Luận văn thạc sĩ xây dựng phương pháp định tính định lượng flavonoid trong nụ và lá vối

Nghiên cứu phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong nụ và lá vối, góp phần nâng cao hiểu biết về thành phần hóa học của cây.

• Tác giả: Nguyễn Quốc Tuấn
• Người hướng dẫn: TS. Phương Thiện Thương
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Phương Pháp Định Tính, Định Lượng Flavonoid Trong Nụ Và Lá Vối
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan cây vối
• 1.2. Đặc điểm thực vật
• 1.3. Phân bố, sinh thái
• 1.4. Thu hái và chế biến
• 1.5. Thành phần hóa học
• 1.6. Flavonoid trong cây vối
• 1.7. Tác dụng sinh học
• 2. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Chiết xuất, phân lập flavonoid chính
• 2.3.2. Xác định cấu trúc chất phân lập
• 2.3.3. Xây dựng phƣơng pháp định tính trong nụ và lá vối
• 2.3.3.1. Định tính bằng phƣơng pháp hóa học
• 2.3.3.2. Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký
• 2.3.4. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối
• 2.3.4.1. Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng pháp trắc quang
• 2.3.4.2. Định lƣợng flavonoid chính bằng phƣơng pháp HPLC
• 2.3.5. Một số đặc trƣng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả
• 2.3.6. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi
• 2.3.6.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.3.6.2. Hóa chất, dung môi
• 3. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ cây vối
• 3.2. Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn
• 3.3. Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat
• 3.4. Xác định cấu trúc chất phân lập
• 3.5. Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối
• 3.5.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
• 3.5.2. Định tính bằng TLC
• 3.5.3. Định tính bằng HPLC
• 3.6. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối
• 3.6.1. Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang
• 3.6.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng CO-1 bằng HPLC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp định tính định lượng flavonoid trong nụ vối

Cây vối, với tên khoa học là Cleistocalyx operculatus, là một nguồn dược liệu quý giá. Nụ và lá vối chứa nhiều hợp chất flavonoid có giá trị sinh học cao. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong nụ vối là cần thiết để đảm bảo chất lượng dược liệu. Phương pháp này không chỉ giúp xác định thành phần hóa học mà còn hỗ trợ trong việc kiểm soát chất lượng sản phẩm dược phẩm từ cây vối.

1.1. Đặc điểm hóa học của flavonoid trong nụ vối

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học C6-C3-C6, thường gặp trong thực vật. Trong nụ vối, flavonoid chủ yếu tồn tại dưới dạng glycosid và có nhiều loại khác nhau như chalcone, flavanol, flavone. Các flavonoid này không chỉ có màu sắc đặc trưng mà còn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

1.2. Tác dụng sinh học của flavonoid trong nụ vối

Flavonoid trong nụ vối có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, chống ung thư, và ức chế các enzym gây hại. Nghiên cứu cho thấy các flavonoid này có khả năng triệt tiêu gốc tự do, bảo vệ tế bào khỏi tổn thương và giảm nguy cơ mắc các bệnh lý nghiêm trọng.

II. Vấn đề và thách thức trong việc định tính định lượng flavonoid

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về flavonoid trong nụ vối, nhưng việc xây dựng tiêu chuẩn định tính và định lượng vẫn còn nhiều thách thức. Các phương pháp hiện tại chưa đủ chính xác và đáng tin cậy để áp dụng rộng rãi trong kiểm tra chất lượng dược liệu. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để cải thiện quy trình này.

2.1. Khó khăn trong việc chiết xuất flavonoid

Quá trình chiết xuất flavonoid từ nụ vối thường gặp khó khăn do sự đa dạng về cấu trúc và tính chất của các hợp chất này. Việc lựa chọn dung môi và phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu suất chiết xuất cao.

