Tổng hợp phức K, Ag, Cu, Fe với Quercetin: Nghiên cứu kháng khuẩn, kháng nấm

Tổng hợp phức chất K-Ag-Cu2-Fe3 và quercetin, hướng đến khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tiềm năng. Nghiên cứu mới về dược tính tự nhiên.

• Tác giả: Nguyễn Thị Huỳnh Phương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Sơn
• Trường học: Trường Đại Học Công Nghiệp Tp.HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Hữu Cơ
• Đề tài: Tổng Hợp Phức Của K+, Ag+, Cu2+, Fe3+ Với Quercetin Định Hướng Kháng Khuẩn Và Kháng Nấm
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI NÓI ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về Quercetin
• 1.2. Giới thiệu về Quercetin
• 1.3. Cơ chế phản ứng
• 1.4. Vai trò - ứng dụng của Quercetin
• 1.5. Khả năng tạo phức với ion kim loại
• 1.6. Tổng quan về các phương pháp phân tích
• 1.7. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS
• 1.8. Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại IR
• 1.9. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)
• 1.10. Phương pháp phân tích JOB
• 1.11. Khối phổ phân giải cao HRMS
• 1.12. Các phương pháp thử khả năng kháng khuẩn, kháng nấm
• 1.13. Phương pháp trộn thuốc vào môi trường thạch
• 1.14. Phương pháp đục lỗ trong môi trường thạch
• 1.15. Phương pháp thấm giấy
• 1.16. Phương pháp ống trụ của “Heatley”
• 1.17. Phương pháp thử những chất kháng khuẩn bay hơi
• 1.18. Một số loại vi khuẩn, vi nấm
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Dụng cụ, máy móc và thiết bị
• 2.2. Máy móc và thiết bị
• 2.3. Phương pháp thực nghiệm
• 2.4. Hướng nghiên cứu đồ án
• 2.5. Tổng hợp phức Quercetin với kim loại
• 2.6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Phổ và dữ liệu phổ
• 3.2. Phổ và dữ liệu phổ của Ag+
• 3.3. Phổ và dữ liệu phổ Cu2+
• 3.4. Phổ và dữ liệu phổ Fe3+
• 3.5. Phổ và dữ liệu phổ K+
• 3.6. Phổ tổng hợp FT-IR, XRD, UV-VIS
• 3.7. Kết quả phương pháp JOB
• 3.8. Phổ và dữ liệu phổ HRMS của Cu2+ - Quercetin
• 3.9. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
• 3.10. Kết quả kháng khuẩn
• 3.11. Kết quả kháng nấm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Phức Quercetin Khám Phá Khả Năng Vượt Trội

Quercetin, một flavonoid tự nhiên phong phú, đang thu hút sự chú ý lớn nhờ tiềm năng sinh học đa dạng. Flavonoid được coi là “chất bổ sinh học tự nhiên” và có khả năng hoạt động trực tiếp như thuốc kháng sinh. Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng phức hợp kim loại - flavonoid có các hoạt động sinh học và dược lý tốt. Phức Quercetin kết hợp với các ion kim loại như K+, Ag+, Cu2+ và Fe3+ đã chứng minh khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm ấn tượng, mở ra hướng đi mới trong y học. Các flavonoid đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng sinh học kim loại và giảm độc tính kim loại nặng. Việc kết hợp này có thể mô phỏng trung tâm xúc tác của hyperoxide dismutase trong tọa độ kim loại cấu trúc, do đó hiển thị hoạt động superoxide dismutase (SOD). Nghiên cứu về kim loại phức hợp flavonoid rất hữu ích trong việc phát triển các loại thuốc mới, dựa trên những phức hợp này và khám phá những cách thức mới trong việc sàng lọc, khám phá và phát triển các loại thuốc mới. Việc tạo phức với ion kim loại có thể tăng cường khả năng sinh học của nó, cũng như thúc đẩy hoạt động dược lý mới (ví dụ như hoạt động SOD). Dù các phương pháp truyền thống (ví dụ: quang phổ hấp thụ UV / Vis và IR, phổ Raman) đã được sử dụng để làm sáng tỏ cấu trúc của phức hợp flavonoid kim loại trong nhiều nghiên cứu, chúng chỉ có thể đưa ra bằng chứng gián tiếp về flavonoid - sự tạo phức kim loại chuyển tiếp.

