Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát triển phương pháp lc ms ms phân tích chlotetracycline oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm trên địa bàn thành phố hạ long

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát triển phương pháp LC-MS/MS phân tích chlotetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm tại Hạ Long.

• Tác giả: Hoàng Thị Phượng
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Ri
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Triển Phương Pháp LC-MS/MS Phân Tích Chlotetracycline, Oxytetracycline Và Tetracycline Trong Thực Phẩm
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm Tetracycline
• 1.2. Giới thiệu chung
• 1.3. Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline
• 1.4. Các phương pháp chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích tetracycline
• 1.4.1. Phương pháp chiết tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm
• 1.4.1.1. Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học
• 1.4.1.2. Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất (PLE)
• 1.4.2. Các phương pháp làm sạch dịch chiết mẫu
• 1.4.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
• 1.4.2.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng
• 1.4.3. Các phương pháp phân tích kháng sinh tetracycline
• 1.4.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng
• 1.4.3.1.1. Phương pháp sắc kí lỏng ghép nối detector Diode array (LC/DAD)
• 1.4.3.1.2. Phương pháp sắc kí lỏng ghép nối detector huỳnh quang (LC/FL)
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Hóa chất và thiết bị
• 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.2. Lấy mẫu, bảo quản mẫu
• 2.2.3. Phương pháp xử lý mẫu
• 2.2.4. Phương pháp phân tích
• 2.2.5. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu hóa các điều kiện phân tích các tetracycline trên hệ thống sắc kí lỏng khối phổ LC/MS-MS
• 3.2. Nghiên cứu tối ưu hóa các thông số của detector MS/MS
• 3.3. Tối ưu hóa các điều kiện của sắc kí lỏng
• 3.4. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu
• 3.4.1. Chiết tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu
• 3.4.1.1. Lựa chọn dung môi chiết chất phân tích
• 3.4.1.2. Lựa chọn pH
• 3.4.2. Tối ưu hóa quá trình làm sạch mẫu
• 3.5. Các kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
• 3.5.1. Giới hạn phát hiện của thiết bị
• 3.5.2. Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL)
• 3.5.3. Phương trình hồi qui tuyến tính
• 3.5.4. Độ chính xác của phương pháp
• 3.5.5. Đánh giá kết quả phân tích mẫu so sánh liên phòng
• 3.5.6. Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp
• 3.5.7. Độ ổn định của phương pháp
• 3.5.8. Độ không đảm bảo đo
• 3.5.9. Phân tích mẫu thực tế
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp LC MS MS phân tích kháng sinh trong thực phẩm

Phương pháp LC-MS/MS (Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc phân tích kháng sinh trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép xác định chính xác và nhanh chóng các loại kháng sinh tồn dư trong thực phẩm, đặc biệt là nhóm tetracycline. Việc sử dụng LC-MS/MS giúp phát hiện các chất này ở nồng độ rất thấp, từ đó đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

1.1. Kháng sinh tetracycline và tác động của chúng

Kháng sinh tetracycline được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi và có thể tồn dư trong thực phẩm. Việc tiêu thụ thực phẩm chứa kháng sinh này có thể gây ra các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, bao gồm kháng thuốc và dị ứng.

1.2. Lợi ích của phương pháp LC MS MS trong phân tích thực phẩm

Phương pháp LC-MS/MS cung cấp độ nhạy cao và khả năng phân tích nhiều mẫu cùng lúc. Điều này giúp giảm thời gian và chi phí cho các phòng thí nghiệm, đồng thời nâng cao độ chính xác trong việc phát hiện kháng sinh.

II. Thách thức trong việc phân tích kháng sinh bằng LC MS MS

Mặc dù phương pháp LC-MS/MS mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong quá trình phân tích kháng sinh. Các vấn đề như sự can thiệp của các hợp chất khác trong mẫu thực phẩm có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích.

2.1. Sự can thiệp từ các hợp chất khác

Trong thực phẩm, có nhiều hợp chất có thể gây ra sự can thiệp trong quá trình phân tích, làm giảm độ chính xác của kết quả. Việc lựa chọn phương pháp chiết tách phù hợp là rất quan trọng để giảm thiểu vấn đề này.