2.2. Thiếu tiêu chuẩn định lượng chính xác

Hiện tại, chưa có tiêu chuẩn định lượng chính xác cho flavonoid trong nụ vối. Điều này gây khó khăn trong việc so sánh và đánh giá chất lượng giữa các mẫu khác nhau. Cần thiết phải phát triển các phương pháp định lượng mới, đáng tin cậy hơn.

III. Phương pháp định tính flavonoid trong nụ vối hiệu quả nhất

Để định tính flavonoid trong nụ vối, có nhiều phương pháp khác nhau được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm phương pháp hóa học, sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, nhưng đều hướng đến việc xác định chính xác thành phần flavonoid.

3.1. Phương pháp hóa học trong định tính flavonoid

Phương pháp hóa học thường sử dụng các phản ứng đặc trưng để xác định sự hiện diện của flavonoid. Các phản ứng này có thể tạo ra màu sắc đặc trưng, giúp nhận diện nhanh chóng các hợp chất flavonoid trong nụ vối.

3.2. Sắc ký lớp mỏng TLC trong phân tích flavonoid

Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp đơn giản và hiệu quả để phân tích flavonoid. Phương pháp này cho phép tách biệt các hợp chất trong nụ vối và xác định chúng dựa trên các chỉ số Rf. TLC cũng giúp theo dõi quá trình chiết xuất và tinh chế flavonoid.

3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trong định lượng

HPLC là phương pháp hiện đại và chính xác nhất để định lượng flavonoid. Phương pháp này cho phép phân tích nhanh chóng và định lượng chính xác các hợp chất flavonoid trong nụ vối, từ đó cung cấp thông tin cần thiết cho việc kiểm soát chất lượng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của flavonoid trong nụ vối

Nghiên cứu về flavonoid trong nụ vối đã cho thấy nhiều kết quả khả quan. Các flavonoid được phân lập và xác định có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, cũng như tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người. Những kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển sản phẩm từ nụ vối.

4.1. Kết quả chiết xuất flavonoid từ nụ vối

Quá trình chiết xuất flavonoid từ nụ vối đã cho thấy hiệu suất cao với nhiều hợp chất flavonoid được phân lập thành công. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nụ vối chứa hơn 20 loại flavonoid khác nhau, mỗi loại đều có tác dụng sinh học riêng.

4.2. Ứng dụng của flavonoid trong ngành dược phẩm

Flavonoid từ nụ vối có tiềm năng lớn trong ngành dược phẩm. Chúng có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh, đặc biệt là các bệnh liên quan đến oxy hóa và ung thư. Việc tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất và định lượng sẽ giúp nâng cao giá trị của nụ vối trên thị trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu flavonoid trong nụ vối

Nghiên cứu về flavonoid trong nụ vối đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc phát triển sản phẩm dược liệu. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện các phương pháp định tính, định lượng và tiêu chuẩn hóa chất lượng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương lai của nghiên cứu flavonoid

Nghiên cứu về flavonoid trong nụ vối sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các sản phẩm mới và cải thiện quy trình sản xuất. Các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học của flavonoid cũng sẽ được thực hiện để xác định rõ hơn về lợi ích của chúng.

5.2. Định hướng phát triển sản phẩm từ nụ vối

Định hướng phát triển sản phẩm từ nụ vối sẽ tập trung vào việc ứng dụng các flavonoid trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nụ vối sẽ là bước quan trọng để nâng cao giá trị sản phẩm trên thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây vối (Cleistocalyx operculatus) là một loại cây gỗ trung bình phổ biến ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ Việt Nam, được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian dưới dạng lá và nụ để pha trà uống hàng ngày. Theo ước tính, nụ vối chứa hơn 20 flavonoid khác nhau, một nhóm hợp chất có cấu trúc hóa học C6-C3-C6 với nhiều tác dụng sinh học quý giá như chống oxy hóa, chống ung thư, chống dị ứng và giảm đau. Flavonoid trong cây vối đã được chứng minh có khả năng ức chế các enzym quan trọng như xanthin oxydase, α-glucosidase, maltase, acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase, góp phần vào các tác dụng sinh học đa dạng.

