Nghiên cứu phát hiện lectin thực vật có khả năng ngưng kết vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu lectin thực vật có khả năng ngưng kết vi khuẩn gây nhiễm độc thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

• Tác giả: Mai Thị Đàm Linh
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Phương Thuận
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phát hiện lectin thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây nhiễm độc thực phẩm phổ biến
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• Mục lục
• Danh mục các chữ cái viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
• 1.1. TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
• 1.1. Trên Thế giới
• 1.2. Tại Việt Nam
• 1.2. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn
• 1.3. Một số vi khuẩn gây bệnh qua đƣờng thực phẩm thƣờng gặp
• 1.1. Vi khuẩn Salmonella và các bệnh do Salmonella
• 1.2. Shigella và bệnh lỵ trựckhuẩn
• 1.1. Đặc điểm sinh học của Shigella
• 1.2. Ngộ độc thực phẩm do Shigella
• 1.3. Escherichia coli gây bệnh
• 1.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn E. coli gây bệnh
• 1.1. Đặc điểm sinh học
• 1.2. Khả năng sinh độc tố
• 1.3. Nhiễm độc do S.5 Các nhóm vi khuẩn khác
• 1.1. Bệnh do Listeria
• 1.2. Các bệnh do Campylobacter (Campylobacteriosis)
• 1.3. Bệnh viêm đƣờng ruột – dạ dày do Clostridium perfringens
• 1.4. Bệnh đƣờng ruột- dạ dày do Bacillus cereus
• 1.5. Clostridium botulinum và bệnh do Clostridium botulinum (Botulism)
• 1.4. Các kĩ thuật phân tích, kiểm tra vi khuẩn trong thực phẩm
• 1.1. Các phƣơng pháp truyền thống
• 1.2. Các phƣơng pháp hiện đại
• 1.3. Phƣơng pháp sử dụng lectin
• 1.6. Lectin và các ứng dụng trong chẩn đoán vi khuẩn
• 1.1. Định nghĩa lectin
• 1.2. Nguồn lectin trong tự nhiên
• 1.3. Cấu tạo phân tử lectin
• 1.4. Tính đặc hiệu đƣờng của lectin
• 1.5. Ứng dụng của lectin
• 1.7. Các ứng dụng của lectin trong chẩn đoán vi khuẩn
• 1.1. Ứng dụng của lectin trong chẩn đoán các vi khuẩn Gram dƣơng
• 1.1. Ứng dụng lectin trong chẩn đoán vi khuẩn Gram âm
• 1.8. Mối liên quan giữa tính đặc hiệu đƣờng của lectin và khả năng gây ngƣng kết vi khuẩn
• 1.9. Ý nghĩa của việc sử dụng lectin làm công cụ chẩn đoán vi khuẩn
• 2. Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
• 2.2. Dụng cụ - hóa chất – môi trƣờng
• 2.1. Hoá chât – sinh phẩm, thiết bị dùng trong nghiên cứu vi sinh vật
• 2.2. Hoá chât – sinh phẩm, thiết bị dùng trong tách chiết và nghiên cứu về lectin
• 2.3. Môi trƣờng nuôi cấy
• 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.1. Phân lập và định danh vi sinh vật
• 2.2. Kỹ thuật phát hiện Salmonella, Shigella trong thực phẩm
• 2.4. Phƣơng pháp phát hiện E. coli trong thực phẩm theo kĩ thuật IMViC
• 2.5. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus
• 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu về lectin
• 2.1. Tách chiết và tinh sạch lectin
• 2.2. Xác định hoạt độ lectin bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu
• 2.3. Phản ứng ngƣng kết giữa các tế bào vi khuẩn và lectin
• 2.4. Phƣơng pháp tiến hành phản ứng đặc hiệu đƣờng
• 2.5. Xác định ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của lectin
• 2.6. Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của lectin
• 2.7. Phƣơng pháp định lƣợng protein
• 2.8. Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion trên cột CM- Sephadex
• 2.9. Phƣơng pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)
• 3. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu khả năng gây ngƣng kết của lectin lên một số nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thƣờng gặp
• 3.2. Tính đặc hiệu đƣờng của dịch chiết lectin
• 3.3. Nghiên cứu mối tƣơng tác giữa lectin với một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập đƣợc
• 3.1. Phân lập vi khuẩn
• 3.2. Phân lập Salmonella
• 3.4. Kết quả gây ngƣng kết của lectin thực vật với vi khuẩn phân lập
• 3.1. Tác dụng gây ngƣng kết của lectin với các chủng thuộc chi Salmonella
• 3.2. Tác dụng gây ngƣng kết của lectin với Shigella
• 3.3. Tác dụng của lectin lên các loài vi khuẩn thuộc chi E.4 Tác dụng của lectin lên các loài vi khuẩn thuộc chi Staphylococcus
• 3.5. Nghiên cứu tính chất gây ngƣng kết đặc hiệu của lectin để ứng dụng lectin vào phân loại vi khuẩn nghiên cứu
• 3.6. TINH CHẾ VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH HÓA SINH MIỄN DỊCH CỦA 2 LECTIN CHỌN LỰA
• 3.1. Tinh chế và nghiên cứu đặc tính lectin hạt Đậu ma
• 3.1. Lựa chọn đệm chiết thích hợp cho quá trình tinh chế
• 3.2. Tinh chế lectin hạt Đậu ma bằng kết tủa phân đoạn nhờ điều chỉnh pH
• 3.2. Tinh chế ĐM-CP2 trên cột sắc ký trao đổi ion CM- Sephadex
• 3.3. Nghiên cứu một số tính chất hóa sinh của lectin hạt Đậu ma
• 3.4. Tinh chế và nghiên cứu đặc tính lectin từ cây Tú cầu đỏ
• 3.1. Sắc kí qua cột trao đổi ion DE-52 Cellulose
• 3.2. Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm bằng điện di biến tính
• 3.5. Nghiên cứu một số đặc tính của lectin Tú cầu đỏ
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về lectin thực vật và ngộ độc thực phẩm