1.1. Giới Thiệu Chi Tiết Về Hợp Chất Quercetin Tự Nhiên

Quercetin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxy flavone) là một trong những thực phẩm có hoạt tính sinh học và phổ biến nhất flavonoid. Nó có tác dụng chống oxy hoá mạnh, kháng nấm, kháng khuẩn và hỗ trợ chống lại các tế bào gốc tự do giúp làm giảm chứng viêm tuyến tiền liệt. Tuy nhiên, do khả năng hòa tan kém, Quercetin khó được hấp thụ vào cơ thể, nên dẫn đến không được sử dụng nhiều trong in vivo. Một số nhà nghiên cứu đã tuyên bố rằng Quercetin làm tăng tuổi thọ và cải thiện sức khỏe tim mạch. Các hoạt tính sinh học của Quercetin có được do tính chất chống oxi hóa của chúng, nhờ khả năng ức chế sàng lọc các gốc tự do và ảnh hưởng đến tình trạng oxi hóa khử trong tế bào. Các kết quả tương tự có thể đạt được trong quá trình phát triển các tác nhân chống tích tụ các tiểu huyết cầu, kháng virus, kháng viêm,… dựa trên nền tảng của Quercetin.

1.2. Cơ Chế Phản Ứng và Khả Năng Tạo Phức Của Quercetin

Hợp chất của Quercetin có thể tạo ra các càng chelate. Quá trình chelate hóa diễn ra khi trong môi trường có các ion kim loại tạo ra các hợp chất có vòng càng (càng cua) giữa các hợp chất hữu cơ dẫn xuất Quercetin với các ion kim loại. Theo một số nghiên cứu khoa học, dẫn xuất của Quercetin có khả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp. Phản ứng giữa Ni+ và dẫn xuất flavonoids là phản ứng giữa Acid Lewis (Ni2+) và Bazo Lewis. Các flavone có cấu trúc tương tự khác đã được báo cáo là có đặc tính chống ung thư. Để phát triển và tối ưu hóa bộ khung flavone thành một nhóm dược phẩm, hiểu rõ hơn về các mối quan hệ hoạt động cấu trúc (SAR) là rất quan trọng. Nhiều tác nhân chống ung thư thể hiện hành động của chúng bằng cách can thiệp vào yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) và thụ thể VEGF-2 (VEGFR2).

II. Vấn Đề Khả Năng Kháng Khuẩn Nấm Tự Nhiên Còn Hạn Chế

Mặc dù Quercetin tự nhiên có nhiều lợi ích sức khỏe, nhưng khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của nó còn hạn chế. Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm các phương pháp tăng cường hiệu quả này thông qua việc tổng hợp phức Quercetin với các ion kim loại. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tối ưu hóa quy trình tổng hợp phức nhằm đạt được hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất? Việc nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, đòi hỏi các giải pháp thay thế hiệu quả và an toàn hơn. Các nhà nghiên cứu nước ta đã đạt được nhiều thành tựu trong việc nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất chiết xuất từ thiên nhiên vào các lĩnh vực y học, thực phẩm. Tuy nhiên, chúng ta chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu một số những thành phần cũng như tính chất của các hợp chất thiên nhiên mà chưa đi sâu vào việc nghiên cứu các dẫn xuất của các hợp chất, trong khi các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu đáng kể và chuyên sâu.

