Luận án tiến sĩ phát triển nguồn vi khuẩn đất tìm kháng sinh chống MDR - Trịnh Ngọc Hoàng, ĐH Kyonggi

Luận án nghiên cứu phát triển nguồn vi khuẩn đất mới nhằm tìm kiếm các ứng viên kháng sinh chống mầm bệnh đa kháng thuốc và đánh giá hoạt tính sinh học.

• Tác giả: Trịnh Ngọc Hoàng
• Người hướng dẫn: GS. Jaisoo Kim
• Trường học: Đại học Kyonggi
• Chuyên ngành: Khoa học sự sống
• Đề tài: Development of novel soil bacterial resources for antibiotic candidates against MDR pathogens and study on bioactivity of the selected candidates
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát triển vi khuẩn đất tìm kháng sinh chống MDR

Kháng sinh là trụ cột của y học hiện đại. Phần lớn kháng sinh lâm sàng bắt nguồn từ vi sinh vật đất. Tuy nhiên, sự gia tăng của vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR) đang đe dọa sức khỏe toàn cầu. Các phương pháp phân lập cũ dần cạn kiệt nguồn hợp chất mới. Hiện tượng tái phát hiện các chất kháng sinh quen thuộc xảy ra thường xuyên. Tại Khoa Khoa học Đời sống thuộc Đại học Kyonggi, nghiên cứu sinh Trịnh Ngọc Hoàng đã bảo vệ thành công luận án tiến sĩ năm 2023 về khai thác tài nguyên vi khuẩn đất. Công trình tập trung giải quyết vấn đề khan hiếm hoạt chất kháng sinh mới. Đề tài xây dựng quy trình tiếp cận hệ vi sinh vật chưa nuôi cấy. Mục tiêu cốt lõi là thiết lập thư viện vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao chống lại danh mục mầm bệnh ưu tiên của WHO. Hệ thống màng lọc mô phỏng môi trường tự nhiên được ứng dụng triệt để. Hàng loạt chủng vi khuẩn quý hiếm được phân lập và định danh chính xác. Nghiên cứu mở ra hướng đi chiến lược trong việc khôi phục kho tàng thuốc kháng sinh tự nhiên từ lòng đất.

1.1. Khủng hoảng kháng kháng sinh toàn cầu và danh mục ưu tiên của WHO

Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp kháng thuốc kháng sinh vào nhóm nguy cơ y tế công cộng hàng đầu. Các vi khuẩn đa kháng thuốc như Acinetobacter baumannii hay Pseudomonas aeruginosa kháng carbapenem đang lan rộng. Tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng kháng thuốc tăng nhanh tại nhiều bệnh viện. Kháng sinh thế hệ cũ mất dần tác dụng điều trị. Quá trình phát triển dược chất mới từ công nghệ tổng hợp hóa học diễn ra chậm và chi phí đắt đỏ. Vi khuẩn đất tự nhiên vẫn là nguồn cung cấp dồi dào các phân tử có cấu trúc hóa học độc đáo. Việc tìm kiếm các chủng vi khuẩn đất mới sở hữu cơ chế kháng khuẩn chưa từng biết là giải pháp cấp bách nhằm đẩy lùi cuộc khủng hoảng y tế toàn cầu.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu tài nguyên sinh học tại Đại học Kyonggi

Nghiên cứu của Đại học Kyonggi hướng tới việc làm phong phú nguồn tài nguyên vi sinh vật hữu ích. Mục tiêu chính là phân lập các loài vi khuẩn đất mới có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chống mầm bệnh MDR. Nhóm nghiên cứu thiết lập quy trình phân lập cải tiến, vượt qua rào cản của kỹ thuật truyền thống. Hệ thống tạo lập một thư viện vi sinh vật hoạt tính có hồ sơ phân loại rõ ràng. Dự án kết hợp giải trình tự toàn bộ hệ gen và phân tích chuyển hóa thứ cấp. Điều này giúp phát hiện chính xác các hợp chất tự nhiên tiềm năng. Kết quả từ đề tài cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy cho nền y dược học.

II. Thách thức phân lập vi khuẩn đất và áp lực mầm bệnh MDR toàn cầu

Đất là môi trường chứa mật độ vi sinh vật khổng lồ trên Trái Đất. Tuy nhiên, hơn 99% vi khuẩn trong đất không thể nuôi cấy bằng các kỹ thuật đĩa thạch thông thường. Giới khoa học gọi hiện tượng này là "vật chất tối sinh học". Các vi sinh vật này đòi hỏi điều kiện dinh dưỡng vi mô và tín hiệu liên lạc phức tạp từ quần xã tự nhiên. Khi tách khỏi môi trường đất, chúng ngừng phát triển hoặc rơi vào trạng thái ngủ đông. Mặt khác, các phương pháp nuôi cấy tiêu chuẩn liên tục phân lập lại những loài quen thuộc như Streptomyces. Việc này dẫn đến sự trùng lặp hợp chất cũ, gây lãng phí thời gian và ngân sách nghiên cứu. Trong khi đó, áp lực từ các mầm bệnh kháng đa thuốc ngày càng khốc liệt. Các siêu vi khuẩn liên tục tiến hóa các enzym phân hủy kháng sinh và cơ chế bơm đẩy thuốc. Sự bất tương xứng giữa tốc độ biến dị của vi khuẩn gây bệnh và tốc độ phát hiện kháng sinh mới tạo ra lỗ hổng trị liệu nguy hiểm. Giới nghiên cứu cần phương pháp nuôi cấy đột phá để đánh thức các loài vi khuẩn tiềm năng.

2.1. Giới hạn nuôi cấy và hiện tượng tái phát hiện hợp chất cũ

Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch truyền thống tồn tại nhiều nhược điểm chí mạng. Môi trường nhân tạo quá giàu dinh dưỡng kìm hãm sự nảy mầm của các loài vi khuẩn đất phát triển chậm. Hầu hết các loài vi khuẩn đặc hữu không tiếp cận được các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên. Hệ quả là chỉ 1% số loài phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường chuẩn. Phần lớn các chủng phân lập được đều thuộc nhóm vi sinh vật đã biết. Hiện tượng tái phát hiện cùng một hợp chất kháng sinh xảy ra thường xuyên. Sự bế tắc này đòi hỏi phải thay đổi căn bản tư duy phân lập vi sinh vật.

2.2. Cơ chế kháng thuốc phức tạp của các mầm bệnh nguy hiểm

Các tác nhân gây bệnh đa kháng thuốc sở hữu cơ chế phòng vệ sinh học tinh vi. Vi khuẩn gram âm tạo ra lớp màng ngoài ngăn cản sự xâm nhập của phân tử kháng sinh. Chúng kích hoạt các hệ thống bơm đẩy chủ động để tống khứ dược chất ra khỏi tế bào. Ngoài ra, vi khuẩn đột biến enzym đích hoặc tiết ra beta-lactamase phá hủy vòng kháng sinh. Sự xuất hiện của các chủng toàn kháng làm suy giảm hiệu lực của các loại kháng sinh hàng đầu. Thách thức này đòi hỏi phải tìm kiếm các phân tử kháng sinh mới có khung cấu trúc hóa học khác biệt từ các chủng vi khuẩn đất chưa từng được khai thác.