Lectin thực vật là một loại protein có khả năng liên kết với carbohydrate, đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và phân loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn là một vấn đề nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Theo thống kê, hàng năm có hàng triệu ca ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới, trong đó vi khuẩn như Salmonella, Shigella và E. coli là những tác nhân chính. Việc phát hiện sớm và chính xác các vi khuẩn này là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe con người.

1.1. Định nghĩa và vai trò của lectin trong phát hiện vi khuẩn

Lectin là một loại protein không có chức năng xúc tác nhưng có khả năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Điều này giúp nhận diện và phân loại các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Việc sử dụng lectin trong nghiên cứu vi sinh vật đang ngày càng trở nên phổ biến nhờ vào tính đặc hiệu và độ nhạy cao.

1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn tại Việt Nam

Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh tại Việt Nam. Theo thống kê, hàng năm có hàng triệu người bị ngộ độc thực phẩm, trong đó vi khuẩn như Salmonella và E. coli chiếm tỷ lệ cao. Việc phát hiện và kiểm soát các vi khuẩn này là rất quan trọng để giảm thiểu nguy cơ ngộ độc.

II. Vấn đề và thách thức trong phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện vi khuẩn, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc áp dụng chúng trong thực tiễn. Các phương pháp truyền thống thường tốn thời gian và công sức, trong khi các phương pháp hiện đại lại đòi hỏi thiết bị và chi phí cao. Điều này tạo ra rào cản cho việc phát hiện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm.

2.1. Những hạn chế của phương pháp truyền thống

Phương pháp nuôi cấy truyền thống thường mất nhiều thời gian và yêu cầu kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Điều này dẫn đến việc phát hiện vi khuẩn không kịp thời, gây ra nguy cơ ngộ độc thực phẩm cao hơn.