2.2. Giới hạn phát hiện và độ nhạy của phương pháp

Giới hạn phát hiện của phương pháp LC-MS/MS có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm điều kiện phân tích và chất lượng mẫu. Cần tối ưu hóa các thông số để đạt được độ nhạy tốt nhất.

III. Phương pháp chiết tách mẫu thực phẩm trước khi phân tích

Chiết tách mẫu là bước quan trọng trong quy trình phân tích kháng sinh bằng LC-MS/MS. Các phương pháp chiết tách khác nhau có thể ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi và độ chính xác của kết quả phân tích.

3.1. Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học

Phương pháp chiết lỏng rắn sử dụng dung môi thẩm thấu vào mẫu thực phẩm, giúp tách kháng sinh ra khỏi nền mẫu. Phương pháp này đã được chứng minh là hiệu quả trong việc thu hồi tetracycline từ các loại thực phẩm khác nhau.

3.2. Phương pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất PLE

Phương pháp PLE sử dụng áp suất cao để tăng cường khả năng chiết tách kháng sinh. Điều này giúp cải thiện hiệu suất thu hồi và giảm thời gian chiết tách, từ đó nâng cao độ chính xác của phân tích.

IV. Kết quả nghiên cứu ứng dụng phương pháp LC MS MS

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp LC-MS/MS có thể phát hiện và định lượng chính xác các loại kháng sinh trong thực phẩm. Kết quả cho thấy nồng độ kháng sinh trong mẫu thực phẩm thường vượt quá giới hạn cho phép, điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc kiểm soát an toàn thực phẩm.

4.1. Phân tích mẫu thực phẩm thực tế

Các mẫu thực phẩm như thịt, thủy sản và sữa đã được phân tích để xác định nồng độ kháng sinh. Kết quả cho thấy nhiều mẫu vượt quá giới hạn cho phép, cần có biện pháp kiểm soát chặt chẽ hơn.

4.2. Đánh giá hiệu quả của phương pháp

Phương pháp LC-MS/MS đã cho kết quả thu hồi cao và độ chính xác tốt trong việc phân tích kháng sinh. Điều này khẳng định tính khả thi của phương pháp trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của phương pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS đã chứng minh được hiệu quả trong việc phân tích kháng sinh trong thực phẩm. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển để cải thiện độ nhạy và độ chính xác của phương pháp, đồng thời mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác.

5.1. Hướng phát triển công nghệ phân tích

Cần nghiên cứu thêm về các công nghệ mới để cải thiện hiệu suất và độ nhạy của phương pháp LC-MS/MS. Việc áp dụng công nghệ mới có thể giúp nâng cao khả năng phát hiện kháng sinh trong thực phẩm.

5.2. Tăng cường kiểm soát an toàn thực phẩm

Cần có các quy định chặt chẽ hơn về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và sản xuất thực phẩm. Việc áp dụng phương pháp LC-MS/MS sẽ giúp kiểm soát tốt hơn tình trạng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề được toàn xã hội quan tâm, đặc biệt liên quan đến tồn dư kháng sinh trong thực phẩm. Theo báo cáo của ngành, việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi để phòng bệnh và kích thích sinh trưởng đã dẫn đến nguy cơ tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng cho phép, gây dị ứng và kháng thuốc vi sinh vật. Tại Việt Nam, nhóm kháng sinh tetracycline, gồm chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline, được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong bảo quản thực phẩm bị cấm theo Thông tư 10/2016 và Thông tư 06/2016 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

