Luận văn thạc sĩ xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp pcr đa mồi

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Đào Thanh Quyên
• Người hướng dẫn: TS. Ngô Tất Trung
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Xây Dựng Quy Trình Phát Hiện Một Số Vi Khuẩn Thuộc Họ Enterobacteriaceae Gây Bệnh Ở Người Bằng Phương Pháp PCR Đa Mồi
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người
• 1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới
• 1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt Nam
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
• 2.4. Các hoá chất, sinh phẩm
• 2.5. Các máy và thiết bị chính
• 2.6. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồi
• 2.7. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu
• 2.8. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm
• 2.9. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ
• 2.10. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi. Giải trình tự gen
• 2.11. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi
• 2.12. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN
• 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh
• 3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻ
• 3.1.3. Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh
• 3.1.4. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae
• 3.1.5. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella
• 3.1.6. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K.
• 3.1.7. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis
• 3.1.8. Kết quả xác định trình tự gen S-uidA của vi khuẩn E.
• 3.1.9. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae
• 3.1.10. Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnh
• 3.1.11. Đánh giá hiệu quả và tính ứng dụng của phương pháp trên panel chuẩn dương
• 3.1.12. Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dương
• 3.2. THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƯỜI KẾT HỢP ‘LÀM GIÀU’ ADN VI KHUẨN
• 3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN cũng như khả năng loại bỏ ADN người bằng các dung môi khác nhau
• 3.2.2. Kết quả so sánh nồng độ ADN tách chiết bằng phương pháp thông thường so với phương pháp phá bạch cầu làm giàu ADN vi khuẩn
• 3.2.3. Kết quả realtime PCR định lượng nồng độ ADN so sánh các phương pháp tách chiết
• 3.2.4. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp tách ADN không qua xử lý
• 3.2.5. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp sử dụng kit thương mại MolYsis
• 3.2.6. Kiểm chứng hàm lượng ADN vi khuẩn thu nhận sau khi xử lý bằng dung môi phá bạch cầu
• 3.3. KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về phát hiện vi khuẩn Enterobacteriaceae bằng PCR đa mồi

Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là một trong những tác nhân chính gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng ở người, đặc biệt là nhiễm khuẩn huyết. Việc phát hiện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn này là rất quan trọng trong việc điều trị và quản lý bệnh. Kỹ thuật PCR đa mồi đã được phát triển để nâng cao khả năng phát hiện các vi khuẩn này trong mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này không chỉ giúp xác định nhanh chóng mà còn có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Enterobacteriaceae

Vi khuẩn Enterobacteriaceae bao gồm nhiều loài như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, và Salmonella. Những vi khuẩn này thường gây ra các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng, đặc biệt là ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu. Đặc điểm sinh học và khả năng kháng thuốc của chúng là những yếu tố quan trọng cần được nghiên cứu.

1.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện vi khuẩn

Việc phát hiện sớm các vi khuẩn gây bệnh giúp bác sĩ có thể chỉ định kháng sinh phù hợp, từ đó giảm thiểu nguy cơ tử vong. Kỹ thuật PCR cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác, giúp cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân.

II. Thách thức trong phát hiện vi khuẩn Enterobacteriaceae

Mặc dù kỹ thuật PCR đa mồi mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn Enterobacteriaceae. Các vấn đề như sự hiện diện của ADN người trong mẫu bệnh phẩm có thể gây cản trở cho phản ứng PCR, dẫn đến kết quả dương tính giả. Ngoài ra, việc thiết kế mồi PCR cũng cần phải được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

2.1. Vấn đề về ADN người trong mẫu bệnh phẩm

Sự hiện diện của ADN người trong mẫu bệnh phẩm có thể gây cản trở cho phản ứng PCR, làm giảm độ nhạy của phương pháp. Việc loại bỏ ADN người trước khi thực hiện PCR là cần thiết để nâng cao hiệu quả phát hiện vi khuẩn.