2.2. Chi phí cao của các phương pháp hiện đại

Các phương pháp hiện đại như sinh học phân tử thường yêu cầu thiết bị đắt tiền và nguyên liệu hiếm. Điều này làm cho nhiều phòng thí nghiệm, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, không thể áp dụng được.

III. Phương pháp phát hiện lectin trong nghiên cứu vi khuẩn

Phương pháp sử dụng lectin để phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm đang được nghiên cứu và phát triển. Lectin có khả năng liên kết đặc hiệu với các carbohydrate trên bề mặt vi khuẩn, giúp nhận diện và phân loại chúng một cách nhanh chóng và chính xác. Nghiên cứu cho thấy lectin có thể được sử dụng để phát hiện nhiều loại vi khuẩn khác nhau, từ Salmonella đến E. coli.

3.1. Quy trình tách chiết và tinh sạch lectin

Quy trình tách chiết lectin từ thực vật bao gồm nhiều bước như nghiền nát, hòa tan và lọc. Sau đó, lectin được tinh sạch bằng các phương pháp như sắc ký trao đổi ion. Điều này giúp thu được lectin có độ tinh khiết cao, sẵn sàng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Phản ứng ngưng kết giữa lectin và vi khuẩn

Phản ứng ngưng kết là một trong những phương pháp chính để xác định khả năng tương tác giữa lectin và vi khuẩn. Khi lectin tiếp xúc với vi khuẩn, nếu có sự tương tác, sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết, cho phép nhận diện vi khuẩn một cách nhanh chóng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của lectin trong phát hiện vi khuẩn

Lectin không chỉ được sử dụng trong nghiên cứu mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong việc phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng lectin có thể giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn như Salmonella, Shigella và E. coli, từ đó giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm.

4.1. Kết quả nghiên cứu về khả năng ngưng kết của lectin

Nghiên cứu cho thấy lectin có khả năng ngưng kết đặc hiệu với nhiều loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Điều này mở ra cơ hội sử dụng lectin như một công cụ chẩn đoán hiệu quả trong các phòng thí nghiệm.

4.2. Ứng dụng lectin trong ngành thực phẩm

Lectin có thể được ứng dụng trong ngành thực phẩm để kiểm tra an toàn thực phẩm. Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây ngộ độc sẽ giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nâng cao chất lượng thực phẩm.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu lectin

Nghiên cứu về lectin thực vật trong phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm đang mở ra nhiều triển vọng mới. Với khả năng phát hiện nhanh chóng và chính xác, lectin có thể trở thành một công cụ quan trọng trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn hơn nữa trong lĩnh vực vi sinh vật học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu lectin trong vi sinh vật học

Nghiên cứu về lectin có thể mở rộng ra nhiều lĩnh vực khác nhau trong vi sinh vật học, từ phát hiện vi khuẩn đến nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm. Điều này sẽ giúp nâng cao hiểu biết về các tác nhân gây bệnh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu và ứng dụng lectin

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp sử dụng lectin trong phát hiện vi khuẩn. Đồng thời, cần có sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và ngành công nghiệp thực phẩm để ứng dụng lectin vào thực tiễn một cách hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu có tiêu đề "Nghiên cứu phát hiện lectin thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây nhiễm độc thực phẩm phổ biến" do nghiên cứu sinh Mai Thị Đàm Linh thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Bùi Phương Thuận và Tiến sĩ Kiều Hữu Ảnh. Luận án thuộc chuyên ngành Vi sinh vật học, mã số 62 42 40 01, được bảo vệ tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2014.