Mục tiêu nghiên cứu là phát triển phương pháp phân tích đồng thời chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS, áp dụng khảo sát thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long. Nghiên cứu thực hiện trong giai đoạn 2015-2017, tập trung vào các mẫu thịt và thủy sản. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát tồn dư kháng sinh, đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng, đồng thời hỗ trợ công tác thanh tra, kiểm tra chất lượng thực phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline: Tetracycline, oxytetracycline và chlortetracycline là các kháng sinh phổ rộng, có cấu trúc lưỡng tính, dễ tạo phức với các ion kim loại như Ca²⁺, Mg²⁺, Fe³⁺, ảnh hưởng đến khả năng chiết tách và phân tích.
• Phương pháp chiết tách mẫu: Chiết lỏng-rắn có hỗ trợ lực cơ học và chiết lỏng-rắn có hỗ trợ áp suất (PLE) giúp tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm hiệu quả với độ thu hồi từ 75% đến gần 100%.
• Phương pháp phân tích LC-MS/MS: Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) cho phép xác định đồng thời các tetracycline với độ nhạy cao, giới hạn phát hiện khoảng 1 µg/kg, độ đặc hiệu và chọn lọc cao.
• Khái niệm chính: Giới hạn phát hiện (IDL), giới hạn phát hiện phương pháp (MDL), giới hạn định lượng (MQL), độ thu hồi (Recovery), độ lặp lại (Repeatability), độ không đảm bảo đo (Measurement uncertainty).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu thực phẩm gồm thịt và thủy sản lấy tại thành phố Hạ Long theo quy định của Thông tư 14/2011/TT-BYT và tiêu chuẩn TCVN 4833-1:2002, TCVN 5276:1990.
• Phương pháp chọn mẫu: Lấy mẫu ngẫu nhiên, mỗi mẫu phân tích lặp lại 3 lần, kèm mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn để xây dựng đường chuẩn.
• Xử lý mẫu: Mẫu được đồng nhất, chiết bằng đệm McIlvaine-EDTA pH 4, làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE C18, rửa giải bằng methanol.
• Phân tích: Sử dụng hệ thống LC-MS/MS Shimadzu 8040 với cột Inertsustain C18 (3 µm, 2.1 mm x 150 mm), dung môi pha động gồm acetonitrile và nước chứa 0,1% axit formic theo chương trình gradient tối ưu.
• Timeline nghiên cứu: Từ 2015 đến 2017, gồm giai đoạn xây dựng phương pháp, tối ưu hóa điều kiện phân tích, xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và khảo sát mẫu thực tế.
• Phân tích số liệu: Tính toán độ thu hồi, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, độ đặc hiệu, độ không đảm bảo đo theo tiêu chuẩn ISO 17025:2005 và EC/657/2002.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu hóa điều kiện phân tích LC-MS/MS:

   • Thế phân mảnh (CE) tối ưu cho oxytetracycline là -20 V, tetracycline -19 V, chlortetracycline -29 V.
   • Thời gian lưu của oxytetracycline, tetracycline và chlortetracycline lần lượt là 4,60; 4,77 và 5,06 phút.
   • Đường chuẩn tuyến tính với hệ số tương quan R > 0,995 trong khoảng 5-100 µg/kg.

2. Hiệu suất chiết tách và làm sạch mẫu:

   • Đệm McIlvaine-EDTA pH 4 cho hiệu suất thu hồi 76-83% với hệ số biến thiên CV < 5,8%, vượt trội so với acetonitrile + 0,1M axit phosphoric (20-40% thu hồi, CV 19,2%).
   • Tốc độ nạp mẫu và rửa giải 2 mL/phút cho hiệu suất thu hồi 86,5-88,7%, dung môi rửa giải methanol hiệu quả hơn methanol-EDTA.

3. Giới hạn phát hiện và định lượng:

   • Giới hạn phát hiện thiết bị (IDL) khoảng 1 µg/kg.
   • Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL) đạt khoảng 3 µg/kg, giới hạn định lượng (MQL) là 9 µg/kg.
   • Độ lặp lại CV < 8,9%, độ thu hồi đạt 78-103% theo tiêu chuẩn AOAC.