Mặc dù trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V đã có chuyên luận về lá và nụ vối, nhưng chưa có tiêu chí định tính và định lượng flavonoid – thành phần chính và có tác dụng sinh học quan trọng. Do đó, nghiên cứu này nhằm xây dựng phương pháp định tính và định lượng flavonoid trong nụ và lá vối, làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu phục vụ quản lý thị trường.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các mẫu nụ và lá vối thu hái từ nhiều địa phương phía Bắc Việt Nam trong năm 2012, với mục tiêu phân lập flavonoid chính làm chất đối chiếu, xây dựng quy trình định tính và định lượng flavonoid toàn phần và flavonoid chính bằng các phương pháp hóa học, sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và trắc quang. Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chất lượng và giá trị dược liệu vối, góp phần phát triển ngành dược liệu và y học cổ truyền.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và phân loại flavonoid: Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên có khung C6-C3-C6, gồm các nhóm chính như chalcone, flavanol, flavone, flavanonol, có đặc tính hóa học và sinh học đa dạng.
• Phương pháp định tính flavonoid: Sử dụng phản ứng hóa học đặc trưng (phản ứng với NH3, NaOH, FeCl3, phản ứng Shinoda), sắc ký lớp mỏng (TLC) với các hệ dung môi phù hợp để phân tách và xác định flavonoid dựa trên hệ số di chuyển Rf.
• Phương pháp định lượng flavonoid: Áp dụng phương pháp trắc quang dựa trên phản ứng tạo phức màu với AlCl3 đo hấp thụ ở bước sóng 510 nm, và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng flavonoid chính với độ chính xác cao.
• Phân tích cấu trúc hợp chất: Sử dụng phổ UV, IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và khối phổ (MS) để xác định cấu trúc flavonoid phân lập.

Các khái niệm chính bao gồm flavonoid, sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phản ứng hóa học định tính, phổ phân tích (UV, IR, NMR, MS).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu nụ và lá vối được thu hái từ 14 địa phương phía Bắc Việt Nam trong năm 2012, với độ ẩm mẫu dao động từ 6,77% đến 15,10%. Mẫu được phơi khô, nghiền mịn và lưu giữ tại Viện Dược liệu.
• Chiết xuất và phân lập flavonoid: Chiết xuất bằng ethanol 96% theo phương pháp ngâm lạnh, phân đoạn bằng dung môi n-hexan, ethyl acetat và n-butanol. Phân lập flavonoid chính từ phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan:ethyl acetat tăng dần độ phân cực.
• Xác định cấu trúc: Đánh giá độ tinh khiết bằng HPLC, xác định cấu trúc bằng phổ UV (đỉnh hấp thụ 340 nm), phổ IR (các nhóm chức OH, C=O, C=C, C-O), phổ 1H-NMR và 13C-NMR, khối phổ MS.
• Xây dựng phương pháp định tính: Sử dụng phản ứng hóa học đặc trưng và sắc ký lớp mỏng (TLC) với bản mỏng silica gel GF254, khảo sát hệ dung môi phù hợp để phân tách flavonoid trong nụ và lá vối.
• Xây dựng phương pháp định lượng: Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp trắc quang dựa trên phản ứng tạo phức với AlCl3 đo hấp thụ ở 510 nm, sử dụng chất chuẩn CO-1 và catechin. Định lượng flavonoid chính bằng HPLC với cột RP18, pha động methanol - nước có điều chỉnh pH, phát hiện ở bước sóng phù hợp.
• Phân tích số liệu: Sử dụng các chỉ số thống kê như giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) để đánh giá độ chính xác, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp.

