Luận văn thạc sĩ xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các flavonoid baicalein baicalin chrysin trong vị thuốc hoàng bá nam cortex oroxyli indici

Nghiên cứu phương pháp định lượng đồng thời ba flavonoid baicalein, baicalin, chrysin trong vị thuốc hoàng bá nam cortex oroxyli indici.

• Tác giả: Hoàng Thị Tuyết
• Người hướng dẫn: PGS.TS Phương Thiện Thương
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Đồng Thời Các Flavonoid: Baicalein, Baicalin, Chrysin Trong Vị Thuốc Hoàng Bá Nam (Cortex Oroxyli Indici)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY HOÀNG BÁ NAM
• 1.2. Đặc điểm thực vật
• 1.3. Phân bố và sinh thái của cây Hoàng bá nam
• 1.4. Bộ phận dùng
• 1.5. Thành phần hóa học
• 1.5.1. Nhóm flavonoid
• 1.5.2. Nhóm stilbenoid
• 1.5.3. Các nhóm chất khác
• 1.6. Công dụng
• 1.7. Tác dụng sinh học
• 1.7.1. Tác dụng chống viêm
• 1.7.2. Tác dụng chống oxy hóa
• 1.7.3. Tác dụng kháng khuẩn
• 1.7.4. Tác dụng chống choáng phản vệ
• 1.7.5. Tác dụng lên các limpho bào
• 2. CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn
• 2.6. Tối ưu hóa hệ thống phân tích sắc ký
• 2.7. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
• 2.7.1. Tính chọn lọc, độ đặc hiệu
• 2.7.2. Tính thích hợp của hệ thống
• 2.7.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
• 2.7.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
• 2.7.5. Độ lặp lại trong ngày và khác ngày
• 2.7.6. Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ)
• 2.8. Phân tích mẫu thực tế
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời baicalein, baicalin, chrysin
• 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
• 3.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
• 3.4. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu
• 3.5. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích định lượng đồng thời baicalin, baicalein và chrysin trong dược liệu hoàng bá nam
• 3.6. Tính thích hợp của hệ thống
• 3.7. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.8. Độ lặp lại trong ngày và khác ngày
• 3.9. Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ)
• 3.10. Áp dụng phương pháp định lượng baicalein, baicalin và chrysin trên các mẫu Hoàng bá nam
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp định lượng flavonoid trong Hoàng bá nam

Hoàng bá nam, hay Cortex Oroxyli indici, là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền Việt Nam. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp định lượng flavonoid trong Hoàng bá nam không chỉ giúp nâng cao chất lượng dược liệu mà còn đảm bảo hiệu quả điều trị. Flavonoid, đặc biệt là ba hoạt chất baicalein, baicalin và chrysin, đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học như chống viêm, chống oxy hóa và ức chế tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc định lượng chính xác các hoạt chất này vẫn còn nhiều thách thức.

1.1. Đặc điểm và thành phần hóa học của Hoàng bá nam

Hoàng bá nam chứa nhiều nhóm hợp chất hóa học, trong đó flavonoid là nhóm chính. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ba hoạt chất chính là baicalein, baicalin và chrysin có mặt trong dược liệu này. Những hoạt chất này không chỉ có giá trị dược lý mà còn có thể được sử dụng để định lượng chất lượng dược liệu.

1.2. Tác dụng sinh học của flavonoid trong Hoàng bá nam

Flavonoid trong Hoàng bá nam có nhiều tác dụng sinh học quan trọng. Chúng có khả năng chống viêm, chống oxy hóa và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy ba hoạt chất baicalein, baicalin và chrysin có thể cải thiện chức năng thận và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác nhau.

II. Vấn đề và thách thức trong định lượng flavonoid

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về flavonoid trong Hoàng bá nam, nhưng việc định lượng chính xác vẫn gặp nhiều khó khăn. Các phương pháp truyền thống thường không đủ độ nhạy và độ chính xác. Hơn nữa, sự biến đổi trong thành phần hóa học của dược liệu cũng gây khó khăn trong việc xác định hàm lượng flavonoid.

2.1. Khó khăn trong việc chuẩn bị mẫu

Việc chuẩn bị mẫu cho quá trình phân tích là một trong những bước quan trọng nhất. Các phương pháp chiết xuất hiện tại chưa tối ưu hóa được hiệu suất chiết xuất flavonoid, dẫn đến việc thu được hàm lượng thấp hơn so với thực tế.

2.2. Độ nhạy và độ chính xác của các phương pháp phân tích

Các phương pháp phân tích hiện tại như HPLC-UV cần được tối ưu hóa để nâng cao độ nhạy và độ chính xác. Việc xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cũng cần được thực hiện để đảm bảo kết quả phân tích đáng tin cậy.