III. Kỹ thuật màng nền đất phân lập vi khuẩn tìm kháng sinh tại Kyonggi

Để giải quyết rào cản nuôi cấy, luận án tại Đại học Kyonggi ứng dụng hệ thống màng nền đất (Soil Substrate Membrane System - SSMS) và kỹ thuật đĩa Transwell. Hệ thống SSMS cấu tạo gồm buồng nuôi cấy thủy tinh và bình chứa mẫu đất tự nhiên. Nắp bình đục nhiều lỗ nhỏ giúp dưỡng chất và tín hiệu sinh học khuếch tán tự do. Màng lọc màng polycarbonate kích thước lỗ 0,4 micromet ngăn chặn tế bào lạ xâm nhập nhưng cho phép hóa chất đi qua. Mẫu đất được bổ sung môi trường R2A broth tỷ lệ 1:1 làm nền dinh dưỡng tự nhiên. Nhờ mô phỏng sát thực tế đất bản địa, hệ thống kích thích các vi khuẩn khó nuôi cấy phát triển mạnh. Sau khi phân lập, các chủng vi khuẩn được kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp chấm đĩa (spotting test). Nhóm tác giả xây dựng thư viện vi khuẩn sinh chất kháng sinh và định danh sơ bộ bằng giải trình tự gen 16S rRNA. Toàn bộ hệ gen của các chủng tiềm năng được phân tích chi tiết. Kỹ thuật LC-MS/MS được dùng để dự đoán và tinh sạch phân tử hoạt tính sinh học.

3.1. Thiết kế và vận hành hệ thống màng nền đất mô phỏng tự nhiên

Hệ thống màng nền đất SSMS đại diện cho bước tiến kỹ thuật nuôi cấy in situ. Buồng nuôi cấy thủy tinh chứa dịch chiết đất kết hợp môi trường R2A. Màng bán thấm có đường kính lỗ siêu nhỏ ngăn cách môi trường với mẫu đất gốc. Lỗ màng cho phép các yếu tố vi lượng, chất chuyển hóa và tín hiệu cảm ứng mật độ khuếch tán thuận lợi. Toàn bộ thiết bị được khử trùng nghiêm ngặt bằng nồi hấp áp lực và tia UV trước khi vận hành. Kỹ thuật tạo ra môi trường tương tự tự nhiên, giúp các loài vi khuẩn đất vốn bất hoạt có thể phân chia tế bào và tạo khuẩn lạc rõ nét.

3.2. Sàng lọc hoạt tính và giải mã gen chuyển hóa thứ cấp chuyên sâu

Sau giai đoạn phân lập, các chủng vi khuẩn trải qua quy trình sàng lọc kháng khuẩn nghiêm ngặt. Phương pháp chấm đĩa đối kháng trực tiếp đánh giá năng lực ức chế mầm bệnh vi khuẩn đa kháng. Các chủng thể hiện vòng ức chế lớn được đưa vào thư viện bảo tồn lâu dài. Tiếp theo, công nghệ giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) giải mã cấu trúc phân tử của chủng mục tiêu. Các công cụ tin sinh học dự đoán cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (BGCs). Cuối cùng, sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) xác định đặc tính và hỗ trợ tinh sạch các phân tử kháng sinh tự nhiên có hoạt tính cao.

IV. Ứng dụng vi khuẩn đất mới trong phát triển kháng sinh chống MDR

Đề tài nghiên cứu tại Đại học Kyonggi đã đạt nhiều kết quả mang tính thực tiễn cao. Tác giả Trịnh Ngọc Hoàng đã phân lập và mô tả phân loại nhiều loài vi khuẩn đất hoàn toàn mới. Nổi bật trong số đó là các chủng thuộc chi Arthrobacter, Paraburkholderia và Chryseobacterium. Cụ thể, chủng Chryseobacterium viscerum HW314 chứng minh hoạt tính kháng sinh vượt bậc. Dịch chiết thô từ chủng này ức chế hiệu quả nhiều chủng vi khuẩn đa kháng thuốc trong danh mục ưu tiên của WHO. Phân tích gen và khối phổ phát hiện các phân tử chuyển hóa có cấu trúc hóa học độc đáo. Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả vượt trội của hệ thống màng nền đất trong việc tiếp cận nguồn gen vi sinh vật chưa khai phá. Thư viện chủng giống được thành lập đóng vai trò nguồn vật liệu khởi đầu cho quy trình sản xuất dược phẩm sinh học. Đây là đóng góp khoa học quan trọng cho nỗ lực toàn cầu nhằm kiểm soát cuộc khủng hoảng kháng kháng sinh. Kết quả nghiên cứu thúc đẩy các thử nghiệm tiền lâm sàng tiếp theo đối với các hoạt chất tự nhiên.

4.1. Định danh loài mới và tiềm năng hóa sinh từ chủng Chryseobacterium

Nghiên cứu định danh thành công loài vi khuẩn mới dựa trên cây phát sinh chủng loại gen 16S rRNA và đối chiếu toàn bộ hệ gen. Chủng Chryseobacterium viscerum HW314 trở thành tâm điểm nhờ khả năng tiết các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng sinh cao. Quy trình lên men và chiết xuất thu được dịch thô có hoạt tính ức chế vi khuẩn mạnh. Phân tích cấu trúc phân đoạn hoạt tính chỉ ra các hợp chất tiềm năng chống lại vi khuẩn kháng thuốc. Đây là minh chứng cụ thể cho việc biến nguồn tài nguyên vi khuẩn đất thành các ứng viên thuốc sinh học giá trị cao.

4.2. Định hướng ứng dụng dược phẩm và phát triển nguồn tài nguyên đất

Kết quả luận án mở ra hướng tiếp cận mới trong công nghiệp dược phẩm sinh học. Thư viện vi khuẩn đất hoạt tính cao tại Đại học Kyonggi cung cấp kho dự trữ sinh học bền vững cho nghiên cứu y sinh. Quy trình phân lập bằng màng nuôi cấy có thể chuẩn hóa và mở rộng sang nhiều vùng sinh thái đất khác nhau. Các hoạt chất phân lập được tạo tiền đề cho quá trình tổng hợp hóa dược và thử nghiệm lâm sàng. Việc chủ động khai thác các loài vi khuẩn mới giúp ngành y tế chuẩn bị tốt hơn trước sự xuất hiện của các siêu vi khuẩn kháng thuốc tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ với tiêu đề "Development of novel soil bacterial resources for antibiotic candidates against MDR pathogens and study on bioactivity of the selected candidates" (Phát triển nguồn tài nguyên vi khuẩn đất mới nhằm tìm kiếm các ứng viên kháng sinh chống mầm bệnh đa kháng thuốc và nghiên cứu hoạt tính sinh học của các ứng viên được chọn) do nghiên cứu sinh Trịnh Ngọc Hoàng (Trinh Ngoc Hoang) thực hiện tại Khoa Khoa học Sự sống (Department of Life Science), Trường Sau đại học thuộc Đại học Kyonggi (Kyonggi University), Hàn Quốc, hoàn thành và bảo vệ vào tháng 6 năm 2023 dưới sự hướng dẫn của Giáo sư Jaisoo Kim.