Thời gian nghiên cứu tập trung trong năm 2012, với quy trình chiết xuất, phân lập, xây dựng và hiệu chuẩn phương pháp được thực hiện liên tục.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập flavonoid chính CO-1 từ nụ vối: Từ 8 kg nụ vối khô, chiết xuất ethanol 96% thu được 1192 g cao toàn phần. Phân đoạn ethyl acetat chiếm 640 g, từ đó phân lập được 4,329 g flavonoid chính CO-1 có độ tinh khiết 98,21% theo HPLC. Chất CO-1 được xác định là 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone với công thức phân tử C18H18O4, khối lượng phân tử 298 amu.

2. Xây dựng phương pháp định tính flavonoid: Phản ứng hóa học đặc trưng với NH3, NaOH, FeCl3 và phản ứng Shinoda đều cho kết quả dương tính với flavonoid trong dịch chiết nụ và lá vối. Phương pháp TLC với hệ dung môi n-hexan:ethyl acetat (2:1) cho sắc ký đồ rõ ràng với giá trị Rf flavonoid chính khoảng 0,47, phù hợp với mẫu chuẩn CO-1.

3. Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần bằng trắc quang: Phương pháp tạo phức màu với AlCl3 đo hấp thụ ở 510 nm cho kết quả tuyến tính trong khoảng nồng độ flavonoid từ khoảng 10^-5 đến 10^-7 M, với độ lặp lại RSD dưới 3%, độ đúng thu hồi trên 98%. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu nụ và lá vối dao động từ khoảng 0,5% đến 2,3% tính theo CO-1.

4. Phương pháp định lượng flavonoid chính bằng HPLC: Phương pháp HPLC với cột RP18, pha động methanol - nước có điều chỉnh pH, phát hiện ở bước sóng 340 nm cho đường chuẩn tuyến tính với hệ số tương quan R^2 > 0,999. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là khoảng 0,1 μg/ml và 0,3 μg/ml. Hàm lượng flavonoid CO-1 trong nụ và lá vối dao động từ 0,1% đến 0,8%.

Thảo luận kết quả

Việc phân lập thành công flavonoid chính CO-1 với độ tinh khiết cao làm cơ sở vững chắc cho việc xây dựng phương pháp định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu vối. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học và TLC phù hợp với các nghiên cứu trước đây về flavonoid trong thực vật, khẳng định tính đặc hiệu của phương pháp.

Phương pháp trắc quang cho phép định lượng flavonoid toàn phần với độ nhạy và độ chính xác cao, thuận tiện cho kiểm tra chất lượng dược liệu. Phương pháp HPLC cung cấp kết quả định lượng flavonoid chính chính xác, có thể áp dụng trong kiểm soát chất lượng và nghiên cứu dược lý.

So sánh với các nghiên cứu khác, hàm lượng flavonoid trong nụ và lá vối tương đối cao, phù hợp với tác dụng sinh học đã được chứng minh như chống oxy hóa, chống ung thư và ức chế enzym. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ sắc ký HPLC, bảng hàm lượng flavonoid trong các mẫu và đồ thị đường chuẩn để minh họa tính tuyến tính và độ nhạy của phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng flavonoid trong nụ và lá vối: Áp dụng phương pháp định tính và định lượng đã xây dựng để làm tiêu chí kiểm tra chất lượng dược liệu trên thị trường, đảm bảo hàm lượng flavonoid tối thiểu và độ tinh khiết phù hợp. Thời gian thực hiện: 1-2 năm; chủ thể: Viện Dược liệu, Bộ Y tế.

2. Phát triển quy trình sản xuất dược liệu chuẩn hóa: Hướng dẫn thu hái, chế biến và bảo quản nụ, lá vối nhằm giữ nguyên hàm lượng flavonoid, nâng cao hiệu quả sinh học. Thời gian: 2 năm; chủ thể: Các cơ sở sản xuất dược liệu, hợp tác xã nông nghiệp.

3. Ứng dụng flavonoid CO-1 làm chất chuẩn trong nghiên cứu và sản xuất: Sử dụng flavonoid chính phân lập làm chất đối chiếu trong phân tích định tính, định lượng và phát triển sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng. Thời gian: 1 năm; chủ thể: Các viện nghiên cứu, doanh nghiệp dược phẩm.