2.2. Thiết kế mồi PCR hiệu quả

Thiết kế mồi PCR là một yếu tố quan trọng quyết định đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. Cần phải lựa chọn các đoạn gen đặc trưng cho từng loài vi khuẩn để tránh hiện tượng bắt chéo giữa các mồi.

III. Phương pháp PCR đa mồi trong phát hiện vi khuẩn

Kỹ thuật PCR đa mồi cho phép phát hiện đồng thời nhiều loài vi khuẩn trong một phản ứng duy nhất. Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Quy trình thực hiện PCR đa mồi

Quy trình thực hiện PCR đa mồi bao gồm các bước tách chiết ADN, thiết kế mồi, và thực hiện phản ứng PCR. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

3.2. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR đa mồi

Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp là rất quan trọng để xác định khả năng phát hiện vi khuẩn. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng PCR đa mồi có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp truyền thống.

IV. Ứng dụng thực tiễn của PCR đa mồi trong y học

Kỹ thuật PCR đa mồi đã được áp dụng rộng rãi trong các bệnh viện để phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây bệnh. Việc sử dụng phương pháp này không chỉ giúp cải thiện kết quả điều trị mà còn giảm thiểu thời gian nằm viện cho bệnh nhân. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tính hiệu quả của phương pháp này trong việc phát hiện các vi khuẩn Enterobacteriaceae.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng PCR đa mồi

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng PCR đa mồi trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh đã mang lại kết quả khả quan. Phương pháp này giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

4.2. Tính khả thi của PCR đa mồi trong thực hành lâm sàng

Việc áp dụng PCR đa mồi trong thực hành lâm sàng đã cho thấy tính khả thi cao. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn có thể được áp dụng rộng rãi trong các bệnh viện.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của PCR đa mồi

Kỹ thuật PCR đa mồi đã chứng minh được giá trị của mình trong việc phát hiện các vi khuẩn Enterobacteriaceae gây bệnh. Tương lai, việc phát triển và tối ưu hóa phương pháp này sẽ tiếp tục được nghiên cứu để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu, từ đó cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

5.1. Triển vọng phát triển kỹ thuật PCR đa mồi

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, kỹ thuật PCR đa mồi có thể được cải tiến hơn nữa để nâng cao khả năng phát hiện. Các nghiên cứu mới sẽ giúp tối ưu hóa quy trình và thiết kế mồi hiệu quả hơn.

5.2. Tương lai của phát hiện vi khuẩn trong y học

Tương lai của việc phát hiện vi khuẩn trong y học sẽ phụ thuộc vào sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử. PCR đa mồi sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh nhiễm trùng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một bệnh lý nghiêm trọng với tỷ lệ mắc và tử vong cao trên toàn cầu. Theo ước tính, tại Mỹ, số ca NKH đã tăng từ 164.000 ca/năm vào thập niên 1970 lên khoảng 750.000 ca/năm trong 15 năm gần đây, với tỷ lệ tử vong chiếm khoảng 2% số bệnh nhân nhập viện và 75% các trường hợp nằm khoa hồi sức tích cực. Tác nhân chủ yếu gây NKH là vi khuẩn, trong đó họ Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp và Proteus mirabilis chiếm tỷ lệ cao. Tại Việt Nam, các nghiên cứu cũng cho thấy nhóm vi khuẩn này là nguyên nhân hàng đầu gây NKH, với tỷ lệ cấy máu dương tính khoảng 11,7% tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108.