Tính cấp thiết của luận án bắt nguồn từ thực trạng gia tăng nhanh chóng của các chủng vi sinh vật gây bệnh đa kháng thuốc (Multidrug-resistant pathogens - MDR), đặc biệt là các mầm bệnh nhiễm trùng bệnh viện (nosocomial pathogens). Tình trạng lạm dụng và sử dụng sai kháng sinh làm suy giảm hiệu quả của các phác đồ điều trị lâm sàng, kéo dài thời gian nằm viện, gia tăng chi phí y tế và tỷ lệ tử vong. Nguy cơ này càng trở nên nghiêm trọng khi tiến trình nghiên cứu và phát triển (R&D) các loại kháng sinh mới bị chậm lại trong những năm gần đây. Năm 2017, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã ban hành danh mục 12 mầm bệnh vi khuẩn ưu tiên toàn cầu cần nghiên cứu phát triển kháng sinh mới khẩn cấp. Báo cáo năm 2023 của WHO ước tính đến năm 2050, số ca tử vong do vi khuẩn kháng kháng sinh gây ra sẽ vượt qua số ca tử vong do ung thư.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là: Môi trường đất là nguồn tài nguyên vi sinh vật phong phú và phức tạp, chứa đựng nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn chưa được khám phá. Tuy nhiên, phần lớn vi khuẩn trong đất thuộc nhóm chưa nuôi cấy được (uncultured bacteria) bằng các kỹ thuật đĩa thạch truyền thống. Các công cụ nuôi cấy mô phỏng môi trường tự nhiên trước đây (như đĩa transwell hay buồng phản ứng sinh học khuếch tán) vẫn tồn tại những hạn chế kỹ thuật nhất định về sự thiếu hụt dinh dưỡng, nguy cơ khô môi trường hoặc tiêu tốn quá nhiều mẫu và khó duy trì thông khí kéo dài. Do đó, việc cải tiến hệ thống nuôi cấy nhằm phân lập các loài vi khuẩn đất mới, đồng thời sàng lọc, mô tả phân loại và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa thứ cấp từ chúng là một yêu cầu cấp bách.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án bao gồm mục tiêu chung là tìm kiếm các vi khuẩn đất có khả năng sản sinh kháng sinh chống lại mầm bệnh đa kháng thuốc, định danh và mô tả phân loại học các loài mới có hoạt tính kháng khuẩn, và nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn từ chủng vi khuẩn đất được lựa chọn. Luận án cụ thể hóa thành 5 mục tiêu (đánh số theo văn bản):

1. Xây dựng một thư viện nhỏ các chủng vi khuẩn sản sinh chất kháng sinh chống lại mầm bệnh MDR (Building a small library of antibiotic producers against MDR pathogens).
2. Mô tả phân loại học các loài mới trong thư viện (Taxonomic description of novel species in the library).
3. Dự đoán các chất chuyển hóa thứ cấp bằng khai phá hệ gene và phương pháp tiếp cận dựa trên cấu trúc (Predict secondary metabolites by genome mining and structured based approach).
4. Chiết xuất và tinh sạch các phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn từ dịch lên men (Extract and purify antibacterial fractions from fermentation broth).
5. Đánh giá hoạt tính sinh học của các phân đoạn tinh sạch một phần bao gồm hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng viêm (Evaluate bioactivities of partially purified fractions - anti-bacterial, antioxidant, anti-inflammatory activity).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn phân lập từ đất; các mầm bệnh vi khuẩn và nấm chỉ thị gồm Bacillus subtilis KEMB 51201, Staphylococcus aureus KEMB 7301, Escherichia coli KEMB 212-234, Candida albicans KACC 30004, cùng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc như Pseudomonas aeruginosa KACC 10185, Acinetobacter baumannii, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis; chủng vi khuẩn nghiên cứu sâu Chryseobacterium viscerum HW314; các phân đoạn và hợp chất chiết xuất thứ cấp.
• Phạm vi không gian: Mẫu đất được thu thập tại nhiều khu vực địa lý thuộc Hàn Quốc (bao gồm Hagwanggyo-dong, Jowon-dong, Iui-dong, Pyeongchang, Songsan-myeon, khuôn viên Đại học Kyonggi) và khu vực Bắc Cực (Ausire Lovenbreen, Cambridge Bay - do Viện Nghiên cứu Vùng cực Hàn Quốc KOPRI cung cấp).
• Phạm vi thời gian: Mẫu đất được thu thập từ tháng 5 năm 2017 đến tháng 5 năm 2020; các nội dung phân lập, nuôi cấy, phân tích hóa phân loại, giải trình tự hệ gene và thử nghiệm hoạt tính sinh học được tiến hành xuyên suốt chương trình đào tạo tiến sĩ đến tháng 6 năm 2023.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong phần tổng quan, tác giả điểm lại các công trình nghiên cứu và cơ sở dữ liệu quan trọng liên quan đến tình hình kháng thuốc và các chiến lược phân lập vi sinh vật đất:

• Danh mục mầm bệnh ưu tiên toàn cầu của WHO (WHO News, 2017) với 12 mầm bệnh được phân loại theo mức độ ưu tiên: đặc biệt nguy cấp (Critical: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae kháng carbapenem), mức độ cao (High: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, Campylobacter spp., Salmonella, Neisseria gonorrhoeae), và mức độ trung bình (Medium: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Shigella spp.).
• Báo cáo của WHO (WHO report, 2023) về dự báo tử vong do vi khuẩn kháng thuốc vào năm 2050.
• Pidot và cộng sự (Pidot et al.): Xu hướng chuyển dịch trọng tâm lấy mẫu sang các hệ sinh thái đặc thù như đất rừng, môi trường biển, sa mạc, vùng cực Bắc Cực hoặc các nguồn vi khuẩn bị lãng quên nhằm tìm kiếm các hợp chất tự nhiên mới.
• Gavrish và cộng sự (Gavrish et al., 2008): Thiết bị bẫy vi sinh vật (microbial trap) và buồng khuếch tán (diffusion chamber) ứng dụng màng bán thấm cho phép dinh dưỡng và các phân tử tín hiệu khuếch tán từ môi trường tự nhiên vào buồng nuôi cấy để phục hồi vi khuẩn chưa nuôi cấy.
• Berdy và cộng sự (Berdy et al., 2017): Thiết bị chip phân lập (isolation chip - iChip) giúp nuôi cấy tại chỗ (in situ) các tế bào đơn lẻ trong màng bán thấm đặt vào môi trường sống tự nhiên; công nghệ này đã dẫn đến việc phát hiện kháng sinh teixobactin từ loài Eleftheria terrae thuộc một chi mới của lớp Betaproteobacteria.
• Svenning và cộng sự (Svenning et al., 2003) và Ferrari và cộng sự (Ferrari et al., 2005): Đề xuất nguyên lý hệ thống màng cơ chất đất (soil substrate membrane systems) giai đoạn 2003–2005 nhằm tạo điều kiện tương tự tự nhiên cho vi khuẩn đất phát triển.
• Pham và cộng sự (Pham et al., 2012): Kỹ thuật đĩa transwell cải tiến sử dụng insert màng bán thấm đặt trên lớp đất để phân lập vi khuẩn.
• Chaudhary và cộng sự (Chaudhary et al.): Thiết kế bể phản ứng sinh học khuếch tán (diffusion bioreactor) hai buồng đồng tâm với thể tích lớn để nuôi cấy vi khuẩn đất.
• Krieg và cộng sự (Krieg et al.), Tindall và cộng sự (Tindall et al., 2007, 2010): Quy trình chuẩn mực về phương pháp tiếp cận đa pha trong mô tả phân loại học vi khuẩn.