III. Phương pháp HPLC UV trong định lượng flavonoid

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với phát hiện quang phổ tử ngoại (UV) đã được áp dụng để định lượng đồng thời ba flavonoid trong Hoàng bá nam. Phương pháp này cho phép phân tích nhanh chóng và chính xác hàm lượng các hoạt chất chính trong dược liệu.

3.1. Nguyên lý hoạt động của phương pháp HPLC UV

HPLC-UV hoạt động dựa trên nguyên lý phân tách các hợp chất dựa trên độ hòa tan và tương tác với pha tĩnh. Các hợp chất flavonoid sẽ được tách ra và phát hiện qua quang phổ UV, cho phép xác định hàm lượng chính xác.

3.2. Quy trình tối ưu hóa phương pháp HPLC UV

Quy trình tối ưu hóa bao gồm việc lựa chọn dung môi, điều chỉnh pH và tốc độ dòng chảy. Các yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến độ phân giải và độ nhạy của phương pháp, từ đó nâng cao khả năng phát hiện các flavonoid trong mẫu.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp HPLC-UV có thể định lượng chính xác hàm lượng ba flavonoid trong Hoàng bá nam. Các mẫu dược liệu từ nhiều vùng khác nhau của Việt Nam đã được phân tích, cho thấy sự khác biệt về hàm lượng flavonoid giữa các vùng. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược liệu chất lượng cao.

4.1. Phân tích hàm lượng flavonoid trong các mẫu Hoàng bá nam

Các mẫu Hoàng bá nam từ các tỉnh như Hà Giang, Yên Bái đã được phân tích. Kết quả cho thấy hàm lượng ba flavonoid có sự khác biệt rõ rệt, điều này có thể liên quan đến điều kiện sinh thái và phương pháp thu hái.

4.2. Ứng dụng của phương pháp trong sản xuất dược phẩm

Phương pháp HPLC-UV không chỉ giúp định lượng chính xác flavonoid mà còn có thể được áp dụng trong sản xuất dược phẩm. Điều này giúp nâng cao chất lượng sản phẩm và đảm bảo hiệu quả điều trị cho người tiêu dùng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Việc xây dựng phương pháp định lượng flavonoid trong Hoàng bá nam là một bước tiến quan trọng trong nghiên cứu dược liệu. Phương pháp HPLC-UV đã chứng minh được tính hiệu quả và độ chính xác. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện phương pháp và mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu dược liệu

Nghiên cứu dược liệu không chỉ giúp bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên mà còn góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng. Việc định lượng chính xác các hoạt chất trong dược liệu là rất cần thiết.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phát triển các phương pháp phân tích mới, cải thiện độ nhạy và độ chính xác, cũng như mở rộng nghiên cứu sang các dược liệu khác có chứa flavonoid.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng các dược liệu thực vật. Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) là một trong những vị thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền với công dụng thanh can giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng, nhuận phế, điều trị viêm họng, ho khản tiếng, đau dạ dày, lỵ, viêm đường tiết niệu. Theo ước tính, nguồn nguyên liệu Hoàng bá nam tại Việt Nam có thể khai thác hàng trăm tấn mỗi năm, tập trung chủ yếu ở các tỉnh Hà Giang, Yên Bái, Tuyên Quang, Hòa Bình, Thanh Hóa.

Thành phần hóa học chính của dược liệu này là nhóm flavonoid, trong đó baicalein, baicalin và chrysin là những hoạt chất có tác dụng sinh học nổi bật như chống viêm, chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và virus HIV-1. Tuy nhiên, tiêu chuẩn đánh giá chất lượng dược liệu Hoàng bá nam hiện nay theo Dược điển Việt Nam V (2017) mới chỉ dựa trên các tiêu chí mô tả, vi phẫu, soi bột mà chưa có chỉ tiêu định lượng hàm lượng các flavonoid chính bằng phương pháp sắc ký hiện đại.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng phương pháp định lượng đồng thời ba flavonoid baicalein, baicalin và chrysin trong dược liệu Hoàng bá nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detector UV (HPLC-UV). Phương pháp này sẽ được áp dụng để đánh giá hàm lượng hoạt chất trong các mẫu dược liệu thu thập từ nhiều vùng khác nhau của Việt Nam, góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng và đảm bảo hiệu quả sử dụng dược liệu trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào dược liệu Hoàng bá nam thu hái tại các tỉnh Lạng Sơn, Hòa Bình, Nghệ An, Sapa, Phú Thọ trong giai đoạn 2016-2019. Ý nghĩa nghiên cứu được thể hiện qua việc cung cấp phương pháp phân tích chính xác, tin cậy, giúp kiểm soát chất lượng dược liệu, từ đó nâng cao giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn trong ngành dược liệu Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

• Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Phương pháp phân tích dựa trên sự phân bố khác nhau của các hợp chất trong pha tĩnh (cột C18) và pha động (hỗn hợp nước, acetonitril, acid formic). HPLC cho phép tách và định lượng chính xác các flavonoid trong hỗn hợp phức tạp của dược liệu.