4. Phân tích mẫu thực tế tại Hạ Long:

   • Phát hiện tồn dư tetracycline trong khoảng 5-50 µg/kg ở một số mẫu thịt và thủy sản.
   • Tỷ lệ mẫu vượt ngưỡng MRL theo tiêu chuẩn Việt Nam chiếm khoảng 10-15%.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy phương pháp LC-MS/MS phát triển có độ nhạy và độ chính xác cao, phù hợp để phân tích tồn dư tetracycline trong thực phẩm. Việc sử dụng đệm McIlvaine-EDTA pH 4 giúp giải phóng tetracycline khỏi phức kim loại, nâng cao hiệu suất chiết tách so với dung môi hữu cơ đơn thuần. Thời gian lưu và chương trình gradient tối ưu giúp tách biệt rõ ràng các đồng phân tetracycline, giảm nhiễu nền mẫu.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, giới hạn phát hiện và độ thu hồi của phương pháp tương đương hoặc vượt trội, đáp ứng yêu cầu kiểm soát an toàn thực phẩm. Kết quả phân tích mẫu thực tế phản ánh tình trạng tồn dư kháng sinh còn tồn tại, cần tăng cường kiểm tra và quản lý. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ mẫu vượt ngưỡng và bảng so sánh hiệu suất thu hồi giữa các dung môi chiết.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong kiểm nghiệm thực phẩm

   • Mục tiêu: Nâng cao độ chính xác và độ nhạy trong phát hiện tồn dư tetracycline.
   • Thời gian: Triển khai trong 12 tháng tới.
   • Chủ thể: Các phòng kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, trung tâm y tế dự phòng.

2. Tăng cường giám sát và kiểm tra mẫu thực phẩm tại các chợ, siêu thị trên địa bàn Hạ Long

   • Mục tiêu: Giảm tỷ lệ mẫu vượt ngưỡng MRL xuống dưới 5% trong 2 năm.
   • Chủ thể: Sở Y tế, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm.

3. Tuyên truyền, đào tạo nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi và kinh doanh thực phẩm về sử dụng kháng sinh hợp lý

   • Mục tiêu: Giảm lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
   • Thời gian: Chương trình liên tục trong 3 năm.
   • Chủ thể: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, các tổ chức nông nghiệp.

4. Xây dựng cơ sở dữ liệu về tồn dư kháng sinh trong thực phẩm để phục vụ quản lý và nghiên cứu

   • Mục tiêu: Cung cấp thông tin chính xác, kịp thời cho các cơ quan quản lý.
   • Thời gian: Hoàn thành trong 18 tháng.
   • Chủ thể: Viện kiểm nghiệm quốc gia, các trường đại học liên quan.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà khoa học và nghiên cứu trong lĩnh vực hóa phân tích và an toàn thực phẩm

   • Lợi ích: Áp dụng phương pháp LC-MS/MS tối ưu trong phân tích tồn dư kháng sinh.
   • Use case: Phát triển kỹ thuật phân tích mới, nghiên cứu sâu về tetracycline.

2. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và y tế dự phòng

   • Lợi ích: Cơ sở khoa học để xây dựng chính sách kiểm soát tồn dư kháng sinh.
   • Use case: Thiết lập quy trình kiểm nghiệm, giám sát chất lượng thực phẩm.

3. Phòng kiểm nghiệm và trung tâm y tế dự phòng

   • Lợi ích: Nâng cao năng lực phân tích, đảm bảo kết quả kiểm nghiệm chính xác.
   • Use case: Áp dụng quy trình phân tích chuẩn trong kiểm tra mẫu thực phẩm.

4. Người chăn nuôi và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm

   • Lợi ích: Hiểu rõ tác động của tồn dư kháng sinh, tuân thủ quy định pháp luật.
   • Use case: Điều chỉnh quy trình chăn nuôi, sản xuất để giảm tồn dư kháng sinh.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các phương pháp khác trong phân tích tetracycline?
   LC-MS/MS có độ nhạy cao với giới hạn phát hiện khoảng 1 µg/kg, khả năng phân biệt đồng phân tốt và độ đặc hiệu cao, vượt trội so với LC/DAD hay LC/FL. Ví dụ, phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời ba loại tetracycline trong mẫu phức tạp với độ chính xác cao.