Về khoảng trống nghiên cứu cụ thể mà luận án lựa chọn giải quyết: Tác giả chỉ ra rằng phương pháp đĩa transwell có thể tích nhỏ, dễ bị khô cạn môi trường khi nuôi cấy kéo dài và hạn chế về lượng chất dinh dưỡng cung cấp; ngược lại, bể phản ứng sinh học khuếch tán (diffusion bioreactor) lại đòi hỏi lượng mẫu đất và môi trường nuôi cấy quá lớn (tiêu tốn 2500 mL môi trường và cần bổ sung 1000 mL hàng tuần), đồng thời việc cung cấp oxy trong thời gian dài gặp khó khăn. Luận án định vị nghiên cứu bằng cách kết hợp ưu điểm của hai kỹ thuật trên để thiết kế một hệ thống màng cơ chất đất (soil substrate membrane system) cải tiến, nhỏ gọn, cung cấp dinh dưỡng tự nhiên ổn định qua màng polycarbonate 0,4 µm, từ đó nâng cao hiệu quả phân lập các dòng vi khuẩn đất mới và chưa nuôi cấy nhằm xây dựng thư viện vi sinh vật có hoạt tính kháng lại các mầm bệnh đa kháng thuốc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên hai khung lý thuyết và phân tích chính:

1. Tiếp cận phân loại học đa pha (Polyphasic taxonomy): Kết hợp đồng thời ba nhóm dữ liệu gồm đặc tính kiểu hình (hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào qua kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, các phản ứng sinh lý và sinh hóa), đặc tính hóa phân loại (hồ sơ acid béo tế bào qua hệ thống MIDI Sherlock GC, quinone hô hấp qua HPLC pha đảo, lipid cực qua sắc ký bản mỏng hai chiều) và đặc tính kiểu gene (trình tự gen 16S rRNA, giải trình tự toàn bộ hệ gene WGS, giá trị tương đồng nucleotide trung bình ANI, giá trị lai DNA-DNA kỹ thuật số in silico dDDH, tỷ lệ G+C mol%).
2. Khung tiếp cận hóa học hợp chất tự nhiên và tin sinh học: Khai phá hệ gene (genome mining) dự đoán các cụm gene sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (BGCs) bằng antiSMASH và PRISM; kết hợp phương pháp tiếp cận dựa trên cấu trúc sử dụng khối phổ phân giải cao LC-MS/MS và mạng lưới phân tử GNPS; tinh sạch hợp chất bằng sắc ký cột và HPLC điều chế; xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR 1D và 2D).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và nguồn dữ liệu:

• Thu thập và xử lý mẫu đất: Mẫu đất sau khi thu thập được sấy khô ở nhiệt độ phòng, loại bỏ rác thực vật và sỏi đá qua rây 2 mm, tiến hành phân lập trong vòng 24–36 giờ hoặc bảo quản ngắn hạn trong tủ lạnh.
• Phương pháp nuôi cấy phân lập:
  • Phương pháp đĩa transwell: 3 g đất đặt trong đĩa polycarbonate, 3 mL môi trường dịch thể R2A bổ sung vào insert chứa màng bán thấm, thêm 100 µL dịch huyền phù đất vào insert, ủ lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần.
  • Hệ thống màng cơ chất đất cải tiến: Thiết bị gồm một bình lõi HDPE (kích thước 60 x 80 mm) chứa 100 g đất, nắp đục 30–40 lỗ (đường kính 2–3 mm), miệng bình bọc màng polycarbonate kích thước lỗ 0,4 µm (GE Healthcare Life Science). Bình lõi đặt trong cốc thủy tinh Duran 600 mL chứa 100 mL hỗn hợp dịch chiết đất và môi trường R2A broth (tỷ lệ 1:1 v/v). Cấy 100 µL dịch huyền phù đất vào cốc nuôi cấy, ủ lắc 120 rpm ở 28°C trong 2 tuần. Sau ủ, pha loãng chuỗi thập phân và cấy trang 100 µL lên thạch R2A agar.
• Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn: Thử nghiệm chấm điểm (spotting test) trực tiếp khuẩn lạc phân lập lên đĩa R2A đã trang dịch huyền phù vi sinh vật kiểm định có độ đục chuẩn 0,5 McFarland; ủ ở 37°C trong 24 giờ; đo đường kính vòng vô khuẩn (chọn các chủng có vòng ức chế > 15 mm hoặc có phổ kháng rộng).
• Định danh và phân tích phát sinh loài: Tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Cheng et al.; kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng Nanodrop 2000 (Thermo Scientific); khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi universal 27F và 1492R; giải trình tự tại Macrogen (Seoul, Hàn Quốc); tra cứu độ tương đồng trên EzBioCloud và NCBI BLAST; căn chỉnh chuỗi bằng phần mềm SILVA aligner; dựng cây phát sinh loài (Neighbor-joining, Maximum-likelihood, Maximum-parsimony) bằng phần mềm MEGA X với 1000 lần lặp bootstrap và mô hình Kimura 2-parameter; dựng cây phát sinh loài hệ gene bằng pipeline UBCG java trên hệ điều hành Linux Ubuntu.
• Phân tích hệ gene: Giải trình tự hệ gene trên thiết bị Illumina HiSeq 2500, lắp ráp de novo bằng phần mềm SPAdes (v3.0); tính toán chỉ số ANI trên EzBioCloud; tính dDDH trên máy chủ GGDC (công thức 2); chú giải chức năng gene bằng máy chủ RAST v2.0 (SEED Viewer); dự đoán các cụm gene sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp bằng antiSMASH v6.0 và PRISM.
• Khảo sát kiểu hình và hóa sinh: Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM LIBRA 120 (Carl Zeiss); nhuộm Gram cải tiến theo Hucker và thử nghiệm sợi nhớt KOH; thử nghiệm di động, sinh H2S và indole (thuốc thử Kovacs) trên môi trường SIM; thử nghiệm kỵ khí trong buồng BBL GasPak; thử nghiệm catalase (H2O2 3%) và oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine 1%); dải nhiệt độ nuôi cấy (5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 37, 40, 45°C); môi trường nuôi cấy so sánh: LB agar, Mueller-Hinton agar, thạch dinh dưỡng nồng độ muối thấp (NA), R2A agar, tryptic soy agar (TSA); dải pH (4,0–10,5 với bước nhảy 0,5 pH bằng các hệ đệm: phosphate citrate pH 4–5.5, Sorensen phosphate pH 6–8, Tris pH 8.5–9, carbonate pH 9.5); dải nồng độ NaCl (0–6,5% với bước nhảy 0,5%); đo mật độ quang học OD595 trên máy FilterMax F5; thử nghiệm thủy phân gelatin 1,6%, casein sữa tách béo, Tween 40, 60, 80; thử nghiệm DNase agar với dung dịch HCl 1M; định danh hoạt tính enzym và đồng hóa nguồn carbon bằng bộ kit thương mại API 20NE và API ZYM (bioMérieux).
• Phân tích hóa phân loại: Chiết xuất quinone từ 100 mg sinh khối khô lạnh theo phương pháp của Minnikin et al., phân tích HPLC pha đảo theo Hiraishi et al.; chiết xuất và phân tích lipid cực bằng sắc ký lớp mỏng hai chiều (TLC) theo Minnikin et al.; phân tích thành phần acid béo màng tế bào theo hệ thống Sherlock Microbial Identification System (MIDI), chạy trên hệ thống GC Agilent 6890N sử dụng phần mềm MIDI Sherlock 6.3 và cơ sở dữ liệu TSBA6.21.
• Nghiên cứu hoạt chất từ chủng Chryseobacterium viscerum HW314: Lên men thể tích nhỏ, chiết lỏng-lỏng bằng dung môi ethyl acetate (EtOAc); cô quay thu dịch chiết thô; phân đoạn bằng sắc ký cột silica gel, kiểm tra bản mỏng TLC gộp các phân đoạn có cùng Rf; tinh sạch phân đoạn hoạt tính bằng prep-HPLC; phân tích cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR (1H NMR, 13C NMR, 1H-1H COSY); phân tích khối phổ phân giải cao LC-MS/MS và lập mạng lưới phân tử GNPS; xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) so sánh với kháng sinh đối chứng Vancomycin và Norfloxacin; đo khả năng quét gốc tự do DPPH; đánh giá độc tính tế bào và hoạt tính kháng viêm trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Danh mục ưu tiên của WHO, tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu (Chapter 1)