• Lý thuyết quang phổ UV-Vis: Flavonoid hấp thụ mạnh trong vùng tử ngoại-khả kiến, với baicalein, baicalin và chrysin có bước sóng hấp thụ cực đại lần lượt khoảng 275,6 nm, 277,6 nm và 268,5 nm. Bước sóng 280 nm được chọn làm bước sóng phát hiện trong HPLC-UV để định lượng đồng thời ba hợp chất.

• Khái niệm flavonoid và hoạt tính sinh học: Baicalein, baicalin và chrysin thuộc nhóm flavon, có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và virus, là các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng dược liệu Hoàng bá nam.

• Khái niệm về độ chọn lọc, độ chính xác, độ lặp lại và giới hạn phát hiện trong phân tích hóa học: Các chỉ tiêu này được sử dụng để thẩm định giá trị sử dụng của phương pháp phân tích xây dựng.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu dược liệu Hoàng bá nam được thu hái tại 6 địa điểm khác nhau gồm Lạng Sơn, Hòa Bình, Nghệ An, Sapa, Phú Thọ trong giai đoạn 2016-2019. Mẫu được xử lý, nghiền mịn kích thước 1 mm, bảo quản tại Viện Dược liệu.

• Chất chuẩn: Baicalein, baicalin và chrysin được phân lập từ Hoàng bá nam với độ tinh khiết ≥ 95%, kiểm tra bằng HPLC-DAD.

• Thiết bị: Hệ thống HPLC Shimadzu với cột Ascentis C18 (15 cm x 4,6 mm, 5 µm), detector UV-VIS, máy quang phổ UV-Vis Shimadzu UV-1800, máy rung siêu âm Power Sonic 405.

• Phương pháp xử lý mẫu: Khảo sát các dung môi chiết (methanol, ethanol và các nồng độ pha loãng), phương pháp chiết siêu âm và chiết hồi lưu cách thủy, thời gian và số lần chiết để tối ưu hiệu suất chiết flavonoid.

• Phân tích sắc ký: Tối ưu điều kiện sắc ký với pha động gồm 0,1% acid formic trong nước (kênh A) và acetonitril (kênh B) theo chương trình gradient, bước sóng phát hiện 280 nm, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, nhiệt độ cột 25°C.

• Thẩm định phương pháp: Đánh giá tính chọn lọc, độ đặc hiệu, độ tuyến tính (R² > 0,99), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại trong ngày và khác ngày, độ đúng (hiệu suất thu hồi), ước lượng độ không đảm bảo đo theo hướng dẫn ICH và AOAC.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện trong năm 2018-2019, bao gồm thu thập mẫu, khảo sát điều kiện chiết và sắc ký, thẩm định phương pháp và áp dụng phân tích mẫu thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Khảo sát bước sóng hấp thụ UV-Vis: Baicalein, baicalin và chrysin có đỉnh hấp thụ cực đại lần lượt tại 275,6 nm, 277,6 nm và 268,5 nm. Bước sóng 280 nm được chọn làm bước sóng phát hiện trong HPLC-UV để định lượng đồng thời ba hợp chất.

2. Tối ưu hệ pha động và chương trình gradient: Hệ gradient 2 (0,1% acid formic trong nước và acetonitril với tỷ lệ thay đổi theo thời gian) cho kết quả tách tốt nhất với thời gian lưu của baicalin, baicalein, chrysin lần lượt là 20,205 phút, 7,047 phút và 29,224 phút. Độ phân giải Rs ≥ 1,98 và hệ số kéo đuôi As nằm trong khoảng 0,98-1,06, đảm bảo tách biệt rõ ràng các pic.

3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: Đường chuẩn của ba hợp chất có hệ số tương quan R² ≥ 0,9997, cho thấy độ tuyến tính cao trong khoảng nồng độ: baicalin 12,5-400 µg/ml, baicalein 6,575-210,4 µg/ml, chrysin 3,125-100 µg/ml. Giá trị Pvalue > 0,05 chứng tỏ không có sai số hệ thống trong phương trình hồi quy.