Về tính cấp thiết, tác giả trình bày an toàn thực phẩm là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người, sự phát triển giống nòi và kinh tế xã hội. Thống kê tại Việt Nam cho thấy mỗi năm có khoảng 2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc có liên quan đến thực phẩm, kéo theo chi phí giải quyết ước tính trên 2.000 tỷ đồng mỗi năm. Nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm bắt nguồn từ vi sinh vật, trong đó vi khuẩn chiếm từ 33% đến 49% các vụ tiêu chảy hàng loạt. Bốn nhóm tác nhân vi khuẩn thường gặp nhất bao gồm Salmonella, Shigella, Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Các phương pháp kiểm tra truyền thống đòi hỏi thời gian nuôi cấy dài, tốn nhân lực và phụ thuộc vào trình độ kỹ thuật viên, trong khi phương pháp sinh học phân tử như phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) hay miễn dịch gắn enzym (ELISA) lại đòi hỏi trang thiết bị đồng bộ, chi phí cao, khó áp dụng rộng rãi tại các phòng xét nghiệm tuyến cơ sở.

Về khoảng trống nghiên cứu, phản ứng ngưng kết nhờ lectin thực vật là phương pháp có nhiều ưu điểm: thời gian phản ứng nhanh (5 đến 10 phút), hoạt động ở nồng độ chất thử rất thấp (khoảng 1 µg hoặc nhỏ hơn), hóa chất bền vững, quy trình thực hiện đơn giản và chi phí thấp. Dù hệ thực vật nhiệt đới Việt Nam rất phong phú, các nghiên cứu trong nước trước thời điểm luận án thực hiện chủ yếu tập trung vào việc tinh sạch, nghiên cứu tính chất lectin hoặc ứng dụng trong y học (phân loại nhóm máu, nhận diện tế bào ác tính, kìm hãm virus). Ứng dụng lectin trong phát hiện vi sinh vật mới chỉ bắt đầu ở mức thăm dò khả năng ngưng kết đơn lẻ, chưa có công trình nào khảo sát hệ thống và toàn diện về tương tác đặc hiệu của lectin với các vi khuẩn gây bệnh qua đường thực phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

1. Phát hiện, nghiên cứu, tuyển chọn được các nhóm lectin tương tác đặc hiệu với các nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập tại Việt Nam.
2. Tinh chế, xác định được một số tính chất các lectin có biểu hiện tương tác đặc hiệu với vi khuẩn, bước đầu xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm bằng phản ứng ngưng kết với lectin.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các dịch chiết và chế phẩm lectin có nguồn gốc từ thực vật tại Việt Nam (trong đó trọng tâm nghiên cứu sâu là lectin hạt Đậu ma và lectin cây Tú cầu đỏ); các chủng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thuộc bốn chi gồm Salmonella, Shigella, Escherichia coli và Staphylococcus.
• Phạm vi không gian: Khảo sát, thu thập nguồn thực vật và phân lập các chủng vi khuẩn từ các mẫu thức ăn, mẫu thực phẩm tại Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Luận án tổng hợp số liệu thực nghiệm và hoàn thành bảo vệ trong năm 2014.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong chương tổng quan, tác giả đã điểm lại hệ thống tài liệu nghiên cứu về dịch tễ ngộ độc thực phẩm và các phương pháp phát hiện vi sinh vật trên thế giới và tại Việt Nam:

Về tình hình dịch tễ, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2008) ước tính hàng năm có khoảng 130 triệu người mắc tiêu chảy, trong đó khoảng 70% bắt nguồn từ thực phẩm ô nhiễm. Tỷ lệ tử vong do tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi tại hơn 49 quốc gia đang phát triển là 6,6%, chiếm 36% tổng số ca tử vong ở độ tuổi này. Tại Mỹ, Trung tâm Kiểm soát và Ngăn ngừa Dịch bệnh (CDC) ghi nhận khoảng 5% dân số ngộ độc thực phẩm mỗi năm với khoảng 5.000 ca tử vong. Tại Pháp, thống kê cho thấy khoảng 75 vạn ca ngộ độc thực phẩm mỗi năm (tỷ lệ 1.210 ca/10 vạn dân), với 7 vạn ca cấp cứu nguy kịch. Tại châu Á, các quốc gia như Thái Lan, Ấn Độ, Philippines ghi nhận trung bình 100 người nhập viện mỗi ngày vì thực phẩm không an toàn. Năm 2011, một biến chủng E. coli bùng phát tại Đức và các nước châu Âu lây lan qua dưa chuột, cà chua, giá đỗ đã khiến 16 người chết và hơn 1.000 người mắc bệnh.