4. Mở rộng nghiên cứu tác dụng sinh học và dược động học flavonoid: Tiếp tục đánh giá tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm và các tác dụng dược lý khác của flavonoid trong nụ và lá vối, đồng thời nghiên cứu hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể. Thời gian: 3-5 năm; chủ thể: Các trường đại học, viện nghiên cứu y dược.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu dược liệu và hóa phân tích: Sử dụng phương pháp định tính, định lượng flavonoid làm cơ sở nghiên cứu thành phần hoạt chất trong dược liệu, phát triển tiêu chuẩn chất lượng.

2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Áp dụng quy trình chiết xuất, phân lập flavonoid và phương pháp phân tích để kiểm soát chất lượng nguyên liệu và sản phẩm.

3. Cơ quan quản lý nhà nước về dược liệu: Dùng kết quả nghiên cứu làm căn cứ xây dựng tiêu chuẩn, quy định kiểm tra chất lượng dược liệu vối trên thị trường.

4. Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành hóa phân tích, dược học: Tham khảo quy trình nghiên cứu, phương pháp phân tích hiện đại và ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp nào được sử dụng để phân lập flavonoid chính trong nụ vối?
   Phân lập flavonoid chính CO-1 được thực hiện bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan:ethyl acetat tăng dần độ phân cực, sau đó xác định cấu trúc bằng phổ UV, IR, NMR và MS.

2. Làm thế nào để định tính flavonoid trong nụ và lá vối?
   Định tính flavonoid dựa trên phản ứng hóa học đặc trưng với NH3, NaOH, FeCl3 và phản ứng Shinoda, kết hợp sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi phù hợp để quan sát sắc ký đồ và giá trị Rf.

3. Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần được thực hiện như thế nào?
   Sử dụng phương pháp trắc quang dựa trên phản ứng tạo phức màu với AlCl3, đo hấp thụ ở bước sóng 510 nm, tính hàm lượng flavonoid theo chất chuẩn CO-1 hoặc catechin.

4. Độ chính xác và độ nhạy của phương pháp HPLC định lượng flavonoid chính ra sao?
   Phương pháp HPLC có độ tuyến tính cao (R^2 > 0,999), giới hạn phát hiện khoảng 0,1 μg/ml, giới hạn định lượng khoảng 0,3 μg/ml, độ lặp lại RSD dưới 3%, đảm bảo độ chính xác và nhạy cao.

5. Tác dụng sinh học chính của flavonoid trong cây vối là gì?
   Flavonoid trong vối có tác dụng chống oxy hóa mạnh, ức chế sự phát triển tế bào ung thư, giảm đường huyết, chống viêm và bảo vệ hệ tim mạch, phù hợp với các ứng dụng y học dân gian và hiện đại.

Kết luận

• Đã phân lập thành công flavonoid chính CO-1 từ nụ vối với độ tinh khiết 98,21%, xác định cấu trúc là 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone.
• Xây dựng phương pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng (TLC) với độ đặc hiệu cao.
• Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần bằng trắc quang và flavonoid chính bằng HPLC được phát triển với độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại tốt.
• Kết quả nghiên cứu làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn chất lượng dược liệu nụ và lá vối, góp phần nâng cao giá trị và ứng dụng của cây vối trong y học.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu mở rộng về tác dụng sinh học và phát triển sản phẩm từ flavonoid vối trong các năm tiếp theo.

Áp dụng phương pháp đã xây dựng vào kiểm soát chất lượng dược liệu, phát triển tiêu chuẩn quốc gia và nghiên cứu ứng dụng dược lý sâu hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nƣớc uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực. Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây Vối.

Thành phần hóa học chính của lá và nụ Vối gồm tinh dầu, triterpenoid và flavonoid. Theo Trung học dƣợc từ hải I (1993), tinh dầu lá vối có 27 thành phần. Vỏ cây chứa một chất triterpen nhóm ursan đã đƣợc nhận dạng là acid ursolic. Nụ vối có nhiều thành phần hóa học đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chủ yếu là các flavonoid.

Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid khác nhau. Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn có cấu trúc hóa học C6-C3-C6, thƣờng gặp nhiều trong thực vật. Đến nay, số lƣợng flavonoid từ thực vật đã đƣợc tìm thấy lên tới trên 8150 flavonoid khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý nhƣ chống ung thƣ, chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm.

Do đó, chúng đƣợc dùng nhiều trong các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, và mỹ phẩm, phục vụ lợi ích của con ngƣời. Các flavonoid của lá và nụ vối cũng đã đƣợc chứng minh có nhiều tác dụng sinh học quan trọng nhƣ chống oxy hóa, chống ung thƣ, ức chế một số enzym (xanthin oxydase, α-glucosidase, maltase, acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase). Đặc biệt, một số chất một hợp chất có tác dụng đối với ung thƣ nhƣ 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone, 3,5',3'- trihydroxy-6,7,4'-trimethoxy flavon; 3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'-tetramethoxy 9 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Do đƣợc sử dụng nhiều để làm trà uống và làm thuốc trong y học dân gian nên cần thiết phải có tiêu chuẩn cho nguyên liệu lá và nụ vối.

Trong dự thảo Dƣợc Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chƣa có tiêu chí về định tính và định lƣợng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng. Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lƣợng dƣợc liệu trên thị trƣờng.

Các mục tiêu của đề tài gồm có: • Phân lập đƣợc một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lƣợng flavonoid. • Xây dựng đƣợc quy trình định tính và định lƣợng flavonoid trong dƣợc liệu nụ và lá vối. 10 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây vối 1.1 Tên gọi - Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà - Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb. et Perry - Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb.2 Đặc điểm thực vật Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân nứt nẻ, màu nâu đen.

Cành nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn [3, 4, 10, 22, 42]. Lá đơn mọc đối, có cuống dài 1-1,5 cm, dai, cứng, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, dài 8-20 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn ở gốc, có mũi ngắn. Hai mặt lá có hai màu khác nhau, có nhiều tuyến mờ nâu, lá già mặt dƣới của lá có chấm nâu, gân phụ khoảng 10 cặp cách mép là 3-5 mm [3, 4, 10, 22, 42]. Hoa nhỏ màu trắng lục nhạt, gần nhƣ không cuống, hợp thành cụm hoa dạng chùy rộng, mọc ở kẽ những lá đã rụng.

Nụ hoa dài, lá bắc dễ rụng. Đài dính vào bầu. Hoa đều lƣỡng tính 4 cánh hình tròn hay hình bầu dục, nhiều tuyến mờ dính lại ở đỉnh thành mũ hình chóp. Nhị nhiều xếp thành 7-9 dãy có hình bầu dục nằm sâu trong ống đài, bị nhị che kín [3, 4, 10, 22, 42].

Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đƣờng kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có màu tím, thể chất nạc, vị ngọt [3, 4, 10, 22, 42]. Mùa hoa quả: Tháng 4 – 6 1.3 Phân bố, sinh thái 11 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Chi Cleistocalyx Blume gồm một số loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á. Việt Nam có 3 loài Vối là cây đặc hữu của vùng Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, vối mọc tự nhiên dọc theo suối hay bờ ao hồ ở vùng núi thấp và trung du, thuộc các tỉnh Cao Bằng (Hà Quảng, Thông Nông, Thạch An…); Lạng Sơn (Đồng Mỏ, Hữu Lũng); Bắc Giang (Sơn Động, Lục Nam, Yên Thế.); Vĩnh Phúc (Lập Thạch, Tam Dƣơng); Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Tây, Hòa Bình….Cây vối còn đƣợc trồng rải rác trong nhân dân các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ.