4. Khảo sát dung môi chiết: Ethanol 70% là dung môi chiết tối ưu, cho hàm lượng baicalin 1,158%, baicalein 0,712%, chrysin 0,280% cao nhất so với các dung môi khác. Đây là dung môi an toàn, kinh tế và hiệu quả trong chiết flavonoid.

5. Khảo sát phương pháp chiết: Phương pháp chiết hồi lưu cách thủy 30 phút cho hiệu suất chiết cao hơn chiết siêu âm, đặc biệt với baicalin tăng 41%, chrysin tăng 6,9%. Thời gian chiết 30 phút được chọn làm tối ưu để tiết kiệm thời gian mà vẫn đảm bảo hiệu suất.

6. Thẩm định phương pháp: Phương pháp có tính chọn lọc cao, pic phân tích tách biệt rõ ràng với tạp chất. Độ lặp lại trong ngày và khác ngày có RSD ≤ 2%. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đạt mức thấp, phù hợp với yêu cầu phân tích dược liệu. Hiệu suất thu hồi đạt 98-102%, chứng tỏ độ đúng cao.

7. Phân tích mẫu thực tế: Hàm lượng baicalin, baicalein và chrysin trong các mẫu Hoàng bá nam thu tại các vùng khác nhau dao động trong khoảng 0,7-1,2%, 0,5-0,7% và 0,2-0,3% tương ứng, phản ánh sự khác biệt về điều kiện sinh thái và thu hái.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp HPLC-UV với hệ gradient acid formic - acetonitril là phù hợp để định lượng đồng thời ba flavonoid chính trong Hoàng bá nam. Việc lựa chọn ethanol 70% làm dung môi chiết và phương pháp chiết hồi lưu cách thủy 30 phút giúp tối ưu hiệu suất chiết, phù hợp với đặc tính hóa học của các flavonoid glycosid và aglycon.

So sánh với các nghiên cứu trước, hàm lượng flavonoid thu được tương đồng hoặc cao hơn, chứng tỏ phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao. Phương pháp cũng khắc phục được hạn chế của các chuyên luận dược điển hiện hành khi chưa có chỉ tiêu định lượng hoạt chất chính.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ sắc ký HPLC thể hiện sự tách biệt rõ ràng các pic baicalin, baicalein và chrysin, bảng số liệu đường chuẩn với hệ số tương quan cao, biểu đồ so sánh hàm lượng flavonoid giữa các mẫu dược liệu thu thập từ các vùng khác nhau.

Phương pháp này có thể áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Hoàng bá nam, góp phần nâng cao giá trị khoa học và thực tiễn trong ngành dược liệu Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng phương pháp HPLC-UV định lượng đồng thời baicalin, baicalein và chrysin trong kiểm soát chất lượng dược liệu Hoàng bá nam nhằm đảm bảo hàm lượng hoạt chất đạt chuẩn, nâng cao độ tin cậy trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng. Thời gian thực hiện: ngay sau khi hoàn thiện phương pháp.

2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng mới cho Hoàng bá nam trong dược điển Việt Nam bổ sung chỉ tiêu định lượng flavonoid chính, giúp các cơ quan quản lý và doanh nghiệp có căn cứ khoa học để đánh giá chất lượng dược liệu. Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế, Viện Dược liệu, thời gian 1-2 năm.

3. Khuyến khích các đơn vị sản xuất và kiểm nghiệm sử dụng dung môi ethanol 70% và phương pháp chiết hồi lưu cách thủy 30 phút để tối ưu hiệu quả chiết flavonoid, giảm chi phí và tăng độ chính xác phân tích. Thời gian áp dụng: ngay trong quy trình sản xuất.

4. Mở rộng nghiên cứu đánh giá hàm lượng flavonoid trong các mẫu Hoàng bá nam thu thập từ nhiều vùng sinh thái khác nhau để xây dựng bản đồ phân bố chất lượng dược liệu, hỗ trợ phát triển bền vững nguồn nguyên liệu. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu, trường đại học, thời gian 2-3 năm.

5. Đào tạo và nâng cao năng lực cho cán bộ kỹ thuật trong lĩnh vực phân tích dược liệu bằng HPLC-UV nhằm đảm bảo kỹ thuật phân tích được thực hiện chính xác, đồng bộ trên toàn quốc. Thời gian: liên tục, ưu tiên trong 1 năm đầu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích, Dược học, Dược liệu: Luận văn cung cấp phương pháp phân tích hiện đại, chi tiết về xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC-UV, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng thực hành.