2.1. Giới Hạn Của Quercetin Tự Nhiên Trong Ứng Dụng Thực Tiễn

Quercetin khó được hấp thụ vào cơ thể, nên dẫn đến không được sử dụng nhiều trong in vivo. Cần có thêm những nghiên cứu về những bệnh nhiễm virus khó điều trị như nhiễm HIV, … Nhiều tác nhân chống ung thư thể hiện hành động của chúng bằng cách can thiệp vào yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) và thụ thể VEGF-2 (VEGFR2). Các nghiên cứu gần đây khi cho dẫn xuất flavonoids tương tác ion Ca2+, Mg2+, Ni2+ và thực nghiệm đo phổ UV-VIS khi thêm ion kim loại M2+ vào các dẫn xuất này.

2.2. Tình Trạng Kháng Kháng Sinh và Nhu Cầu Giải Pháp Thay Thế

Vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng hơn. Chính vì vậy, các sản phẩm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người cũng được quan tâm nhiều, điển hình là các loại dược phẩm. Flavonoid là hợp chất phổ biến ở nhiều loài thực vật. Việc nghiên cứu này đã tạo nên nền tảng vững chắc để thực hiện những bước tổng hợp các dẫn xuất khác, làm tiền đề tiếp theo trong những nghiên cứu sâu hơn cho sau này.

III. Phương Pháp Tổng Hợp Phức Quercetin Hướng Dẫn Chi Tiết

Quy trình tổng hợp phức Quercetin với các ion kim loại (K+, Ag+, Cu2+, Fe3+) bao gồm nhiều bước, bắt đầu từ việc hòa tan Quercetin trong dung môi thích hợp (methanol), sau đó kết hợp với dung dịch muối kim loại tương ứng. Hỗn hợp được đun khuấy hồi lưu, đuổi dung môi, ly tâm, rửa và sấy khô để thu được sản phẩm cuối cùng. Các phương pháp phân tích như FT-IR, XRD và UV-VIS được sử dụng để xác định cấu trúc và tính chất của phức đã tổng hợp. Quan trọng là phải kiểm soát các điều kiện phản ứng như nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ Quercetin/ion kim loại để đảm bảo hiệu quả tổng hợp cao nhất.

3.1. Chi Tiết Quy Trình Tổng Hợp và Điều Kiện Phản Ứng Tối Ưu

Dung dịch Quercetin tan trong môi trường Methanol và phải đun khuấy hồi lưu. Cân 0.3022 g Quercetin pha trong 500 mL dung môi methanol.5H2O hòa tan muối trong nước cho vào bình cầu 250 mL có sẵn 100 mL dung dịch Quercetin trong dung môi metanol. Lắp đặt hệ thống đun khuấy hồi lưu trong 2 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn ở điều kiện nhiệt độ 65℃ và tốc độ khuấy 500 vòng/phút. Sau 2 giờ, mang dung dịch đun đuổi dung môi ở 65℃ còn lại khoảng 20 mL dung dịch. Ly tâm dung dịch, gạn bỏ phần lỏng, cho etanol vào rửa và tiếp tục ly tâm. Sau khi ly tâm sấy hỗn hợp thu được ở 60℃ cho đến khi khối lượng không đổi. Thu được phức Quercetin – Cu2+. Lặp lại quy trình trên thay CuSO4.5H2O bằng các chất sau: 0.0745 g KCl và 5 mL AgNO3. Quercetin với dung dịch muối có tỉ lệ 1:1 với ion kim loại và 1:2 với muối Sắt.