Nội dung chương 1 tập trung phân tích bối cảnh y tế toàn cầu trước sự đe dọa của các mầm bệnh vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR) tại các cơ sở y tế. Tác giả trình bày danh mục 12 mầm bệnh vi khuẩn ưu tiên do WHO ban hành năm 2017 nhằm định hướng các nỗ lực nghiên cứu và phát triển kháng sinh mới. Báo cáo của WHO nhấn mạnh tính cấp thiết khi dự báo đến năm 2050, số ca tử vong do kháng thuốc sẽ vượt qua ung thư nếu không có các liệu pháp điều trị thay thế.

Chương này khẳng định vi khuẩn đất là nguồn tài nguyên tự nhiên đầy hứa hẹn để tìm kiếm các phân tử kháng sinh mới nhờ tính đa dạng sinh thái và sự hiện diện của các chủng vi khuẩn chưa từng được mô tả. Từ đó, tác giả xác định mục tiêu tổng quát và 5 mục tiêu cụ thể cấu thành toàn bộ nội dung nghiên cứu của luận án, tập trung vào việc tạo lập thư viện vi khuẩn, mô tả phân loại các loài mới, khai phá hệ gene, tinh sạch hoạt chất và đánh giá hoạt tính sinh học của các phân đoạn thu nhận được.

Chương 2: Chiến lược phân lập tăng cường phát hiện kháng sinh từ vi khuẩn đất nuôi cấy và chưa nuôi cấy (Chapter 2)

Chương 2 trình bày chi tiết các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân lập vi khuẩn đất (tính chất lý hóa, pH, độ ẩm, mùa vụ, độ sâu lấy mẫu) và tổng quan các kỹ thuật phân lập chuyên biệt: bẫy vi sinh vật và buồng khuếch tán (Gavrish et al., 2008), chip phân lập iChip (Berdy et al., 2017) với phát hiện teixobactin, phương pháp đĩa transwell (Pham et al., 2012), và bể phản ứng sinh học khuếch tán (Chaudhary et al.). Tác giả phân tích các hạn chế của từng phương pháp và đưa ra thiết kế cải tiến của hệ thống màng cơ chất đất (soil substrate membrane system) sử dụng bình lõi HDPE trong cốc Duran 600 mL.

Về kết quả thực nghiệm:

• Từ 1.734 chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu đất tại Hàn Quốc và vùng Bắc Cực, có 175 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với ít nhất một vi sinh vật kiểm định.
• Tuyển chọn được 90 chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh (đường kính vòng ức chế > 15 mm) hoặc có phổ ức chế rộng để xây dựng thư viện lưu trữ.

Chi vi khuẩn	Tỷ lệ trong thư viện (%)
Burkholderia	46%
Pseudomonas	22%
Paenibacillus	7%
Chryseobacterium	7%
Arthrobacter	3%
Chitinophaga	3%
Bacillus	3%
Streptomyces	3%
Các chi khác	6%

Phổ hoạt tính của các chủng trong thư viện đối với các vi sinh vật kiểm định:

• Hoạt tính chống Bacillus subtilis: 73% số chủng trong thư viện.
• Hoạt tính chống Staphylococcus aureus: 69% số chủng trong thư viện.
• Hoạt tính chống Escherichia coli: 61% số chủng trong thư viện.
• Hoạt tính chống nấm men Candida albicans: 40% số chủng trong thư viện.

Tác giả ghi nhận rằng việc tìm kiếm các chủng có hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram âm và nấm men khó khăn hơn so với vi khuẩn Gram dương do tính chất kháng thuốc tự nhiên của mầm bệnh Gram âm. Tỷ lệ loài mới có hoạt tính kháng khuẩn trong thư viện chiếm 6,7% (tương đương 0,35% tổng số chủng phân lập ban đầu). Chủng Chryseobacterium viscerum HW314 (phân lập tại Hagwanggyo-dong, Suwon) được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu sâu ở các chương tiếp theo do có phổ kháng khuẩn rộng và hoạt tính ổn định.