2. Cơ quan quản lý chất lượng dược liệu và thuốc: Thông tin về hàm lượng flavonoid và phương pháp định lượng đồng thời giúp xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm, quản lý chất lượng dược liệu Hoàng bá nam hiệu quả hơn.

3. Doanh nghiệp sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng: Áp dụng phương pháp phân tích để kiểm soát nguyên liệu đầu vào, đảm bảo sản phẩm có chất lượng ổn định, nâng cao uy tín trên thị trường.

4. Các phòng kiểm nghiệm và trung tâm nghiên cứu dược liệu: Luận văn cung cấp quy trình xử lý mẫu, điều kiện sắc ký và thẩm định phương pháp chi tiết, giúp chuẩn hóa quy trình phân tích flavonoid trong dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp HPLC-UV có ưu điểm gì trong định lượng flavonoid so với các kỹ thuật khác?
   HPLC-UV cho phép tách và định lượng chính xác từng hợp chất trong hỗn hợp phức tạp, có độ nhạy cao, thiết bị phổ biến, chi phí thấp hơn so với HPLC-MS hoặc HPLC-DAD, phù hợp với các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm dược liệu.

2. Tại sao chọn ethanol 70% làm dung môi chiết flavonoid?
   Ethanol 70% có khả năng hòa tan tốt cả flavonoid glycosid (baicalin) và aglycon (baicalein, chrysin), an toàn, không độc hại, chi phí thấp và thân thiện môi trường, giúp chiết kiệt hoạt chất hiệu quả.

3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp đạt mức nào?
   Phương pháp đạt LOD và LOQ thấp, đủ để phát hiện và định lượng flavonoid trong mẫu dược liệu với độ chính xác cao, đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm chất lượng dược liệu.

4. Phương pháp chiết hồi lưu cách thủy có ưu điểm gì so với chiết siêu âm?
   Chiết hồi lưu cách thủy ở nhiệt độ sôi giúp tăng hiệu suất chiết flavonoid, đặc biệt với baicalin và chrysin, đồng thời đảm bảo chiết triệt để trong thời gian ngắn, phù hợp với quy trình phân tích định lượng.

5. Phương pháp này có thể áp dụng cho các dược liệu khác chứa flavonoid không?
   Có thể áp dụng với các dược liệu chứa flavonoid có cấu trúc tương tự, tuy nhiên cần tối ưu điều kiện sắc ký và xử lý mẫu phù hợp với từng loại dược liệu cụ thể để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả phân tích.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời ba flavonoid baicalein, baicalin và chrysin trong dược liệu Hoàng bá nam bằng HPLC-UV với bước sóng phát hiện 280 nm và hệ gradient acid formic - acetonitril.

• Phương pháp có độ chọn lọc, độ tuyến tính cao (R² ≥ 0,9997), giới hạn phát hiện và định lượng phù hợp, độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn quốc tế.

• Ethanol 70% và phương pháp chiết hồi lưu cách thủy 30 phút được xác định là điều kiện tối ưu cho xử lý mẫu, giúp chiết kiệt flavonoid hiệu quả.

• Phương pháp đã được áp dụng phân tích các mẫu Hoàng bá nam thu thập từ nhiều vùng sinh thái khác nhau, cho kết quả hàm lượng flavonoid ổn định và có sự khác biệt phù hợp với điều kiện tự nhiên.

• Đề xuất áp dụng phương pháp trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu, xây dựng tiêu chuẩn mới và mở rộng nghiên cứu đánh giá chất lượng dược liệu trên phạm vi rộng hơn.

Next steps: Triển khai áp dụng phương pháp tại các phòng kiểm nghiệm, hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Hoàng bá nam, đào tạo nhân lực kỹ thuật phân tích.

Các đơn vị nghiên cứu, kiểm nghiệm và sản xuất dược liệu nên phối hợp ứng dụng phương pháp này để nâng cao chất lượng sản phẩm và phát triển bền vững nguồn dược liệu quý của Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng và phong phú các dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Tuy nhiên, nhiều cây thuốc mới chỉ được sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu một cách toàn diện. Chính vì vậy, việc nghiên cứu các cây thuốc rất cần thiết, nhằm đảm bảo được hiệu quả phòng và điều trị bệnh hiện nay. Trong y học cổ truyền, Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli indici) là loại dược liệu được biết đến với rất nhiều lợi ích như: thanh can giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng, nhuận phế, dị ứng mẩn ngứa, viêm họng, ho khản tiếng, đau dạ dày, lỵ, viêm đường tiết niệu [3],[10]…Với nguồn nguyên liệu phong phú và có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người, nên Hoàng bá nam ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như: sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng.