3.2. Phương Pháp Phân Tích Cấu Trúc FT IR XRD UV VIS

Các phân tử, nhóm phân tử của các chất, đơn chất hay hợp chất đều được cấu tạo từ các nguyên tử theo những kiểu liên kết hóa học nhất định của các điện tử hóa trị (các electron lớp ngoài cùng) của các nguyên tố. Trong phân tử các chất chỉ có 3 loại liên kết hóa học đó là liên kết xích ma (ϭ), liên kết π và liên kết phối trí [2]. Quang phổ hồng ngoại (gọi tắt là quang phổ IR) là quang phổ được thực hiện ở vùng hồng ngoại của phổ bức xạ điện từ, ánh sáng vùng này có bước sóng dài hơn và tần số thấp hơn so với vùng ánh sáng nhìn thấy. Dựa vào khả năng tạo phức màu với ion kim loại nặng trong nước, phương pháp đo quang UV-VIS được ứng dụng để xác đinh phức kim loại bền. Từ đây làm tiền đề cho việc xây dựng đường chuẩn để xác định nồng độ vi lượng của ion kim loại trong nước ứng dụng kiểm tra chất lượng nước sinh hoạt.

IV. Kết Quả Phân Tích Phổ và Hoạt Tính Kháng Khuẩn Kháng Nấm

Kết quả phân tích phổ FT-IR, XRD và UV-VIS đã xác nhận sự hình thành phức Quercetin với các ion kim loại. Phổ FT-IR cho thấy sự thay đổi trong tần số dao động của các nhóm chức, chứng tỏ có sự liên kết giữa Quercetin và ion kim loại. Phổ XRD cung cấp thông tin về cấu trúc tinh thể của phức. Phổ UV-VIS cho thấy sự thay đổi trong khả năng hấp thụ ánh sáng của Quercetin sau khi tạo phức. Quan trọng hơn, kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cho thấy sự gia tăng đáng kể so với Quercetin tự nhiên. Các dải hấp thụ của phổ hồng ngoại thường được sử dụng để xác định các cấu trúc vì các nhóm chức năng tạo ra các dải đặc trưng cả về cường độ và vị trí (tần số). Vị trí của các dải này được tóm tắt trong các bảng tương quan như dưới đây.

4.1. Phân Tích Chi Tiết Phổ FT IR XRD UV VIS Của Phức Quercetin

Phổ FT – IR cho ta kết quả xác định các nhóm chức trong Quercetin tạo phức với Ag+ nhờ sự thay đổi trong momen lưỡng cực của phân tử sẽ hấp thu năng lượng hồng ngoại ở những tần số nhất định, dẫn đến sự xuất hiện của các dải hấp thu. Qua dải phổ (Hình 3.) cho thấy các nhóm chức tham gia tạo cầu liên kết với ion Ag+ và tần số dao động của phức này xuất hiện các dải phổ ở các đỉnh như: 1604.72 cm-1 chứng minh nhóm C=O ester tại C4 trong hợp chất Quercetin tạo phức với Ag+. Từ giản đồ phổ XRD của Ag+ tạo phức với Quercetin (Hình 3.) cho ta thấy mẫu này có bốn đỉnh nhiễu xạ cường độ cao tại góc nhiễu xạ (2θ) là 38.4022o đặc trưng cho sự xuất hiện dẫn xuất của Quercetin – Ag+. Bước sóng hấp thu cực đại của phức Quercetin - Ag+ là ʎmax = 380 nm.

4.2. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn Kháng Nấm Của Các Phức

Các hợp chất sau phản ứng được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tại Phòng Công nghệ Sinh học Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Các loại vi nấm nấm và vi khuẩn thử nghiệm gồm Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, E. coli, Klebsiella pneumoniae và Candida albicans. Chọn phương pháp tiến hành là phương pháp thấm giấy (như mục 1. Ủ trong tủ ấm với vi khuẩn là 18 – 22 giờ, với chủng Candida albicans thì thời gian ủ như thời gian ủ nấm. Sau khi ủ, mang ra đọc kết quả bằng cách đo đường kính của vòng vô khuẩn (vùng không có vi khuẩn mọc lên).