Việc xác định nhanh và chính xác tác nhân gây bệnh là yếu tố then chốt để lựa chọn kháng sinh phù hợp, giảm thiểu nguy cơ tử vong và biến chứng. Tuy nhiên, phương pháp cấy khuẩn truyền thống mất nhiều thời gian (18-72 giờ), không tối ưu cho vi khuẩn yếm khí và đòi hỏi lượng máu lớn, gây khó khăn cho bệnh nhân đặc biệt là trẻ sơ sinh và người cao tuổi. Kỹ thuật PCR đa mồi được xem là giải pháp tiềm năng giúp phát hiện đồng thời nhiều vi khuẩn trong thời gian ngắn, tăng độ nhạy và đặc hiệu. Luận văn này nhằm xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi, đồng thời thiết lập công nghệ loại bỏ ADN người để làm giàu ADN vi khuẩn, nâng cao hiệu quả chẩn đoán tại Bệnh viện 108 trong năm 2014.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết PCR (Polymerase Chain Reaction): Kỹ thuật khuếch đại ADN đặc hiệu, gồm ba bước chính: biến tính, lai và kéo dài, cho phép nhân bản đoạn gen mục tiêu lên đến hàng triệu lần trong thời gian ngắn.
• PCR đa mồi: Phát triển từ PCR đơn mồi, sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng để phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn, tiết kiệm thời gian và chi phí.
• Khái niệm ADN người và ADN vi khuẩn: Màng tế bào người và vi khuẩn khác biệt về thành phần cấu tạo, cho phép thiết kế dung môi phá vỡ tế bào người mà không ảnh hưởng đến vi khuẩn, từ đó loại bỏ ADN người và làm giàu ADN vi khuẩn.
• Khái niệm độ nhạy và độ đặc hiệu: Đánh giá hiệu quả kỹ thuật PCR đa mồi trong phát hiện vi khuẩn, đảm bảo phát hiện chính xác và hạn chế dương tính giả.
• Khái niệm gen đích đặc hiệu: Sử dụng các gen đặc trưng như 16S rRNA cho họ Enterobacteriaceae, gen uidA cho E. coli, gen aldA cho K. pneumoniae, gen flagellin cho Salmonella sp, gen UreR cho Proteus mirabilis để thiết kế mồi PCR.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng vi khuẩn chuẩn và mẫu bệnh phẩm máu nghi ngờ NKH thu thập tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 trong năm 2014.
• Cỡ mẫu: 74 mẫu ADN vi khuẩn chuẩn và 952 mẫu máu bệnh nhân nghi ngờ NKH.
• Phương pháp chọn mẫu: Lựa chọn mẫu đại diện các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và các mẫu bệnh phẩm lâm sàng có kết quả cấy máu song song.
• Quy trình tách chiết ADN: Áp dụng phương pháp phá bạch cầu bằng dung môi MCLB1 để loại bỏ ADN người, làm giàu ADN vi khuẩn, sau đó tách chiết ADN theo quy trình chuẩn hoặc sử dụng kit thương mại.
• Thiết kế mồi PCR: Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn và một cặp mồi phát hiện họ Enterobacteriaceae, đảm bảo không bắt chéo với ADN người và các vi khuẩn khác.
• Phân tích PCR và PCR đa mồi: Tối ưu hóa các tham số phản ứng như nồng độ MgCl2, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ enzyme, kiểm tra sản phẩm bằng điện di gel agarose 2%.
• Giải trình tự gen: Xác nhận sản phẩm PCR bằng giải trình tự gen và so sánh với cơ sở dữ liệu gen quốc tế.
• Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu: Thực hiện trên các mẫu pha loãng từ 10^4 đến 10^0 CFU/ml và các mẫu chứng âm gồm ADN người, vi khuẩn không thuộc họ Enterobacteriaceae, virus và nấm.
• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm Vector NTI và Microsoft Excel để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ nhạy và độ đặc hiệu theo công thức thống kê chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Chất lượng ADN tách chiết: 100% mẫu ADN vi khuẩn đạt tiêu chuẩn về độ tinh sạch (tỉ số OD260/280 trung bình 1,82 ± 0,093) và nồng độ (trung bình 89,18 ± 30,05 ng/µl), đảm bảo cho các thí nghiệm PCR tiếp theo.

2. Hiệu quả PCR đơn mồi: Các cặp mồi đơn đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn cho kết quả băng điện di rõ nét, đúng kích thước lý thuyết (E. coli 773 bp, Proteus mirabilis 406 bp, K. pneumoniae 324 bp, Salmonella sp 254 bp), nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 56°C, nồng độ Mg2+ 3 mM.