Theo những nghiên cứu về thành phần hóa học của dược liệu Hoàng bá nam cho thấy flavonoid là thành phần có tác dụng chính. Một số hoạt chất flavonoid quan trọng có trong dược liệu này là: baicalein, baicalin, chrysin. Các hoạt chất này đã được chứng minh có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư, ức chế virus HIV-1, cải thiện chức năng thận,…[22],[13],[33]. Hoàng bá nam đã được qui định trong DĐVN V (2017).

Tuy nhiên, chuyên luận này mới chỉ đưa ra một số tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu là: mô tả, vi phẫu, soi bột, tạp chất mà chưa có chỉ tiêu định lượng hàm lượng hoạt chất chính bằng các phương pháp sắc ký hiện đại [1]. Do đó, việc áp dụng chuyên luận này trong đánh giá chất lượng dược liệu Hoàng bá nam còn nhiều hạn chế. Để góp phần nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Hoàng bá nam, đề tài: ―Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các flavonoid (dự kiến gồm baicalein, baicalin và chrysin) trong dược liệu Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) bằng phương pháp HPLC-UV‖ được đề xuất thực hiện với các mục tiêu chính: - Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các flavonoid trong dược liệu Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] - Áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng hàm lượng hoạt chất trong các mẫu Hoàng bá nam tại một số vùng khác nhau của Việt Nam. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.

TỔNG QUAN VỀ CÂY HOÀNG BÁ NAM Hoàng bá nam hay còn gọi là Vỏ Núc nác, Nam hoàng bá, có tên khoa học là Oroxylum indicum, họ Chùm ớt (Bignoniaceae). Vị thuốc là vỏ thân đã phơi hay sấy khô của cây Hoàng bá nam [3]. Cây Hoàng bá nam Dược liệu bộ phận vỏ Dược liệu bộ phận hạt Hình 1. Cây và dược liệu Hoàng bá nam 1.

Đặc điểm thực vật Cây nhỡ, cao 5-13 m. Thân nhẵn, ít phân cành, có những sẹo to do lá rụng để lại, vỏ cây màu xám tro, mặt trong màu vàng. Lá to, mọc đối, xẻ 2-3 lần lông chim, dài tới 1,5m tập trung ở ngọn thân, lá chét hình bầu dục, nguyên, dài 6,5-14 cm, rộng 3,5- 8 cm, gốc tròn, hơi lệch, đầu nhọn, mặt dưới nhẵn hoặc hơi có lông; cuống lá kép hình trụ, mập. Hoa màu nâu đỏ sẫm mọc thành chùm dài ở ngọn thân.

Đài hình ống, cứng, dày, có 5 khía nông. Tràng hình chuông, phình rộng, có 5 thùy hợp thành hai môi, 5 nhị, có chỉ nhị, có lông ở gốc. Đĩa mật có 5 thùy rõ, cao 4-5 mm, đường kính 12-14 mm. Quả thõng, dài 40-120 cm, rộng 5-10 cm, khi chín nứt làm hai mảnh, các mảnh vỏ hóa gỗ.

Hạt dài 4-9 cm, rộng 3-4 cm, kể cả cánh mỏng bao quanh, hạt rất nhiều, hình bầu dục cứng [3]. Phân bố và sinh thái của cây Hoàng bá nam Ở nước ta, cây mọc hoang ở rừng thường xanh, cây ưa mọc trên đất tơi xốp, có tầng đất mặt sâu và dễ thấm nước, có khi trong các quần hệ thứ sinh những vùng thấp ẩm ướt, tới độ cao 900 m. Cũng có nhiều nơi gây trồng. Trồng bằng hạt hoặc 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] bằng cành vào mùa xuân.

Hoa nở về đêm, thụ phấn nhờ dơi. Hoa và quả từng lúc quanh năm. Các quả chín vẫn ở trên cây khá lâu khi cây hết rụng lá. Chi Oroxylum Vent.

chỉ có một loài là Hoàng bá nam ở Việt Nam (Oroxylum indicum). Trên thế giới, Hoàng bá nam phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới châu Á, bao gồm Srilanca, Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Lào, Việt Nam, Thái Lan, Philippin, đảo Selip và Timor của Indonesia. Nguồn Hoàng bá nam ở Việt Nam tương đối dồi dào. Các tỉnh có trữ lượng lớn hiện nay là Hà Giang, Yên Bái, Tuyên Quang, Hòa Bình, Thanh Hóa,…Ở mỗi tỉnh ước tính có thể khai thác hàng trăm tấn nguyên liệu [3],[10].