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phức Quercetin Cơ Hội Phát Triển

Phức Quercetin có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Trong y học, nó có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc kháng khuẩn, kháng nấm mới, đặc biệt trong bối cảnh kháng kháng sinh gia tăng. Trong nông nghiệp, nó có thể được sử dụng làm chất bảo vệ thực vật tự nhiên, an toàn và hiệu quả. Ngoài ra, phức Quercetin còn có thể được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm, nhờ khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn tự nhiên. Thật may mắn, người ta đã báo cáo rằng Quercetin có thể tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp, chẳng hạn như K+, Ag+, Cu2+ và Fe3+. Các phức Quercetin - kim loại này thể hiện rộng rãi các hoạt tính sinh học và được sử dụng trong y học ngày càng tăng, chẳng hạn như kháng oxy hóa, kháng vi khuẩn, kháng nấm, chống khối u, và khả năng ảnh hưởng đến nhiều loại hoạt động của enzym [16-18].

5.1. Phức Quercetin Trong Y Học Thuốc Kháng Khuẩn Nấm Mới

Các kết quả tương tự có thể đạt được trong quá trình phát triển các tác nhân chống tích tụ các tiểu huyết cầu, kháng virus, kháng viêm,… dựa trên nền tảng của Quercetin. Quercetin cần phải kết hợp với ascorbic để trở thành tác nhân chống virus có hiệu quả [24]. Quercetin cũng làm tăng cường hoạt tính kháng virus của các chất kháng thể, các tác nhân gây chết mô tế bào bị u, do đó cần phải có thêm những nghiên cứu về những bệnh nhiễm virus khó điều trị như nhiễm HIV, …

5.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp Chất Bảo Vệ Thực Vật Tự Nhiên

Quercetin được nghiên cứu như là một chất bảo quản thịt trong tương lai. Chiếu xạ để diệt khuẩn là kỹ thuật phổ biến trong công nghệ chế biến thịt heo, tuy nhiên lại gây ảnh hưởng, làm oxi hóa chất béo và phát sinh ra mùi khó chịu từ thực phẩm. Khi sử dụng Quercetin làm chất oxi hóa, các loại thịt sống, nấu chính đều giữ được chất lượng, màu sắc và kéo dài thời gian tồn trữ [6]. Quercetin có tác dụng làm chậm quá trình ôi dầu, chống lại sự phá hủy do oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, protein, đường, …

VI. Kết Luận Phức Quercetin Mở Ra Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng

Tổng hợp phức Quercetin với các ion kim loại là một phương pháp hiệu quả để tăng cường khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của Quercetin. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các giải pháp tự nhiên, an toàn và hiệu quả để đối phó với tình trạng kháng kháng sinh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình tổng hợp phức, đánh giá độc tính và hiệu quả trên các mô hình in vivo, trước khi đưa vào ứng dụng thực tế.

6.1. Tổng Quan Về Thành Công và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu

Do đó, trong nghiên cứu này, các đặc tính chống ung thư của một nhóm các phân tử nhỏ, gồm Quercetin và các dẫn xuất của nó được tổng hợp và thiết kế hợp lý, được nghiên cứu để cho phép hiểu rõ hơn về mối quan hệ hoạt động cấu trúc của flavonoid như các tác nhân chống ung thư và các ứng dụng trong phân tích. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cho thấy sự gia tăng đáng kể so với Quercetin tự nhiên. Quercetin do không phát hiện độc tính đối với cơ thể người nên còn được sử dụng như một chất màu ổn định trong thực phẩm. Tạo phức với 𝛽-cyclodextrin được xem như là một cách tăng độ bền của Quercetin khi sử dụng làm chất màu.

6.2. Thách Thức và Triển Vọng Trong Tương Lai

Ảnh hưởng lên tính nhất quán trong cấu trúc của AND: trong điều kiện hiếu khí và có mặt ion kim loại Cu2+, Fe3+. Sự oxi hóa của Quercetin được hình thành trên H2O2 được xem là chất gây đứt và làm thay đổi AND. Quercetin tương tác với AND và trong điều kiện kéo dài có thể gây phá vỡ cấu trúc xoắn ốc kép. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá độc tính và hiệu quả trên các mô hình in vivo, trước khi đưa vào ứng dụng thực tế.