Vối thuộc loại cây gỗ ƣa sáng, ƣa ẩm, sinh trƣởng và phát triển nhanh; trong vòng 3 năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5 m. Cây phân cành nhiều chồi và lá non ra nhiều trong mùa xuân, hè. Những cây mọc ở chỗ đƣợc chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt. a) Cây vối b) Nụ vối tƣơi b) Nụ vối khô ơ Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối 1.4 Thu hái và chế biến Hái lá tƣơi, phơi khô, nhƣng có ngƣời đem ủ rồi mới phơi khô, cách làm nhƣ sau: thái nhỏ, rửa sạch, cho vào thùng hay thúng ủ cho đến khi đen đều thì 12 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] lấy ra rửa sạch, phơi khô.

Lá vối ủ uống thơm ngon hơn. Để làm thuốc thƣờng dùng lá tƣơi phơi khô [4,10]. Nụ vối đƣợc thu hái, phơi khô dùng để pha nƣớc và làm thuốc [4, 10].5 Thành phần hóa học Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen [3, 4, 17]. Trong lá vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đƣờng tự do và sterol.

Vỏ cây chứa triterpen nhóm ursan là acid usolic [3]. Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa học đƣợc trình bày ở Bảng 1. - Tinh dầu: Từ mẫu nụ vối Việt Nam, với phƣơng pháp sắc kí khí khối phổ GC/MS, Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã xác định đƣợc 55 thành phần khác nhau có trong tinh dầu nụ vối (Bảng 1.1), gồm các monoterpen, serquiterpen và hydrocarbon serquiterpen [5]. 13 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Các thành phần chính trong tinh dầu nụ vối STT Thành phần chính Tỷ lệ (%) 1 α-pinen 3,45 2 β-pinen 3,07 3 β-myrcen 2,40 4 Camphen 4,12 5 γ-terpinen 5,76 6 Cis-linalool oxide 5,21 7 Terpinen-4-ol 2,58 8 Trans-carveol 3,93 9 2,3-dehydro-1,4-cineol 3,01 10 γ-amorphen 2,12 11 Cyclobazzanen 3,12 12 α-cadinen 1,47 13 Globulol 5,61 14 β-himachalol 3,84 15 Acorenol 5,12 16 1-hexanol 2,59 17 2-heptanen 2,03 18 Presilphiperfol-1-en 2,48 19 α-terpinen 1,19 20 Cis-verbenol 1,85 21 Methyl jasmonate 1,92 22 1,8-oxidocadin-4-en 1,84 14 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] - Thành phần khác: ethyl galat, acid galic, acid ursolic, β-sitosterol và acid cinamic [3, 4, 17, 21, 33].6 Flavonoid trong cây Vối Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thƣờng gặp trong thực vật. Về cấu trúc hóa học flavonoid có khung cơ bản theo kiểu C6-C3-C6 (có 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon) và đƣợc chia làm nhiều nhóm khác nhau [16]. Đã có nhiều nhà khoa học trong và ngoài nƣớc nghiên cứu về thành phần hóa học của cây vối đều chỉ ra rằng flavonoid trong lá và nụ vối có thể ở dạng tự do hoặc dạng glycosid. Chủ yếu là nhóm chalcone, flavanol, flavone và flavanonol.