Chương 3: Định danh và mô tả phân loại học các loài mới có hoạt tính kháng khuẩn (Chapter 3)

Chương 3 áp dụng quy trình phân loại học đa pha để mô tả chi tiết các chủng vi khuẩn mới phát hiện trong thư viện, bao gồm 1 chi mới và 2 loài mới:

1. Chủng Suwonella silvatica JH1-16T (mã đăng ký GenBank MH021631):

• Đại diện cho một chi mới và loài mới (gen. nov., sp. nov.) thuộc họ Neisseriaceae, phân lập từ đất rừng tại Hagwanggyo-dong.
• Phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy độ tương đồng cao nhất với các loài vi khuẩn đã nuôi cấy gồm Vogesella oryzae L3B39T (93,2%), Vogesella amnigena Npb-02T (93,2%), và Crenobacter luteus YIM 78141T (92,9%).
• Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S rRNA (Maximum-likelihood) và cây phát sinh loài toàn hệ gene (UBCG) đều chỉ ra rằng JH1-16T tạo thành một nhánh riêng biệt, nằm gần với hai loài Crenobacter luteus YIM 78141T và Crenobacter cavernae K1W11S-77T.
• Phân tích hệ gene qua công cụ antiSMASH dự đoán sự hiện diện của các cụm gene sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp. Chủng có hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram dương.

2. Chủng Arthrobacter terricola JH1-1T (mã đăng ký GenBank MG210584):

• Loài mới thuộc chi Arthrobacter, họ Micrococcaceae, phân lập từ đất tại Hagwanggyo-dong.
• Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA cao nhất với Arthrobacter alkaliphilus LC6T (98,5%), Arthrobacter methylotrophus TGAT (98,4%), Arthrobacter ramosus CCM 1646T (97,8%), và Arthrobacter bambusae THG-GM18T (97,8%).
• Các chỉ số phân định loài: Giá trị ANI, lai dDDH và phân tích MLSA (recA, rplC) giữa JH1-1T và các loài gần nhất đều nằm dưới ngưỡng phân định loài mới (ANI < 95%, dDDH < 70%). Cây phát sinh loài hệ gene khẳng định JH1-1T tạo cụm phân loại riêng với A. alkaliphilus LC6T và A. methylotrophus TGAT. Chủng có hoạt tính ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm.

3. Chủng Paraburkholderia flava LD6T (mã đăng ký GenBank MH379802):

• Loài mới thuộc chi Paraburkholderia, họ Burkholderiaceae, phân lập tại Iui-dong.
• Hình thái tế bào được xác định qua ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM.
• Phân tích phát sinh loài hệ gene, chỉ số ANI và dDDH phân tách rõ rệt chủng LD6T với các loài đối chứng trong chi. Phân tích chức năng gene mã hóa protein qua SEED Viewer (RAST) và antiSMASH xác định tiềm năng chuyển hóa thứ cấp. Chủng thể hiện hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram dương.

Ngoài ra, thư viện còn ghi nhận các chủng mới khác gồm Chryseobacterium culicis KGU45 (ON738622), Chitinophaga nivalis sp. nov. PC14 (MT729823) và PC15 (MT729822). Toàn bộ các chủng ứng viên loài mới đã được gửi lưu giữ tại các ngân hàng giống vi sinh vật chuẩn quốc tế (KACC, JCM).

Chương 4: Nghiên cứu các hợp chất kháng sinh từ vi khuẩn đất Chryseobacterium viscerum HW314 (Chapter 4)

Chương 4 đi sâu nghiên cứu chủng Chryseobacterium viscerum HW314 (ON738617) phân lập tại Hagwanggyo-dong, Suwon:

• Đặc tính sinh học và hệ gene: Tác giả xác định đường cong sinh trưởng, dựng cây phát sinh loài 16S rRNA (Neighbor-joining) và cây phát sinh loài hệ gene bằng pipeline UBCG, thiết lập bản đồ hệ gene của chủng HW314.
• Khai phá hệ gene: Công cụ antiSMASH phiên bản 6.0 phát hiện các vùng cụm gene sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (BGCs) trong hệ gene; phần mềm PRISM dự đoán các cấu trúc sản phẩm tự nhiên được mã hóa di truyền.
• Phân tích cấu trúc dựa trên khối phổ: Phân tích LC-MS/MS kết nối với mạng lưới phân tử của thư viện GNPS đã nhận diện sự hiện diện của hợp chất kháng sinh Heronamide A trong các mẫu vi khuẩn thuộc chi Chryseobacterium.
• Lên men và chiết xuất: Tiến hành lên men dịch thể thể tích nhỏ và chiết lỏng-lỏng bằng dung môi ethyl acetate. Dịch chiết thô thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt trên các mầm bệnh thông thường và các chủng vi khuẩn lâm sàng đa kháng thuốc (MDR) gồm: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, và Staphylococcus epidermidis.
• Tinh sạch và xác định cấu trúc: Dịch chiết thô được phân tách qua sắc ký cột silica gel, gộp các phân đoạn có cùng giá trị Rf trên bản mỏng TLC, sau đó tinh sạch tiếp bằng HPLC điều chế (prep-HPLC), thu nhận được phân đoạn tinh sạch một phần F4. Cấu trúc hóa học của phân đoạn F4 được khảo sát sơ bộ bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR (1H NMR, 13C NMR, 1H-1H COSY).
• Đánh giá hoạt tính sinh học của phân đoạn F4:
  • Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Xác định trên các mầm bệnh chỉ thị và chủng MDR, cho thấy giá trị MIC đối với Staphylococcus aureus KEMB 7301, E. coli KEMB 212-234, và Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 nằm trong khoảng 1,0–4,0 µg/mL (đối chứng so sánh với Vancomycin và Norfloxacin).
  • Hoạt tính chống oxy hóa: Phân đoạn F4 thể hiện khả năng dập tắt gốc tự do qua thử nghiệm DPPH.
  • Độc tính tế bào và kháng viêm: Thử nghiệm trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7 xác nhận phân đoạn F4 có hoạt tính kháng viêm và không gây độc tế bào (non-cytotoxic).

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học:

• Mở rộng hiểu biết về tính đa dạng sinh học của vi khuẩn đất tại Hàn Quốc và vùng Bắc Cực trong mối tương quan với khả năng sản sinh hoạt chất kháng sinh chống mầm bệnh MDR.
• Đóng góp vào hệ thống phân loại học vi sinh vật quốc tế thông qua việc mô tả phân loại đa pha hoàn chỉnh cho 1 chi mới (Suwonella gen. nov., loài chuẩn Suwonella silvatica JH1-16T thuộc họ Neisseriaceae) và 2 loài mới (Arthrobacter terricola sp. nov. JH1-1T thuộc họ Micrococcaceae, Paraburkholderia flava sp. nov. LD6T thuộc họ Burkholderiaceae). Toàn bộ dữ liệu giải trình tự 16S rRNA và toàn hệ gene WGS đã được đăng ký trên cơ sở dữ liệu NCBI và gửi lưu giữ tại các bảo tàng giống chuẩn KACC và JCM.
• Chứng minh tính hiệu quả của phương pháp tiếp cận kết hợp giữa khai phá hệ gene (antiSMASH 6.0, PRISM) với kỹ thuật khối phổ phân giải cao (LC-MS/MS, mạng lưới phân tử GNPS) trong việc định hướng và nhận diện nhanh các chất chuyển hóa thứ cấp tự nhiên.

