan đến sự thủy phân của nhóm lacton theo sau quá trình khử carboxyl. Theo kết quả nghiên cứu, phần lớn các độc tố nhóm Alternaria không bị phân hủy trong quá trình sấy ẩm, hầu hết đều ổn định ở 100°C và dưới ánh nắng mặt trời [28]. Nhìn chung, các độc tố vi nấm nhóm Alternaria có tính ổn định cao, do đó, độc tính không bị giảm theo thời gian và nhiệt độ môi trường.
- Độc tố vi nấm nhóm Alternaria có thể chuyển hóa một phần trong thực vật thành các chất chuyển hóa liên hợp nhờ liên kết với các hợp chất phân cực hơn như glucose, acid amin và sulfat. Những dạng độc tố đã biến đổi này có thể giải phóng các tiền chất tự nhiên nhờ enzym thủy phân trong đường tiêu hóa của sinh vật [8]. Độc tính độc tố vi nấm nhóm Alternaria Dịch chiết Alternaria alternata gây đột biến đảo ngược ở Escherichia coli, tổng hợp DNA bất thường trong tế bào FL amnion của người, làm sai lệch nhiễm sắc thể và trao đổi chromatid chị em trong tế bào lympho máu ngoại vi của người, gây đột biến ở tế bào V79 và biến đổi tế bào NIH3T3 [18]. Các chủng Alternaria nuôi cấy trong phòng thí nghiệm gây độc cho gà, chuột [26], phôi gà [13]và tế bào người được nuôi cấy [23], đồng thời gây quái thai và gây độc cho thai nhi trên chuột [13], [23].
Tổn thương gan và thận được phát hiện khi cho chuột ăn A. Alternata trong 28 ngày [11]. Trong các độc tố vi nấm nhóm Alternaria, báo cáo về độc tính trong các nghiên cứu trên thế giới chủ yếu 6 ghi nhận trên 3 độc tố phổ biến nhất là AOH, AME và TeA. Do vậy, 3 độc tố này được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu của đề tài.
AOH và AME đã được báo cáo gây độc gen ở vi khuẩn và tế bào động vật có vú trong ống nghiệm. AOH đã được xác định là chất độc với topoisomerase I và II làm suy giảm tính toàn vẹn của ADN trong các tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người [10]. Theo nghiên cứu của Zhen và cộng sự thực hiện tại Linxian, Trung Quốc, nấm Alternaria Alternata có thể là một nguyên nhân gây bệnh ung thư thực quản. Các kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy AME và AOH có thể gây đột biến và biến đổi tế bào, kết hợp với DNA được phân lập từ biểu mô thực quản của bào thai người, từ đó kích hoạt các chất gây ung thư, thúc đẩy tăng sinh biểu mô thực quản bào thai người và có thể gây ung thư biểu mô tế bào vảy của thực quản thai nhi [18], [38].
Tuy nhiên, các loại ngũ cốc có nguy cơ cao gây ung thư thực quản cũng bị nhiễm bởi các loại nấm độc khác như Penicillium cyclopidium, Fusarium moniliforme, Aspergillus nidulans và Aspergillus fumigatus, do đó, chưa thể xác định mối liên hệ rõ ràng giữa bất kỳ loại độc tố vi nấm alternaria cụ thể nào với tỷ lệ gia tăng ung thư thực quản. Ngoài ra, AOH là một hợp chất diphenol có cấu trúc tương tự như estrogen và được chứng minh có thể liên kết với thụ thể estrogen của người, đồng thời gây ra hoạt động và biểu hiện của phosphatase kiềm trong dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến nội mạc tử cung [17]. Trong thử nghiệm in vitro, AOH và AME được báo cáo làm giảm tổng hợp progesteron trong tế bào buồng trứng ở lợn - là hormon buồng trứng quan trọng giúp hợp tử làm tổ và duy trì thai kỳ. Do đó, việc phơi nhiễm AOH và AME có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của lợn và các loài động vật có vú khác [33].
TeA gây độc cấp tính đường uống ở loài gặm nhấm với LD50 là 81 - 186 mg/kg cân nặng với chuột nhắt, 168 - 180 mg/kg cân nặng với chuột cống [23] và 0,55 mg/trứng với phôi gà [13]. Một thử nghiệm ngắn hạn trong 33 ngày được tiến hành trên khỉ với liều 89,6 mg TeA/kg cân nặng/ngày gây nôn mửa, tiêu chảy ra máu và các tổn thương xuất huyết ở đường ruột [30]. Các thí nghiệm thực hiện trên loài gặm nhấm của các độc tố vi nấm nhóm Alternaria cho kết quả mức độ gây độc tính cấp xếp theo thứ tự sau: TeA> AME và AOH. Tuy nhiên, những dữ liệu này không phù hợp để đánh giá rủi ro của độc tố vi nấm 7 nhóm Alternaria do nguy cơ đối với sức khỏe cộng đồng liên quan đến những độc tố này thường không do phơi nhiễm cấp tính.