2. Tại sao đệm McIlvaine-EDTA pH 4 được lựa chọn làm dung môi chiết?
   Đệm này giúp giải phóng tetracycline khỏi phức kim loại nhờ khả năng chelat hóa ion kim loại của EDTA, tăng hiệu suất thu hồi lên đến 83%, trong khi dung môi acetonitrile chỉ đạt 40%. pH 4 là môi trường ổn định tránh hiện tượng đồng phân hóa tetracycline.

3. Giới hạn phát hiện (MDL) của phương pháp là bao nhiêu?
   MDL của phương pháp đạt khoảng 3 µg/kg, đủ để phát hiện tồn dư tetracycline dưới ngưỡng cho phép theo tiêu chuẩn Việt Nam, giúp kiểm soát an toàn thực phẩm hiệu quả.

4. Phương pháp này có thể áp dụng cho những loại thực phẩm nào?
   Phương pháp đã được áp dụng thành công cho các mẫu thịt và thủy sản tại Hạ Long, có thể mở rộng cho các loại thực phẩm khác như trứng, sữa, mật ong với điều chỉnh quy trình chiết tách phù hợp.

5. Làm thế nào để đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp?
   Độ lặp lại được kiểm tra qua 12 lần phân tích mẫu thêm chuẩn với CV < 8,9%, độ thu hồi đạt 78-103%. Việc sử dụng mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn và kiểm soát điều kiện phân tích giúp đảm bảo tính ổn định và chính xác của kết quả.

Kết luận

• Phương pháp LC-MS/MS được phát triển cho phép phân tích đồng thời chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm với độ nhạy cao, giới hạn phát hiện khoảng 1 µg/kg.
• Đệm McIlvaine-EDTA pH 4 là dung môi chiết tối ưu, nâng cao hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của phương pháp.
• Phương pháp đáp ứng các tiêu chuẩn ISO 17025:2005 và EC/657/2002 về xác nhận giá trị sử dụng, phù hợp cho kiểm nghiệm thực phẩm.
• Kết quả khảo sát mẫu thực phẩm tại Hạ Long cho thấy tồn dư tetracycline còn tồn tại, cần tăng cường kiểm soát.
• Đề xuất triển khai áp dụng phương pháp trong kiểm nghiệm, giám sát và nâng cao nhận thức người chăn nuôi để đảm bảo an toàn thực phẩm.

Các cơ quan quản lý và phòng kiểm nghiệm nên phối hợp triển khai áp dụng phương pháp này, đồng thời đẩy mạnh công tác tuyên truyền và giám sát sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đã trở thành vấn đề chung đƣợc toàn xã hội quan tâm. Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên quan giữa bệnh tật và thực phẩm mất an toàn. Có rất nhiều nguyên nhân và nguy cơ, trong đó kể đến việc nuôi, trồng, vận chuyển, chế biến và bảo quản không đúng qui trình, qui cách. Thêm vào đó là việc cố ý tạo ra sản phẩm không an toàn của không ít các nhà kinh doanh thực phẩm vì chạy theo lợi nhuận kinh tế.

Một trong các vấn đề nóng hiện nay chính là tồn dƣ kháng sinh trong các sản phẩm thực phẩm. Nguyên nhân dẫn đến việc tồn dƣ kháng sinh là việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi để phòng chống bệnh tật cho vật nuôi, kích thích sinh trƣởng cũng nhƣ dùng làm chất bảo quản, giúp thực phẩm tƣơi lâu. Khi ngƣời tiêu dùng sử dụng những thực phẩm chứa tồn dƣ kháng sinh vƣợt ngƣỡng giới hạn cho phép sẽ dẫn đến hậu quả khôn lƣờng. Phản ứng xảy ra tức thời là một số kháng sinh gây dị ứng đối với một số ngƣời, phản ứng lâu dài sẽ là sự kháng thuốc của vi sinh vật đối với các loại kháng sinh.