Các đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp kỹ thuật:

• Cải tiến thành công hệ thống màng cơ chất đất (soil substrate membrane system) quy mô phòng thí nghiệm, khắc phục được tình trạng bay hơi mất nước của đĩa transwell truyền thống và giảm thiểu lượng đất cũng như môi trường tiêu tốn so với buồng phản ứng khuếch tán thể tích lớn.
• Thiết lập thư viện gồm 90 chủng vi khuẩn đất có hoạt tính ức chế mầm bệnh phổ rộng hoặc có vòng ức chế lớn (> 15 mm), tạo nguồn lưu trữ tài nguyên sinh học phục vụ sàng lọc thuốc kháng sinh.
• Phân lập và tinh sạch một phần phân đoạn hoạt tính F4 từ chủng Chryseobacterium viscerum HW314, chứng minh phân đoạn này có hoạt tính ức chế mạnh trên các mầm bệnh lâm sàng MDR (A. baumannii, S. aureus, P. aeruginosa...), đồng thời sở hữu hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm và an toàn sinh học đối với dòng tế bào RAW264.7.

Kiến nghị và đề xuất của luận án:

• Ứng dụng rộng rãi mô hình màng cơ chất đất cải tiến để phân lập vi sinh vật từ các vùng sinh thái đặc thù khác.
• Mở rộng quy mô lên men và tinh sạch phân đoạn hoạt tính từ chủng Chryseobacterium viscerum HW314 để phục vụ các bước nghiên cứu sâu hơn về hóa dược.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Tỷ lệ phân lập được các loài mới và vi khuẩn chưa nuôi cấy có hoạt tính kháng sinh mạnh trong quá trình sàng lọc ban đầu còn thấp (loài mới có hoạt tính chỉ chiếm 6,7% trong thư viện và 0,35% trong tổng số phân lập); phần lớn các chủng có hoạt tính mạnh vẫn thuộc về các loài vi khuẩn đã biết.
• Các loài mới phân lập được từ đất, đặc biệt là nhóm khó nuôi cấy, thường thể hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu trong điều kiện thử nghiệm in vitro.
• Nghiên cứu hóa học các hợp chất từ chủng Chryseobacterium viscerum HW314 mới chỉ dừng lại ở phân đoạn tinh sạch một phần (phân đoạn F4) và khảo sát cấu trúc một phần qua phổ NMR 1D và 2D; chưa tách chiết được hợp chất tinh khiết đơn lẻ hoàn toàn để xác định cấu trúc hóa học lập thể tuyệt đối.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tiến hành tinh sạch triệt để phân đoạn F4 nhằm thu nhận hợp chất tinh khiết hoàn toàn.
• Xác định cấu trúc hóa học chi tiết, tính mới của phân tử và đánh giá tiềm năng phát triển phân tử này thành một loại thuốc kháng sinh mới trong điều trị lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo đối với các đối tượng và lĩnh vực chuyên môn sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên thuộc các chuyên ngành Vi sinh vật học, Hóa sinh học, Công nghệ sinh học và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Luận án cung cấp một tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình nghiên cứu khép kín từ khâu thu thập mẫu ngoài hiện trường, thiết kế công cụ phân lập mô phỏng sinh thái, sàng lọc hoạt tính sinh học, đến định danh phân loại học đa pha và phân tích hóa học cấu trúc.
• Các nhà phân loại học vi sinh vật: Nội dung chương 3 là quy trình chuẩn mực về phương pháp phân loại đa pha (polyphasic taxonomy), kết hợp giữa các đặc tính hình thái, sinh lý, hóa phân loại (lipid cực, quinone, hệ thống acid béo MIDI) và các chỉ số hệ gene học hiện đại (ANI, dDDH, UBCG phylogenetic pipeline).
• Các nhà nghiên cứu phát triển dược phẩm và tìm kiếm thuốc mới: Phần phương pháp luận tại chương 2 và chương 4 cung cấp hướng tiếp cận thực nghiệm trong việc ứng dụng công cụ tin sinh học khai phá hệ gene (antiSMASH, PRISM) kết hợp với mạng phân tử khối phổ GNPS và sắc ký điều chế để định hướng tinh sạch các chất chuyển hóa thứ cấp kháng mầm bệnh đa kháng thuốc (MDR).

Câu hỏi thường gặp

Câu 1: Thiết kế cải tiến của hệ thống màng cơ chất đất (soil substrate membrane system) trong luận án có cấu tạo và thông số kỹ thuật như thế nào? Hệ thống gồm một bình lõi bằng nhựa HDPE (kích thước 60 x 80 mm) chứa 100 g đất, nắp bình được đục từ 30 đến 40 lỗ (đường kính 2–3 mm), miệng bình bọc màng polycarbonate kích thước lỗ 0,4 µm (GE Healthcare Life Science). Bình lõi này được đặt lồng vào trong một cốc thủy tinh Duran 600 mL chứa 100 mL môi trường hỗn hợp gồm dịch chiết đất và R2A broth (tỷ lệ 1:1 v/v). Thiết kế này giải quyết tình trạng bay hơi làm khô môi trường của đĩa transwell nhỏ và khắc phục việc tiêu tốn quá nhiều mẫu đất và môi trường của bể phản ứng khuếch tán lớn.

Câu 2: Thư viện vi khuẩn có hoạt tính kháng sinh được xây dựng gồm bao nhiêu chủng và cấu trúc các chi chiếm ưu thế ra sao? Từ 1.734 chủng vi khuẩn phân lập ban đầu, qua sàng lọc có 175 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn; tác giả tuyển chọn 90 chủng có đường kính vòng vô khuẩn > 15 mm hoặc có phổ kháng khuẩn rộng để đưa vào thư viện. Thư viện gồm 11 chi, trong đó chiếm ưu thế nhất là chi Burkholderia (46%), tiếp theo là Pseudomonas (22%), Paenibacillus (7%), Chryseobacterium (7%), cùng Arthrobacter (3%), Chitinophaga (3%), Bacillus (3%), Streptomyces (3%), và các chi khác chiếm 6%.

Câu 3: Những đơn vị phân loại vi khuẩn mới nào đã được mô tả phân loại học đầy đủ trong luận án? Luận án đã thực hiện mô tả phân loại học đa pha hoàn chỉnh cho 1 chi mới và 2 loài mới:

1. Suwonella silvatica gen. nov., sp. nov. JH1-16T (MH021631): Chi mới và loài mới thuộc họ Neisseriaceae, phân lập từ đất rừng Hagwanggyo-dong.
2. Arthrobacter terricola sp. nov. JH1-1T (MG210584): Loài mới thuộc chi Arthrobacter, họ Micrococcaceae.
3. Paraburkholderia flava sp. nov. LD6T (MH379802): Loài mới thuộc chi Paraburkholderia, họ Burkholderiaceae, phân lập tại Iui-dong.