Các flavonoid thƣờng dễ kết tinh và thƣờng có màu. Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu da cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; Chalcone màu vàng đến cam-đỏ; flavanonol kết tinh không màu. Các flavonoid đƣợc trình bày ở bảng 1. 15 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.2: Thành phần flavonoid trong nụ vối TT Tên chất Công thức cấu tạo Tài liệu [18], 1 2',4'-dihydroxy-6'- [22], methoxy-3',5'- [33] dimethylchalcone 2 5,7-dihydroxy-6,8- [22] dimethylflavone 3 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- [22] dimethylflavanon 4 3'-formyl-4',6',4- [27] trihydroxy-2'-methoxy-5'- methylchalcone 3'-formyl-6',4-dihydroxy- 2’-methoxy-5'- [27] 5 methylchalcone 4'-O-β-D- glucopyranosid 16 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] 6 (2S)-8-formyl-6- [33] methylnaringenin (2S)-8-formyl-6- 7 [27] methylnaringenin 7-O-β- D-glucopyranosid 8 (2S)-8-formyl-5-hydroxy- [31], 7-methoxy-6- [33] methylflavanon 9 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- [33] dimethylisoflavone 10 (2S,3S)-2,3-trans-5,7 [33] dihydroxy-6,8 dimethyldihydroflavonol 17 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] 11 (2S)-2,7-dihydroxy-5- [33] methoxy-6,8- dimethylflavanol 12 (E)-4,2',4'-trihydroxy-6'- methoxy-3',5'- [33] dimethylchalcone 13 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- [33] dimethylflavone 14 (2S)-5-hydroxy-7- [33] methoxy-6,8- dimethylflavanol 2',4'-dihydroxy-3'-methyl- 15 6'-methoxychalcone [33] 16 (2S)-6-formyl-8-methyl-7- O-methylpinocembrin [33] 18 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] (2S)-7-hydroxy-5- 17 methoxy-8- [18] methylflavanon 18 (2S)-8-methylpinocembrin [18] 2,2',4'-trihydroxy-6'- 19 methoxy-3',5'- [18] dimethylchalcone 20 Quercetin [28] 21 Kaempferol [28] 19 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] 22 Tamarixetin [28] 23 Myricetin-3'-methylether [28] 24 Myricetin-3'-methyether- [28] 3-O-β-D- galactopyranoside 25 5,7,8,4'-Tetrahydroxy- [28] 3',5'-dimethoxyflavone-3- O-β-D-galactopyranoside 26 Gossypetin-8,3'- [28] dimethyether-3-O-β-D- galactoside 20 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.7 Tác dụng sinh học a) Tác dụng của lá và nụ vối.

Năm 1968, Nguyễn Đức Minh thuộc phòng đông y thực nghiệm Viện nghiên cứu Đông y [10], nghiên cứu thăm dò tính kháng khuẩn của lá và nụ vối với một số vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) đã đi tới kết luận sau: - Ở tất cả các giai đoạn phát triển lá và nụ vối đều có tác dụng kháng khuẩn. Mùa đông kháng sinh tập chung nhiều nhất ở lá. - Chất kháng khuẩn tan trong nƣớc, các dung môi hữu cơ nhƣ ether, CCl 4, ehtyl acetat, chloroform, aceton, toluen, dầu hỏa. - Chất kháng khuẩn bền vững với nhiệt độ 1000C/30 phút, bền vững ở môi trƣờng có PH > 7, tác dụng mạnh nhất đối với Streptococcus (hemolytic và staman), sau đó đến vi khuẩn bạch cầu và Staphylococcus và Pneumococcus.

- Chất kháng khuẩn có thể kết tinh trong hỗn hợp dung môi methanol: nƣớc, cho tinh thể hình kim không màu. - Liều độc cao LD50 = 7830 mg/kg (thử trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống) * Chất chiết từ nụ vối bằng chloroform tách khỏi dung dịch đệm PH > 7 có màu vàng, vị đắng, dạng muối natri tan nhiều trong nƣớc có tác dụng đặc biệt với đơn bào Entamoeba histolytica, E. moshkovskii ở độ pha loãng 1/1200. * Chất kháng khuẩn làm tăng khả năng thực bào trên chuột lang, tăng cƣờng co bóp tim cô lập, tăng huyết áp nhẹ trên thỏ [3, 10].

Đào Thị Thanh Hiền đã thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu lá vối ủ, tinh dầu lá vối không ủ, cao khô lá vối ủ, cao khô lá vối không ủ đối với: Vi khuẩn Gram (-): E. aeruginosa, vi khuẩn Gr (+): Bacteroides subtillis, S. aureus, nấm mốc: Asp. niger, Furanium oxysporum, nấm men: Candida albicans.