3. Độ nhạy PCR đa mồi: Phát hiện được vi khuẩn ở nồng độ thấp nhất khoảng 10^2 CFU/ml trong mẫu máu, tương đương hoặc vượt trội so với ngưỡng phát hiện của phương pháp cấy khuẩn truyền thống.

4. Độ đặc hiệu PCR đa mồi: Không phát hiện dương tính giả trên các mẫu chứng âm gồm ADN người, vi khuẩn không thuộc họ Enterobacteriaceae, virus viêm gan B, HSV, EBV và nấm, cho thấy tính đặc hiệu cao.

5. Hiệu quả loại bỏ ADN người: Phương pháp sử dụng dung môi MCLB1 loại bỏ hiệu quả ADN người, giảm nồng độ gen beta-globin còn dưới ngưỡng phát hiện, đồng thời làm giàu ADN vi khuẩn, tăng độ nhạy của PCR đa mồi.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình PCR đa mồi được xây dựng có độ nhạy và đặc hiệu cao trong phát hiện đồng thời các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây NKH. Việc thiết kế mồi dựa trên các gen đặc hiệu và vùng gen bảo tồn như 16S rRNA giúp phát hiện chính xác họ vi khuẩn, đồng thời tránh hiện tượng bắt chéo với ADN người nhờ công nghệ loại bỏ ADN người bằng dung môi MCLB1.

So với phương pháp cấy khuẩn truyền thống mất từ 18-72 giờ, PCR đa mồi rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn vài giờ, giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp kịp thời, giảm tỷ lệ tử vong và biến chứng. Kết quả giải trình tự gen khẳng định độ chính xác của sản phẩm PCR với độ tương đồng từ 94% đến 99% so với trình tự gen công bố trên ngân hàng gen quốc tế.

Phương pháp loại bỏ ADN người tự chế tạo dung môi MCLB1 có hiệu quả tương đương kit thương mại MolYsis nhưng chi phí thấp hơn nhiều, phù hợp với điều kiện các nước thu nhập thấp như Việt Nam. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh nồng độ ADN vi khuẩn và ADN người trước và sau xử lý, bảng kết quả độ nhạy và độ đặc hiệu PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn và lâm sàng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng quy trình PCR đa mồi tại các bệnh viện lớn: Nâng cao năng lực chẩn đoán nhanh các vi khuẩn họ Enterobacteriaceae gây NKH, giảm thời gian chẩn đoán từ 2-3 ngày xuống còn vài giờ, giúp cải thiện hiệu quả điều trị. Thời gian thực hiện: 1-2 năm; chủ thể: các bệnh viện tuyến trung ương.

2. Phát triển và phổ biến công nghệ loại bỏ ADN người bằng dung môi MCLB1: Giảm chi phí xét nghiệm, tăng độ nhạy PCR, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm tại Việt Nam. Thời gian: 1 năm; chủ thể: các phòng xét nghiệm sinh học phân tử.

3. Đào tạo chuyên môn cho kỹ thuật viên và bác sĩ lâm sàng: Về kỹ thuật PCR đa mồi và ứng dụng trong chẩn đoán NKH, giúp nâng cao nhận thức và sử dụng kết quả xét nghiệm hiệu quả. Thời gian: liên tục; chủ thể: các trung tâm đào tạo y tế.

4. Nghiên cứu mở rộng phát hiện thêm các tác nhân vi khuẩn khác và đa dạng mẫu bệnh phẩm: Tăng khả năng chẩn đoán toàn diện các nguyên nhân NKH, bao gồm vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn yếm khí. Thời gian: 2-3 năm; chủ thể: các viện nghiên cứu và bệnh viện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia truyền nhiễm: Nắm bắt phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác để lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, giảm tỷ lệ tử vong do NKH.

2. Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử: Áp dụng quy trình PCR đa mồi và kỹ thuật loại bỏ ADN người để nâng cao chất lượng xét nghiệm, giảm sai sót.

3. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành di truyền học, vi sinh: Tham khảo phương pháp thiết kế mồi PCR, kỹ thuật tách chiết ADN và ứng dụng PCR đa mồi trong chẩn đoán vi sinh.

4. Quản lý y tế và chính sách y tế: Đánh giá hiệu quả và chi phí của kỹ thuật PCR đa mồi để xây dựng chính sách đầu tư trang thiết bị và đào tạo nhân lực phù hợp.

Câu hỏi thường gặp

1. PCR đa mồi là gì và ưu điểm so với PCR đơn mồi?
   PCR đa mồi sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng để phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn, tiết kiệm thời gian và chi phí so với PCR đơn mồi chỉ phát hiện một loại vi khuẩn mỗi lần.

2. Tại sao cần loại bỏ ADN người trước khi thực hiện PCR?
   ADN người trong mẫu bệnh phẩm có thể gây ức chế phản ứng PCR hoặc tạo dương tính giả do bắt chéo mồi, làm giảm độ nhạy và đặc hiệu của xét nghiệm.

3. Phương pháp loại bỏ ADN người bằng dung môi MCLB1 có hiệu quả thế nào?
   Dung môi MCLB1 phá vỡ tế bào người mà không ảnh hưởng đến tế bào vi khuẩn, giúp loại bỏ ADN người hiệu quả, làm giàu ADN vi khuẩn, tăng độ nhạy PCR tương đương kit thương mại nhưng chi phí thấp hơn nhiều.

4. Độ nhạy của PCR đa mồi trong nghiên cứu này đạt mức nào?
   PCR đa mồi phát hiện được vi khuẩn ở nồng độ thấp nhất khoảng 10^2 CFU/ml trong mẫu máu, phù hợp với ngưỡng lâm sàng cần thiết để chẩn đoán NKH.

5. Có thể áp dụng quy trình này cho các loại vi khuẩn khác không?
   Quy trình có thể mở rộng bằng cách thiết kế thêm các cặp mồi đặc hiệu cho các vi khuẩn khác, tuy nhiên cần tối ưu hóa và đánh giá lại độ nhạy, đặc hiệu trước khi áp dụng rộng rãi.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình PCR đa mồi phát hiện đồng thời các vi khuẩn họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người với độ nhạy và đặc hiệu cao.
• Thiết lập hiệu quả công nghệ loại bỏ ADN người bằng dung môi MCLB1, làm giàu ADN vi khuẩn, tăng độ nhạy xét nghiệm.
• Kết quả giải trình tự gen khẳng định tính chính xác của các đoạn gen đích được khuếch đại.
• Quy trình giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán NKH, hỗ trợ lựa chọn kháng sinh kịp thời, giảm tỷ lệ tử vong.
• Đề xuất triển khai áp dụng rộng rãi tại các bệnh viện và phòng xét nghiệm, đồng thời đào tạo nhân lực và nghiên cứu mở rộng thêm các tác nhân vi khuẩn khác.

Các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm nên phối hợp triển khai quy trình PCR đa mồi và công nghệ loại bỏ ADN người để nâng cao chất lượng chẩn đoán NKH, đồng thời tiếp tục nghiên cứu mở rộng và hoàn thiện kỹ thuật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người 1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một trong những bệnh lý được quan tâm bởi tỷ lệ mắc bệnh, tử vong cao. Một trong những nguyên nhân gây tử vong cao đó là do các vi khuẩn đa kháng kháng sinh.

Triệu chứng lâm sàng của NKH không đặc hiệu và không khẳng định, thường chỉ biểu hiện rõ trong giai đoạn trễ. Các marker sinh học - đặc biệt là các cytokin có vai trò quan trọng, giúp phát hiện và đánh giá mức độ nặng của tình trạng viêm, phân biệt tác nhân là vi khuẩn, góp phần giúp thầy thuốc chẩn đoán và điều trị kịp thời NKH trong giai đoạn “giờ vàng”, rút ngắn thời gian nằm viện và giảm tỉ lệ tử vong của bệnh nhân. NKH có xu hướng gia tăng và do các nguyên nhân xác định. Trong đó, bệnh lý nhiễm trùng đường hô hấp luôn là nguyên nhân phổ biến dẫn tới NKH hay sôc nhiễm khuẩn [30].