Trên thế giới đã có những ca bác sĩ không thể cứu đƣợc bệnh nhân vì bệnh nhiễm khuẩn do kháng tất cả các loại kháng sinh hiện có. Tại Việt Nam, việc sử dụng kháng sinh trong bảo quản thực phẩm bị cấm tuyệt đối. Theo thông tƣ 10/2016 kí ngày 1/6/2016 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn thì có 24 loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong chăn nuôi thủy sản nhƣ Chloramphenicol, Nitrofuran, Enrofloxacin, Ciprofloxacin… và 16 loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh động vật trên cạn nhƣ Chloramphenicol, Furazolidon và dẫn xuất của nhóm Nitrofuran, Dimetridazole, Metronidazole, Dipterex Ciprofloxacin, Ofloxacin….Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (NN&PTNT), Thông tƣ 06/2016 kí ngày 31/5/2016 cũng quy định 15 loại hóa chất, kháng sinh đƣợc phép sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm với mục đích kích thích sinh trƣởng, bao gồm: Bambermycins, BMD (Bacitracin Methylnene-Disalicylate), Chlortetracyline, Colistin sulphate, Enramycin…. nhƣng sẽ bị cấm sử dụng bắt đầu từ 31/12/2017.

1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Trong số đó, tetracycline là nhóm kháng sinh đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Hiện có khoảng gần 10 tetracycline tự nhiên nhƣng trên thực tế chỉ sử dụng 4 loại là chlortetracycline, tetracycline, oxytetracycline và demechlocycline dƣới dạng thuốc và các chế phẩm bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Tại Việt Nam chỉ sử dụng phổ biến 3 loại kháng sinh Tetracycline, Oxytetracycline và Chlortetracycline. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “nghiên cứu phát triển phương pháp LC- MS/MS phân tích chlortetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long” với mục tiêu là :xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng chlotetracycline, oxytetracycline và tetracycline trong thực phẩm và áp dụng để phân tích thực phẩm trên địa bàn thành phố Hạ Long.

2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Tổng quan về kháng sinh nhóm Tetracycline 1. Giới thiệu chung Các tetracycline đƣợc phát hiện rất sớm, từ năm 1948, là kháng sinh phổ rộng đầu tiên ức chế hầu hết các vi khuẩn gram âm, gram dƣơng và Ricketsisa… nên đƣợc sử dụng rộng rãi cho đến những năm 80 của thế kỉ XX, nhất là ở các nƣớc đang phát triển. Hiện nay, các kháng sinh tự nhiên của nhóm này nhƣ tetracycline, chlortetracycline, oxytetracycline chủ yếu đƣợc sử dụng trong chăn nuôi để điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm và đƣợc phối hợp bổ sung với vitamin B12 vào thức ăn trong chăn nuôi có tác dụng kích thích tăng trọng.

Các kháng sinh nhóm tetracyclines bán tổng hợp đƣợc dùng rộng rãi hơn để điều trị các bệnh nhiễm trùng nhƣ bệnh đau mắt hột, mắt đỏ, viêm giác mạc, viêm phế quản, viêm tiết niệu do lậu cầu và đặc biệt để điều trị các bệnh dịch hạch [2]. Các tetracycline đều dễ bị kháng thuốc, ở Việt Nam có 92,9 % Salmonella typhi, 41,4% H. influenza, 87,8% Klebsiella pnuemoniae kháng lại thuốc tetracyclin… Cơ chế tác dụng của các tetracyclin là phong tỏa hoạt động của nhiều ezym tham gia vào các quá trình trao đổi chất, ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Khi kháng thuốc: vị trí gắn của tetracycline trên ribosom bị biến đổi do đó tetracycline không gắn đƣợc vào ribosom và mất đi tác dụng.

Các đại diện tiêu biểu cho nhóm bao gồm các chất sau: Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline,Minocyclin, Doxycyclin [2].2 Tính chất lý hóa của nhóm tetracycline Các tetracycline tồn tại dạng tinh thể màu vàng sáng, tan kém trong nƣớc, 1g /2500 mL nƣớc, hoặc 50 mL cồn. Tan tốt trong dung dịch kiềm và axit, đặc biệt 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] không tan trong dung môi chloroform và ether. Nhóm tetracycline bền vững với axit nên dùng để uống đƣợc nhƣng do có nhiều tác dụng phụ, đặc biệt là tạo phức canxi bền vững làm cho răng bị ố vàng nên bị cấm dùng cho trẻ em dƣới 10 tuổi. Tetracycline có tính chất lƣỡng tính, do trong phân tử của chúng chứa nhóm dimethylamino có khả năng tạo muối với canxi, các nhóm hydroxyl có khả năng tạo muối với kiềm hoặc với các ion Ca2+, Mg2+ (tạo tetracyclinate).