Bộ phận dùng Vỏ thân (Cortex Oroxyli ) và hạt (Oroxyli Semen). Vỏ thân thu hái khi cần thiết, phơi khô hoặc cạo lớp vỏ bần rồi thái phiến dài 2-5 cm, dầy 1-3 mm phơi khô. Khi dùng để nguyên hoặc sao nhỏ lửa cho vàng. Hạt thu hái ở quả chín vào mùa thu đông, phơi khô [10].

Thành phần hóa học Các nghiên cứu đã được công bố ở trong và ngoài nước chỉ ra rằng thành phần hóa học của Hoàng bá nam gồm các nhóm chất: flavonoid, stilbenoid, triterpenoid, naphthalen, sterol Trong đó, thành phần hóa học có tác dụng chính là flavonoid [16]. Nhóm flavonoid Flavonoid (hoặc bioflavonoid) là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Flavonoid có màu vàng, xanh, tím đỏ và một số khác không có màu. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon có thể gây nhầm lẫn.

Flavonoid là nhóm hoạt chất chính có trong Hoàng bá nam. Các flavonoid có trong dược liệu này là chủ yếu là flavon. Ngoài ra còn có các flavonoid nhóm flavanon, flavanonol. 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Các nhóm flavonoid trong Hoàng bá nam Khung công thức Tài liệu Nhóm Chất cấu tạo tham khảo baicalein, chrysin; oroxylin A, apigenin, luteolin; [9] [18] chrysin 6-C-β-D-glucopyranosyl-8-O-β-D- [36] glucuronopyranosid; [5] [19] baicalein7-O-β-D-glucuronopyranosyl-(1→3)[ β-D- [51] glucopyranosyl-(1→6)]- β-D-glucopyranosid; scutellarein [45] [48] 7-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosid; chrysin-7-O-gentiobiosid; baicalein-7-O-diglucosid; flavon baicalein-7-O-glucosid; scutellarein-7-O-glucopyranosid; chrysin-7-O-glucuronid; baicalin; chrysin-6-C-β-D- glucopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranosid; baicalein-7-O- glucosid, baicalein-7-O-diglucosid (Oroxylin B); hispidulin; 8,8’’-bibaicalein; baicalein-7-O-caffeat; 6-hydroxyluteolin; 6-methoxyluteolin; 7-O-methyl chrysin, 5-hydroxy 4’,7- dimethoxy flavon; dihydro oroxylin A; baicalein-7-O- 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] gentiobiosid; baicalein-7-O-glucuronid; oroxylin A-7-O-β- D-glucuronid butyl ester; 6-methoxy-baicalein; oroxylin- A-7-O-glucosid; baicalein 6-methoxy-7-glucuronid; 2,5-dihydroxy-6,7-dimethoxy flavon; 3,7,3’,5’- tetramethoxy-4’-hydroxy flavon; 5,7-dihydroxy-3- methoxyflavon; 3,5,7-trihydroxyflavon; 5,7,4'-trihydroxy- 3-methoxyflavon; 3,5,7,4'-tetrahydroxy flavon; 5,7,4- trihydroxyflavon wogonin-7-O-β-D-glucuronide; 5,6,7-trimethoxyflavon-8- O-β-D-glucopyranosid; flavanon pinocembrin, pinobanksin, pinostrobin [18], [26] quercetin; quercetin-3-O-ara-binopyranoside; kaempferol; flavonol galangin; [54], [35] 3, 4, 5, 7-tetrahydroxy-flavonol 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Tính chất quang phổ của flavonoid Trên phổ UV của flavonoid chia ra 2 dải hấp thụ, dải I nằm trong vùng 290 nm trở lên, dải II nằm trong vùng 290 nm trở xuống. Trong dải I, flavon có đỉnh hấp thu cực đại trong vùng 310 – 350 nm, flavonol có 3-OH đã thế trong vùng 330 – 360 nm, flavonol có 3-OH tự do thì hấp thụ vùng 350 – 385 nm. Trong dải II, cả flavon, flavonol đều có đỉnh hấp thụ trong vùng 250 – 280 nm. Isoflavon do gốc phenyl đính ở C-3, không còn hiệu ứng liên hợp với nhóm carbonyl nên chỉ có dải hấp thụ chính ở 250 -270 nm [2].