Câu 4: Phân đoạn tinh sạch một phần F4 từ chủng Chryseobacterium viscerum HW314 thể hiện những hoạt tính sinh học nào? Phân đoạn F4 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với các mầm bệnh vi khuẩn bao gồm các chủng đa kháng thuốc với giá trị MIC đạt từ 1,0 đến 4,0 µg/mL trên Staphylococcus aureus KEMB 7301, Escherichia coli KEMB 212-234, và Pseudomonas aeruginosa KACC 10185; đồng thời có hoạt tính chống oxy hóa dập tắt gốc tự do qua thử nghiệm DPPH; có hoạt tính kháng viêm và không gây độc tế bào trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7.

Câu 5: Công cụ tin sinh học và phân tích cấu trúc nào đã được tác giả kết hợp để nghiên cứu chất chuyển hóa ở chủng HW314? Tác giả đã sử dụng phần mềm antiSMASH phiên bản 6.0 và phần mềm PRISM để khai phá hệ gene toàn phần, dự đoán các cụm gene sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (BGCs); đồng thời sử dụng khối phổ phân giải cao LC-MS/MS đối chiếu với mạng lưới phân tử GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking) để nhận diện hợp chất Heronamide A; sau đó dùng sắc ký cột silica gel, prep-HPLC và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR (1H, 13C, COSY) để khảo sát cấu trúc phân đoạn hoạt tính.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Trịnh Ngọc Hoàng đã thiết lập thành công chiến lược phân lập cải tiến dựa trên hệ thống màng cơ chất đất, xây dựng thư viện gồm 90 chủng vi khuẩn đất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh từ 1.734 chủng phân lập tại Hàn Quốc và vùng Bắc Cực. Nghiên cứu đóng góp vào phân loại học vi sinh vật thông qua việc mô tả đa pha hoàn chỉnh một chi mới (Suwonella silvatica JH1-16T) và hai loài mới (Arthrobacter terricola JH1-1T, Paraburkholderia flava LD6T). Đồng thời, luận án đã làm sáng tỏ tiềm năng sinh học của chủng Chryseobacterium viscerum HW314, thu nhận phân đoạn tinh sạch F4 có hoạt tính ức chế mầm bệnh đa kháng thuốc (MDR), chống oxy hóa, kháng viêm và an toàn tế bào, đặt nền tảng dữ liệu khoa học cho các nghiên cứu phát triển kháng sinh tự nhiên tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Thesis for Degree of Doctor Development of novel soil bacterial resources for antibiotic candidates against MDR pathogens and study on bioactivity of the selected candidates by Trinh Ngoc Hoang Department of Life Science Graduate School Kyonggi University (2023) Development of novel soil bacterial resources for antibiotic candidates against MDR pathogens and study on bioactivity of the selected candidates A dissertation submitted to the faculty of Graduate School of Kyonggi University in the fulfillment of the requirement for the Degree of Doctor of Philosophy June 2023 Graduate School of Kyonggi University Department of Life Science Trinh Ngoc Hoang Approved the thesis of Trinh Ngoc Hoang as qualified for the Degree of Doctor of Philosophy Chairman Supervisory Committee Supervisory Committee Supervisory Committee Supervisory Committee June 2023 Graduate School of Kyonggi University Contents List of Tables v List of Figures vii Acknowledgement x Abstract xi Chapter 1.1 WHO global priority list of MDRs 1 1.2 The urgent of finding antibiotic candidates from soil 2 1. Objective of the study 3 Chapter 2. Isolation strategy to enhance antibiotic discovery from cultured and uncultured soil bacteria 4 2.1 Factors affect on isolation result 4 2.2 Methods for the isolation of novel species based on soil substrate membrane system 4 2.3 Preservation of bacteria and making library for antimicrobial compound-producing bacteria 11 2.2 Material and methods 12 2.2 The transwell plate method 13 2.3 Soil substrate membrane system 14 - i - 2.4 Screening for antimicrobial compound-producing bacteria by antibacterial spotting test 14 2.5 The initial identification of bacteria in library 15 2.3 Results and discussion 15 2.1 Making a small library of for antimicrobial compound-producing bacteria 15 2.2 The new species and antibacterial activity of novel strains in the library 21 2.3 Select bacteria as a candidate for antimicrobial compound-producer 22 2. Identification and taxonomic description of new species having antimicrobial activity 24 3.2 Material and method 27 3.1 Cultivation and long term storage bacteria strains 27 3.4 Morphological, physiological characteristics 28 3.5 Genome sequence analysis 29 3.3 Results and discussion 30 3.1 Cultivation, long term storage and accession number of bacteria strains 30 3.2 Phylogenetic analysis 31 - ii - 3.3 Morphological, physiological characteristics 36 3.4 Genome sequence analysis 41 3.6 Description of novel bacterial taxa 54 3.

Study on antibiotic compounds from soil bacterium Chryseobacterium viscerum HW314 59 4.2 Material and methods 61 4.1 Multidrug resistant pathogens used in this study 61 4.2 Biological characteristic of C.3 Fermentation and extraction 63 4.4 Antibiotic activity of crude extract 64 4.5 Prediction of secondary metabolism based on genome sequence 64 4.6 Prediction of secondary metabolism based on LC-MS/MS 65 4.7 Partial purification of active compound 65 4.8 Structural investigation of fraction 66 4.9 Minimum inhibitory concentration 66 4.10 Anti-oxidant activity 67 4.11 Cell toxicity and anti-inflammatory activity 68 4.3 Results and discussion 69 4.1 Biological characteristic of Chryseobacterium viscerum HW314 69 - iii - 4.2 Prediction of secondary metabolism based on genome sequence 73 4.3 Prediction of secondary metabolism based on LC-MS/MS 75 4.4 Antibiotic activity of cruded extract 78 4.5 Partial purification of active compound 80 4.6 Structural investigation of compound 81 4.7 Minimum inhibitory concentration 84 4.8 Anti-oxidant activity 84 4.9 Cell toxicity and anti-inflammatory activity 85 4.4 Conclusions 86 General conclusion 88 References 90 Appendix 99 Abstract in Korean(국문요지) 102 - iv - List of Tables Table 1-1. WHO priority pathogens list for R&D of new antibiotics 2 Table 2-1. The location and geographical address of collected soil samples. List of identified bacterial isolates from soil having potential antimicrobial activity 16 Table 2-3.

Antibacterial activity of novel strains against pathogens 22 Table 3-1. The deposition number of new species candidates 31 Table 3-2. The accession number of new species candidates 31 Table 3-3. Differentiating characteristics of strain JH1-16 and the T closely related taxa 37 Table 3-4.

Differentiating characteristics of strain JH1-1 and the T closely related taxa 39 Table 3-5. Differentiating characteristics of strain LD6 and the closely T related taxa 40 Table 3-6. General genome features of Suwonella silvatica JH1-16 andT close species 42 Table 3-7. The Prediction Informatics for Secondary Metabolomes of T strain JH1-16 based on antiSMASH 43 Table 3-8.