Nhìn chung, nhiễm trùng đường hô hấp chiếm khoảng một nửa số ca NKH. Ngoài ra, còn có các nguyên nhân khác như nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn ổ bụng. Với các nguyên nhân gây bệnh khác nhau nhưng việc sử dụng kháng sinh sớm là điều tiên quyết trong điều trị khỏi bệnh cho bệnh nhân. Nghiên cứu của Houck PM ở những bệnh nhân viêm phổi và bệnh nhân NKH chỉ ra rằng việc sử dụng kháng sinh chậm trễ trong điều trị kháng sinh nguy cơ dẫn tới tử vong tăng lên đáng kể.

Đặc biệt với nhiễm khuẩn, nguy cơ tử vong tăng lên khoảng 10% trong mỗi giờ chậm trễ [21]. Song song với việc sử dụng kháng sinh sớm thì việc lựa chọn kháng sinh thích hợp cũng rất quan trọng. Cùng với đó, việc điều trị kháng sinh hiện nay nếu chờ đợi dựa vào kết quả cấy máu thì quá lâu nên nhiều khi các bác sỹ lâm sàng buộc phải điều trị bệnh nhân theo kinh nghiệm tích lũy. Như vậy mặt tích cực là sử dụng kháng sinh sớm nhưng lại trở nên gặp khó khăn trong việc lựa chọn sử dụng kháng sinh thích hợp để điều trị.

Do vậy, nhờ sự phát triển của nền sinh học phân tử hiện đại, 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] những kỹ thuật tiên tiến nhất để phát hiện vi khuẩn gây NKH được đề xuất đáp ứng nhu cầu chẩn đoán nhanh tác nhân vi sinh gây bệnh. Tỷ lệ NKH thay đổi theo từng quốc gia, theo mùa, theo từng cơ quan xâm nhập và tùy từng đối tượng bệnh nhân. Vào những thập niên 1970 tại Mỹ hàng năm xảy ra khoảng 164000 ca NKH/năm. Tuy nhiên 15 năm gần đây đã có 750000 ca NKH/năm, số ca tử vong tăng từ 18500 ca lên 31000 ca NKH/năm chiếm khoảng 2% số bệnh nhân nhập viện và chiếm 75% các trường hợp nằm ở khoa Hồi sức tích cực [40]; Một nghiên cứu tại Hàn Quốc thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Gram âm trên tổng số ca NKH là 43%, trong khi đó chỉ có 20,4% là vi khuẩn Gram dương.

Người ta cũng ghi nhận nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nấm là 0,7% và vi khuẩn kỵ khí là 0,6%. Tần suất bắt gặp các mầm bệnh ở các khu vực là khác nhau. Khi phân tích trên từng khu vực người ta thấy Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumoniae là phổ biến nhất ở Châu Phi, trong khi đó Klebsiella gặp tỷ lệ cao nhất ở Đông Nam Á, đồng thời tỷ lệ kháng thuốc gặp nhiều nhất ở Klebsiella [41]. Một nghiên cứu đa trung tâm tại Hàn Quốc gần đây cho thấy trong số 1192 bệnh nhân NKH là người lớn được điều trị tại 22 đơn vị hồi sức cấp cứu từ 2005 đến 2009 thì có 740 (62,1%) bệnh nhân bị shock nhiễm khuẩn.

Về tỷ lệ phân bố các mầm bệnh phụ thuộc vào vùng địa lý, đặc điểm, điều kiện kinh tế, xã hội. Trong nghiên cứu tại Hàn Quốc, một nước phát triển thấy tỷ lệ vi khuẩn gram âm là 43%, trong khi đó chỉ có 20,4% là vi khuẩn gram dương. Người ta cũng ghi nhận nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nấm là 0,7% và vi khuẩn kỵ khí là 0,6%. Các vi khuẩn nhiễm nhiều nhất là Escherichia coli (22,1%), tiếp theo là Klebsiella sp (12,6%) và Staphylococcus aureus (8,4%) [32].