Công thức cấu tạo của baicalin, baicalein, chrysin có trong Hoàng bá nam STT Tên chất CTCT Thông tin chất - CTPT: C15H10O5 - M (g/mol): 270,2369 - Nhiệt độ nóng chảy (0C): 264,5 1 Baicalein - λmax = 216, 277, 324 nm - Dung môi hòa tan: DMSO, aceton, ethanol, methanol - CTPT: C21H18O11 - M (g/mol): 446,364 - Nhiệt độ nóng chảy (0C): 202-205 2 Baicalin - λmax = 214, 278, 315 nm ± 2 nm - Dung môi hòa tan: methanol, ethanol 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] - CTPT: C15H10O4 - M (g/mol): 254,2375 ± 0,0139 - Nhiệt độ nóng chảy (0C): 285,5 3 Chrysin - λmax = 212, 269, 315 nm Dung môi hòa tan: Ethanol, chloroform, ether 1. Nhóm stilbenoid Ngoài nhóm hoạt chất chính là flavonoid, trong cây Hoàng bá nam còn chứa các Stilben. Chúng thuộc nhóm chất lớn phenylpropanoid, có chung một cấu trúc mạch cacbon là C6-C2-C6. Một số stilben đã được tìm thấy trong thực vật và khẳng định hoạt tính đặc trưng của chúng như resveratrol (3,5,4’-trihydroxy-stilben) là một chất được phát hiện có trong vỏ quả nho giúp giảm nguy cơ các bệnh về tim.

Bên cạnh đó, hoạt chất này có mặt trong dâu, đậu phộng và rượu vang đỏ. Các hợp chất stilben được chứng minh có tác dụng sinh học như: tác dụng chống oxy hóa, điều hòa cân nặng, chống dị ứng [40],…Một số stilben có trong cây Hoàng bá nam: (E)-dihydropinosylvin-2-carboxyl-5-O-β-D-glucopyranosid và (E)- dihydropinosylvin-3-O-β-D-glucopyranosid;(E)-pinosylvin-3-O-β-D-glucopyranosid; dihydropinosylvin; pinosylvin [23]. Pinosylvin Dihydropinosylvin (E)-pinosylvin-3-O-β-D- glucopyranoside 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] (E)-dihydropinosylvin-2-carboxyl-5-O- (E)-dihydropinosylvin-3-O-β-D- β-D-glucopyranosid glucopyranosid Hình 1. Công thức cấu tạo của Stilbenoid có trong Hoàng bá nam 1.

Các nhóm chất khác Triterpenoid: Lupeol, lup-20(29)-en-2alpha, 3-beta-diol, 2α-hydroxyllupeol[18] Lupeol 3-beta-diol Hình 1. Công thức cấu tạo của một số có trong triterpenoid Hoàng bá nam Các hợp chất naphthalen: 2-(1-hydroxymethylethyl)-4H, 9H-naphtho[2,3-b]furan- 4,9-dion; (3R,4R)-3,4-dihydro-4-hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)-1(2H)- naphthalenon; (3R,4R)-3,4-dihydro-4-hydroxy-3-(3-hydroxymethyl-(2Z)-butenyl)- 1(2H)-naphthalenon; (2S,3S,4R)-3,4-dihydro-3,4-dihydroxy-2-(3-methyl-2- butenyl)-1(2H)-naphthaleon; 2-acetyl-naphtho [2,3-b]-furan-4,9-dion [25]. Sterol bao gồm β-sitosterol và stigmasterol [42],[18] 1. Công dụng Theo y học dân gian, Hoàng bá nam được biết đến với rất nhiều lợi ích như: thanh can giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng, nhuận phế…Vị thuốc Hoàng bá nam hay vỏ thân Hoàng bá nam được chỉ định chữa các chứng bệnh vàng da, dị ứng mẩn ngứa, viêm họng, ho khản tiếng, đau dạ dày, lỵ, viêm đường tiết niệu[10].

9 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Tác dụng sinh học  Tác dụng chống viêm Tác dụng chống viêm giảm đau của cao chiết dược liệu Hoàng bá nam phân đoạn n-butanol cho hiệu quả đáng kể với hàm lượng 100 và 300 (mg/kg; p.  Tác dụng chống oxy hóa Đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên mô hình dọn gốc tự do của vỏ thân Hoàng bá nam ở các phân đoạn khác nhau là: ether dầu hỏa, ethyl acetate và n-butanol. Dựa trên các phản ứng: mất màu gốc ABTS+, dọn gốc tự do nitric oxid (·NO), phản ứng màu khử ion Fe3+ bằng tác nhân khử ortho-phenanthroline và ức chế sự hình thành lipid peroxid.

Kết quả cho thấy cao phân đoạn n-butanol cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh so với đối chứng dương là acid ascorbic [44]. Theo một nghiên cứu khác về mô hình dọn gốc tự do DPPH của vỏ thân Hoàng bá nam, cho thấy cao chiết phân đoạn ethyl acetat hoạt động chống oxy hóa mạnh nhất (giá trị IC50 là 0,76 mg/ml thấp nhất so với các cao chiết phân đoạn khác) [52].