Tại Việt Nam, báo cáo của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm giai đoạn 2010 - 2012 phản ánh diễn biến ngộ độc thực phẩm với số ca nhập viện và tử vong tăng cao trong năm 2012:

Chỉ số theo dõi	Năm 2010	Năm 2011	Năm 2012
Số vụ ngộ độc thực phẩm	175	148	168
Số ca mắc ngộ độc	5.664	4.700	5.541
Số ca tử vong	51	27	34
Số ca nhập viện	3.978	3.663	4.335

Tỷ lệ ca mắc tập trung cao nhất tại miền Đông Nam Bộ (chiếm 51,91%), trong khi số ca tử vong tập trung chủ yếu ở vùng núi phía Bắc (chiếm 51,81%).

Về mặt lịch sử vi sinh học và sinh học phân tử, tác giả lược sử việc Daniel Salmon phát hiện Salmonella, Kiyoshi Shiga phát hiện Shigella dysenteriae typ I năm 1896, và Theodor Escherich mô tả E. coli năm 1885. Kauffmann xây dựng sơ đồ phân loại kháng nguyên O và H của Salmonella. Wen Yi ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích cấu trúc chuỗi kháng nguyên O của E. coli O86. Đối với phương pháp chẩn đoán, Minnich sử dụng kháng thể IgG kháng kháng nguyên roi của Salmonella Typhimurium; Qiuying Huang ứng dụng kỹ thuật real-time PCR phát hiện đồng thời 8 nhóm vi khuẩn trong một phản ứng; Vũ Đình Thiêm áp dụng real-time TaqMan PCR khuếch đại gen ipaH để phát hiện Shigella tại Nha Trang (Khánh Hòa) đạt độ nhạy 93% đến 100% trên các ca bệnh lỵ.

Về lịch sử nghiên cứu lectin, tác giả ghi nhận công trình đầu tiên của Stillmark về việc phát hiện protein ngưng kết hồng cầu. Năm 1936, Summer và Howell chứng minh Concanavalin A (Con A) từ cây Đậu rựa (Canavalia ensiformis) có khả năng ngưng kết vi khuẩn Mycobacterium. Tiếp sau đó, nhiều công trình quốc tế đã ứng dụng lectin từ đậu tương (SBA) và ốc sên (Helix pomatia - HPA) để chẩn đoán Bacillus anthracis; lectin mầm lúa mì (WGA) để phát hiện Neisseria; lectin từ Cepaea hortensis để nhận diện Streptococcus nhóm B; hay lectin từ Cà chua (Lycopersicon esculentum), Khoai tây (Solanum tuberosum) và cây Đa lá lệch (Ficus cunia - FCA) để phân loại vi khuẩn.

Vị trí của luận án: Luận án đặt mục tiêu giải quyết khoảng trống thực nghiệm trong nước bằng việc thiết lập dữ liệu tương tác ngưng kết có hệ thống giữa các nhóm lectin thực vật với bốn vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm chính phân lập tại Việt Nam, xây dựng khóa định loại vi khuẩn và tinh sạch các chế phẩm lectin có tính đặc hiệu cao.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở hóa sinh học và miễn dịch học về protein nhận diện carbohydrate:

• Định nghĩa: Lectin là các protein hoặc glycoprotein không có hoạt tính xúc tác, không có bản chất kháng thể miễn dịch, sở hữu ít nhất một vị trí liên kết thuận nghịch và phi hóa trị với các gốc carbohydrate (monosaccharide hoặc oligosaccharide) mà không làm biến đổi cấu trúc của đường liên kết.
• Phân loại cấu trúc lectin gồm bốn nhóm chính: Merolectin (chứa một miền liên kết carbohydrate duy nhất), Hololectin (chứa hai hay nhiều miền liên kết tương đồng), Chimerolectin (phức hợp giữa miền liên kết đường và miền có hoạt tính sinh học khác), và Superlectin (phức hợp chứa các miền liên kết nhận biết những loại đường có cấu trúc khác nhau). Một số lectin đòi hỏi sự có mặt của ion kim loại hóa trị hai như Ca²⁺ và Mn²⁺ để duy trì cấu hình không gian của trung tâm gắn đường.
• Tính đặc hiệu đường: Lectin được phân loại theo ái lực với các gốc đường: nhóm Glucose/Mannose; nhóm Galactose và N-acetyl-D-galactosamine (Gal/GalNAc); nhóm L-fucose và sialic acid; nhóm N-acetylglucosamine (GlcNAc).
• Cơ chế gây ngưng kết: Bề mặt tế bào vi khuẩn có cấu trúc phức tạp gồm lipopolysaccharide (LPS, chuỗi O), peptidoglycan, acid teichoic, murein hoặc lớp vỏ capsul giàu gốc đường. Lectin đóng vai trò như cầu nối đa hóa trị liên kết với các gốc đường này, làm các tế bào vi khuẩn liên kết chéo lại với nhau tạo thành các đám ngưng kết quan sát được. Kháng nguyên vỏ K hoặc kháng nguyên Vi có thể bao bọc phía ngoài, làm cản trở tương tác của lectin với kháng nguyên thân O, đòi hỏi xử lý nhiệt (100°C trong 1 giờ) để bộc lộ vị trí gắn kết.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế kết hợp giữa kỹ thuật vi sinh truyền thống và kỹ thuật hóa sinh phân tích:

• Phương pháp phân lập và định danh vi sinh vật: Phân lập các chủng vi khuẩn từ mẫu thực phẩm theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN); nhận diện vi khuẩn Salmonella và Shigella trên môi trường chọn lọc kết hợp thử nghiệm sinh hóa; phân lập E. coli bằng kỹ thuật IMViC (Indole, Methyl Red, Voges-Proskauer, Citrate); phân lập Staphylococcus aureus trên môi trường Chapman và Baird-Parker chứa lòng đỏ trứng gà, kiểm tra enzyme coagulase; kiểm tra chéo bằng phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu thương mại.
• Phương pháp nghiên cứu lectin:
  • Tách chiết và xác định hoạt độ: Chiết lectin từ mô thực vật bằng các hệ đệm thích hợp; xác định hoạt độ ngưng kết hồng cầu (HAA), tính toán hoạt độ riêng (HĐR) và hoạt độ tổng số (HĐTS).
  • Phản ứng ngưng kết vi khuẩn: Thực hiện phản ứng giữa huyền phù tế bào vi khuẩn và dung dịch lectin trên phiến kính hoặc giếng vi hiệu chuẩn.
  • Thử nghiệm ức chế đường: Cho lectin ủ với các monosaccharide và oligosaccharide (như Glucose, Galactose, Mannose, Rhamnose, Fucose, Ribose, GlcNAc, GalNAc, ManNAc...) trước khi cho tiếp xúc với hồng cầu hoặc vi khuẩn để xác định tính đặc hiệu đường.
  • Khảo sát ảnh hưởng môi trường: Đánh giá sự biến thiên hoạt độ và độ bền của lectin theo dải pH và thang nhiệt độ khác nhau.
  • Định lượng protein: Áp dụng phương pháp Lowry, đo mật độ quang học (OD) trên máy quang phổ, dựng đường chuẩn bằng albumin huyết thanh bò (BSA).
  • Kỹ thuật tinh chế: Sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng cách điều chỉnh pH để loại bỏ protein tạp; sắc ký trao đổi ion trên cột CM-Sephadex (đối với lectin hạt Đậu ma) và sắc ký trao đổi ion trên cột DE-52 Cellulose (đối với lectin cây Tú cầu đỏ).
  • Kiểm tra độ tinh sạch và phân tử lượng: Điện di biến tính trên gel polyacrylamide có chứa sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE).