Nghiên cứu của Deen và cộng sự về sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 là báo cáo tổng hợp của 17 nghiên cứu khác nhau tại khu vực Nam và Đông Nam Châu Á lại cho thấy tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất là loài Salmonella enteric serotype Typhi với 532/1798 tổng số ca dương tính (chiếm 30%) ở người lớn và 432/1723 tổng số ca dương tính (chiếm 25%) ở trẻ em. Ngoài ra, các 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] mầm bệnh vi sinh khuẩn khác thường gặp ở người lớn như S. coli và nhóm vi khuẩn Gram âm khác. Vi khuẩn thường gặp ở trẻ em như S.

Kết quả được thể hiện ở Bảng 1 dưới đây: Bảng 2. Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17 nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu Á) [12] Tính chung Người lớn Trẻ em (n; %) (n; %) (n; %) Enterobacteriaceae Gram âm 2132 (60,6) 1392 (77,4) 740 (42,9) Salmonella enteric S enterica serotype Typhi 964 (27,4) 532 (29,6) 432 (25,1) Non-typhoidal Salmonella 170 (4,8) 148 (8,2) 22 (1,3) Non-Salmonella Enterobacteriaceae Escherichia coli 240 (6,8) 215 (12,0) 25 (1,5) Klebsiella sp 156 (4,4) 137 (7,6) 19 (1,1) Enterobacter sp 29 (0,8) 26 (1,4) 3 (0,2) Proteus sp 10 (0,3) 8 (0,4) 2 (0,1) Citrobacter sp 8 (0,2) 8 (0,4) 0 (0) Shigella sp 3 (0,1) 1 (0,1) 2 (0,1) Other Enterobacteriaceae 11 (0,3) 5 (0,3) 6 (0,3) Các VK Gram âm khác, Haemophilus influenzae 144 (4,1) 0 (0) 144 (8,4) Acinetobacter sp 18 (0,5) 6 (0,3) 12 (0,7) Burkholderia pseudomallei 15 (0,4) 13 (0,7) 2 (0,1) Pseudomonas sp 209 (5,9) 183 (10,2) 26 (1,5) Neisseria sp 7 (0,2) 1 (0,1) 6 (0,3) Aeromonas hydrophilia 6 (0,2) 5 (0,3) 1 (0,1) 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Tính chung Người lớn Trẻ em (n; %) (n; %) (n; %) Moraxella catarrhalis 24 (0,7) 0 (0) 24 (1,4) Các Gram âm khác 7 (0,2) 1 (0,1) 6 (0,3) Không xác định 111 (3,2) 103 (5,7) 8 (0,5) Gram dương 626 (17,8) 305 (17,0) 321 (18,6) Staphylococcus aureus 298 (8,5) 227 (12,6) 71 (4,1) Streptococcus pneumoniae 235 (6,7) 15 (0,8) 220 (12,8) Group A streptococcus (S 12 (0,3) 3 (0,2) 9 (0,5) pyogens) Group B streptococcus (S 1 (<0·1) 1 (0,1) 0 (0) agalactiae) Enterococcus spp (group D 24 (0,7) 22 (1,2) 2 (0,1) streptococcus) Other streptococci 27 (0,8) 10 (0,6) 17 (1,0) Các Gram dương khác 17 (0,5) 16 (0,9) 1 (0,1) Không xác định 12 (0,3) 11 (0,6) 1 (0,1) Nấm 43 (1,2) 43 (2,4) 0 (0) Cryptococcus spp 33 (0,9) 33 (1,8) 0 (0) Candida spp 2 (0,1) 2 (0,1) 0 (0) Histoplasma capsulatum 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0) Penicillium marneffei 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0) Mycobacteria 57 (1,6) 57 (3,2) 0 (0) Mycobacterium 27 (0,8) 27 (1,5) 0 (0) tuberculosis complex Mycobacterium avium complex 24 (0,7) 24 (1,3) 0 (0) Other mycobacteria 6 (0,2) 6 (0,3) 0 (0) Nguyên nhân khác 663 (18,8) 1 (0,1) 662 (38,4) 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Như vậy, các nghiên cứu trên cũng đã phản ánh rõ ràng về tần suất xuất hiện các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm cao hơn nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là họ vi khuẩn Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp, Proteus spp, Salmonella sp và Enterobacteriaceae khác là những tác nhân hàng đầu gây bệnh lý NKH. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt Nam Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về các căn nguyên vi sinh vật gây bệnh ở người trên các thể bệnh khác nhau như viêm tiết niệu, nhiễm trùng vết mổ, NKH. Nhìn chung các vi khuẩn gây bệnh rất đa dạng, tuy nhiên các loài vi khuẩn thường gặp gây bệnh được thống kê vẫn phổ biến nhất là các loài thuộc họ Enterobacteriaceae.