Bên cạnh đó, tetracycline không bền vững với các tác nhân oxy hóa ngay cả với oxy trong không khí, bị phân hủy bởi ánh sáng. Trong dung dịch kiềm, tetracycline dễ bị oxy hóa thành dẫn chất có màu thẫm. Do cấu trúc hydronaphtaxenic mà tetracycline dễ bị đồng phân hóa trong dung dịch pH từ 2,0 đến 6,0 tạo ra các epitetracycline không có tác dụng kháng sinh. Hiện tƣợng đồng phân hóa xảy ra nhanh hơn ở tetracycline và chlotetracycline.

Trong môi trƣờng kiềm hay quá axit (pH lớn hơn 9 hay pH nhỏ hơn 1) các tetracycline bị khử hoạt tính do tạo thành các dẫn chất anhydro và isotetracycline.Trong môi trƣờng axit loãng, tetracycline bị mất nƣớc để tạo thành anhydrotetracycline. Anhydrotetracycline bị phân hủy và lacton hóa tiếp tục để tạo thành apoterramycine. Apoterramycine Trong môi trƣờng kiềm nhẹ, carbon vị trí 11a của tetracycline, đƣợc biến đổi thành isotetracycline. 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] 11a Isotetracycline Tetracycline có khuynh hƣớng hình thành phức hợp với một số chất hoá học tại các nguyên tử oxy vòng B và C.

Phức chelate Tetracycline tạo phức chủ yếu với Fe 3+, Fe 2+, Cu 2+, Ni 2+, Co 2+, Zn 2+, Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Be 2+, Al 3+, phosphate, citrates, salicylat, p-hydroxybenzoat, anion saccharin, caffiene, urê, thiourea, polivinylpyrolidone, albumin huyết thanh, lipoprotein, globulins, và RNA. Các thông tin chung về nhóm tetracycline đƣa ra trong bảng 1.1 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.1Thông tin về nhóm tetracycline Tetracycline Oxytetracycline Chlotetracycline Danh pháp (4S,4aS,5aS,6S,12aR) 4- (4S,4aS,5aS,6S,12aR)- quốc tế -4-(dimethylamino)- (Dimethylamino)- 7-chloro-4- 1,6,10,11,12a- 1,4,4a,5,5a,6,11,12aoc (dimethylamino)- pentahydroxy-6- tahydro- 1,6,10,11,12a- methyl-3,12-dioxo- 3,5,6,10,12,12a - pentahydroxy-6-methyl- 4,4a,5,5a- hexahydroxy-6methyl- 3,12-dioxo-4,4a,5,5a- tetrahydrotetracene-2- 1,11-dioxo-2- tetrahydrotetracene-2- carboxamide naphthacenecaboxami carboxamide de Công thức C22H24N2O8 C22H24N2O9 C22H23 ClN2O8 phân tử Công thức cấu tạo Hợp chất R1 R4 TC Tetracycline H H OTC Oxytetracycline H OH CTC Chlotetracycline Cl H Khối lƣợng 444,44g/mol 460,44 g/mol 478.88 g/mol phân tử Nhiệt độ 1720 C 184,50 C 2150 C sôi 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Các phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thực phẩm phân tích tetracycline 1. Phƣơng pháp chiết tách tetracycline ra khỏi nền mẫu thực phẩm 1.