Tác giả Trần Thị Ngọc Anh năm 2007, tại Viện Nhi Đồng 2 phân lập được 2738 chủng vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Vi khuẩn thường gặp nhất là: E. Trong đó, hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được có tính kháng với nhóm kháng sinh betalactam, kháng và nhạy với carbapenem, tỷ lệ tụ cầu vàng kháng methiciline là 33,5% trong tổng số các chủng vi khuẩn phân lập được [1]. Do vậy, trong thực hành lâm sàng, việc xác định căn nguyên vi khuẩn gây bệnh nhanh chóng và xác định tính kháng kháng sinh sẽ trở nên hữu ích và cần thiết cho các bác sĩ trong việc điều chỉnh phác đồ điều trị cho bệnh nhân.

Thống kê của chương trình giám sát quốc gia về tính kháng thuốc của vi khuẩn năm 1996 thu được 1082 chủng từ các đơn vị tham gia trên toàn quốc chỉ ra rằng tỷ lệ NKH chiếm 21,6% trong số các loại bệnh phẩm thu được [7]. Phạm Văn Ca nghiên cứu trong thời gian 5 năm tại Bệnh viện Bạch Mai (1989-1993), tỷ lệ bệnh nhân cấy máu dương tính là 11,8 % ; Phạm Hùng Vân và cộng sự trong kết quả nghiên cứu từ 16 bệnh viện trên toàn quốc thu được 1602 chủng từ nhiều nguồn bệnh phẩm khác nhau trong đó có 188 bệnh phẩm máu chiếm tỷ lệ 11.7% [3]; Nghiên cứu của 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Nguyễn Thanh Liêm và cs tại Bệnh viện Nhi đồng I từ năm 1999 đến 2004 nhóm vi khuẩn gây bệnh Gram âm chiếm tới (61.3%), trong đó hàng đầu là Klebsiella spp (44%), E. Một nghiên cứu về các căn nguyên gây NKH tại Bệnh viện TƯQĐ 108 do tác giả Bùi Thanh Thuyết trên 8.134 mẫu máu từ năm 2010 đến năm 2013 có 952 mẫu cấy máu dương tính (chiếm 11,7%). Trong đó, các vi khuẩn thường gặp là E.và hầu hết các vi khuẩn này là vi khuẩn đa kháng thuốc, chúng kháng lại với đa số các kháng sinh thường dùng trong bệnh viện [6].

Như vậy, không chỉ ở trên thế giới mà cả ở Việt Nam, dịch tễ học các căn nguyên chính gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất, mức độ gây hại lớn vẫn tập trung vào nhóm vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Điều này cho thấy, trong thực hành lâm sàng tại Bệnh viện, việc chẩn đoán xác định chính xác và nhanh chóng chúng là việc làm rất cần thiết. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người. Enterobacteriaceae là các chi vi khuẩn đường ruột Gram âm có hình que, chiều dài điển hình từ 1 μm đến 5 μm kị khí không nghiêm ngặt, lên men đường thành acid lactic.

Hầu hết chúng khử nitrat thành nitrit, ngoại trừ một số vi khuẩn như Photorhabdus.