Phƣơng pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ lực cơ học Chiết lỏng rắn là quá trình dung môi thẩm thấu vào nền mẫu rắn, dựa vào khả năng hòa tan của dung môi với chất phân tích kết hợp lực lắc, rung siêu âm chất phân tích đƣợc tách ra khỏi nền mẫu rắn hòa tan trong dung môi. Tetracycline đƣợc chiết ra khỏi mẫu thực phẩm (thịt, thủy sản, trứng, sữa, mật ong.) bằng dung dịch đệm McILvaine - EDTA pH 4± 0,05 theo các tiêu chuẩn của Việt Nam [10], [11], [12], tiêu chuẩn quốc tế [18], [19]và có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng đệm này [23], [26], [41], [48], [50], [51], [56], [52], [62] cho kết quả về độ lặp lại rất tốt, ở khoảng nồng độ từ 1 – 200 µg/kg hệ số biến thiên CV nhỏ hơn 8,9%. Ngoài ra, sử dụng một số dung dịch chiết khác hỗn hợp Acetonitril + nƣớc để chiết mẫu thịt [23], [47],[61], dung dịch muối succinate điều chỉnh pH 4 để chiết mẫu trứng, sữa, thịt [23], [31] đƣa ra các két quả hệ số biến thiên CV nhỏ hơn 11,2 % đối với khoảng nồng độ từ 20 – 1200 µg/kg. Tuy nhiên không có thông tin về hiệu suất thu hồi của quá trình chiết mẫu của tất cả các tiêu chuẩn và công trình nghiên cứu.

Phƣơng pháp chiết lỏng rắn có hỗ trợ áp suất (PLE) Dựa trên nguyên tắc nhiệt độ sôi của dung môi đƣợc tăng lên dƣới áp suất cao, độ nhớt dung môi và sức căng bề mặt giảm, khả năng hòa tan của chất phân tích tăng làm suy yếu liên kết giữa chất phân tích với nền mẫu. Do áp suất cao cho phép các dung môi thâm nhập sâu hơn vào nền mẫu, tạo thuận lợi cho việc chiết các chất phân tích ra khỏi nền mẫu, làm quá trình chiết nhanh hơn và độ thu hồi tốt hơn (xem Hình 1. 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Bơm (1500-2000 psi) Dung môi Van thanh trùng Lò (100-1800C) Van chiết Van tĩnh Bình thu Nitrogen Hình 1.1 Mô hình phƣơng pháp chiết hỗ trợ áp suất Trong phƣơng pháp này, mẫu đƣợc nghiền nhỏ, trộn với tinh thể EDTA sau đó đƣợc đƣa vào hệ thống chiết PLE, dung môi đƣợc chọn là acetonitril[43], [69]methanol điều chỉnh pH =4 [40]. Phƣơng pháp cho hiệu suất thu hồi rất tốt trong khoảng 95 – 99,8% với khoảng nồng độ 20 – 500 µg/kg.

Các phƣơng pháp làm sạch dịch chiết mẫu 1. Phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE) Chiết pha rắn là quá trình phân bố của chất phân tích giữa 2 pha, trong đó lúc đầu chất phân tích tồn tại trong pha lỏng (pha nƣớc hoặc pha hữu cơ) còn chất chiết (pha tĩnh) ở dạng rắn, là các hạt silica trung tính, nhôm oxit, hay hạt sislica bị ankyl hóa nhóm -OH bằng nhóm carbon mạch thẳng - C2, -C4, -C8, -C18… hay nhân phenyl. Khi xử lý mẫu, dịch chiết đƣợc đƣa lên cột chiết SPE, nhóm chất cần phân tích đƣợc giữ lại trên cột, các chất khác không tƣơng tác đi ra khỏi cột cùng dung môi. Chất phân tích đƣợc rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi thích hợp Các phƣơng pháp tiêu chuẩn của Việt Nam[10], [11], [12], tiêu chuẩn quốc tế [18], [19] sử dụng cột chiết SPE C18 để làm sạch tạp chất sau khi chất phân tích đƣợc chiết ra khỏi nền mẫu.

Bên cạnh đó, có một số công trình nghiên cứu đã đƣợc công bố 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] cũng sử dụng cột chiết SPE C18 [23],[47],[51],[56],[57],[58],[62], [67] phù hợp với hầu hết các nền mẫu thực phẩm.