Nguồn dữ liệu thực nghiệm: Mẫu thức ăn và thực phẩm thu thập tại các cơ sở trên địa bàn nghiên cứu tại Việt Nam; mẫu thực vật hạt Đậu ma và cây Tú cầu đỏ thu hái trong nước.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp bức tranh toàn diện về dịch tễ ngộ độc thực phẩm, sinh học các loài vi khuẩn đích và cơ chế phân tử của lectin:

• Phân loại bệnh ngộ độc do vi khuẩn thành 3 nhóm cơ chế: nhiễm trùng phát sinh từ thực phẩm (Foodborne infections do vi khuẩn sống xâm nhập, sinh sản như Salmonella, E. coli, Shigella); bệnh nhiễm và gây độc phát sinh từ thực phẩm (Foodborne toxicoinfections do vi khuẩn giải phóng độc tố trong đường ruột như Clostridium perfringens, Bacillus cereus); và bệnh ngộ độc phát sinh từ thực phẩm (Foodborne intoxications do ăn phải thực phẩm chứa sẵn độc tố như S. aureus, C. botulinum).
• Mô tả đặc điểm sinh học và thành phần kháng nguyên của các vi khuẩn đích:
  • Salmonella: Trực khuẩn Gram âm, có kháng nguyên roi H (pha 1 mã hóa bởi fliC, pha 2 mã hóa bởi fliB), kháng nguyên thân O bản chất LPS (gồm D-galactose, L-rhamnose, D-mannose...), và kháng nguyên bề mặt Vi.
  • Shigella: Trực khuẩn Gram âm không di động, gồm 4 nhóm A (S. dysenteriae), B (S. flexneri), C (S. boydii), D (S. sonnei). Độc tố Shiga gồm tiểu phần A (38 kDa) gắn với 5 tiểu phần B (7,7 kDa) qua cầu disunfua; cơ chế xâm nhập qua tế bào M biểu mô ruột và sắp xếp lại F-actin.
  • E. coli gây bệnh: Phân chia thành các nhóm EPEC (chứa plasmid EAF, intimin 94-97 kDa mã hóa bởi gen eae, hệ thống tiết typ III), ETEC (tiết độc tố LT và ST), EHEC (tiết verotoxin Stx1, Stx2 gắn thụ thể Gb3), và EIEC (chứa plasmid pInv 140 kDa, các protein Ipa).
  • Staphylococcus aureus: Cầu khuẩn Gram dương, tạo cụm, thành tế bào cấu tạo từ murein chứa N-acetylglucosamine (GlcNAc) và acid N-acetylmuramic (MurNAc) liên kết β-(1,4), phân chia thành nhóm sinh enzyme coagulase và không sinh coagulase; tiết năm độc tố ruột (A, B, C, D, E) bền nhiệt.
  • Các vi khuẩn khác: Tác giả điểm qua Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Vibrio cholerae và Clostridium botulinum.
• Đánh giá ưu - nhược điểm của các phương pháp phân tích: Phương pháp truyền thống, kỹ thuật màng phim khô (Petrifilm), ELISA, PCR/real-time PCR, kỹ thuật đo trở kháng điện, và phương pháp sử dụng lectin.
• Tổng quan ứng dụng lectin trong chẩn đoán vi khuẩn Gram dương và Gram âm dựa trên cấu trúc glycan bề mặt.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và hệ thống bảng biểu, hóa chất:

• Liệt kê dụng cụ, hóa chất, sinh phẩm dùng trong vi sinh và tinh sạch protein. Bảng 2.1 trình bày ký hiệu các chủng vi khuẩn phân lập được từ thực phẩm.
• Quy trình phân lập Salmonella, Shigella theo quy chuẩn kỹ thuật; quy trình định danh E. coli bằng tổ hợp phản ứng sinh hóa IMViC; quy trình phân lập Staphylococcus aureus bằng môi trường chọn lọc Chapman, Baird-Parker lòng đỏ trứng gà và thử nghiệm coagulase.
• Quy trình nghiên cứu lectin: Đo độ ngưng kết hồng cầu (HAA); kỹ thuật thực hiện phản ứng ngưng kết vi khuẩn trên phiến kính; quy trình ức chế đặc hiệu đường; đo ảnh hưởng pH và nhiệt độ; định lượng protein theo Lowry với đồ thị chuẩn BSA (Hình 2.1); kỹ thuật sắc ký cột CM-Sephadex và DE-52 Cellulose; điện di biến tính SDS-PAGE.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình sàng lọc, phân lập, ngưng kết và tinh chế lectin:

• Khảo sát tương tác của các dịch chiết lectin thực vật thô lên vi khuẩn nghiên cứu (Bảng 3.1) và xác định tính đặc hiệu đường của dịch chiết thô qua phản ứng ức chế (Bảng 3.2).
• Kết quả phân lập vi khuẩn từ các nguồn thực phẩm: Bảng 3.3 ghi nhận kết quả phân lập Salmonella; Bảng 3.4 ghi nhận kết quả phân lập Shigella; Bảng 3.5 và Hình 3.4, 3.5 thể hiện kết quả sinh hóa của E. coli; Bảng 3.6 ghi nhận phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn; Bảng 3.7 và 3.8 ghi nhận sự hiện diện của Staphylococcus aureus và phản ứng coagulase.
• Đánh giá khả năng ngưng kết của lectin lên các chủng vi khuẩn phân lập: Bảng 3.9 và Hình 3.9 ghi nhận tác dụng ngưng kết với Salmonella; Bảng 3.10 thể hiện tác dụng lên Shigella flexneri; Bảng 3.11 và Hình 3.10 thể hiện tác dụng lên E. coli; Bảng 3.12 ghi nhận tương tác với chi Staphylococcus.
• Xây dựng sơ đồ khóa định loại vi khuẩn: Hình 3.11 là sơ đồ định loại các chủng E. coli; Hình 3.12 là sơ đồ định loại các chủng thuộc chi Staphylococcus; Hình 3.13 và Bảng 3.13 tổng hợp sơ đồ khóa định loại tổng quát các loài vi khuẩn nghiên cứu bằng phản ứng ngưng kết lectin.
• Tinh chế và nghiên cứu đặc tính hóa sinh của hai lectin chọn lựa:
  • Lectin hạt Đậu ma: Lựa chọn hệ đệm chiết thích hợp; loại bỏ protein tạp bằng kết tủa phân đoạn ở các ngưỡng pH khác nhau (Bảng 3.14 và Bảng 3.15); tinh chế phân đoạn ĐM-CP2 qua sắc ký trao đổi ion trên cột CM-Sephadex (sắc ký đồ Hình 3.14, ảnh điện di SDS-PAGE Hình 3.15); khảo sát ảnh hưởng của pH (Hình 3.16), độ bền pH (Hình 3.17), độ bền nhiệt (Hình 3.18); xác định tính đặc hiệu đường (Bảng 3.16) và đánh giá khả năng ngưng kết vi khuẩn của chế phẩm tinh chế so với dịch thô (Bảng 3.17).
  • Lectin cây Tú cầu đỏ: Tinh sạch qua sắc ký cột trao đổi ion DE-52 Cellulose (sắc ký đồ Hình 3.19, bảng kết quả tinh chế Bảng 3.18); kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di biến tính SDS-PAGE (Hình 3.20); khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ (Hình 3.19 và 3.20 của mục Tú cầu đỏ); xác định tính đặc hiệu đường (Bảng 3.19) và tác dụng gây ngưng kết với các vi khuẩn nghiên cứu (Bảng 3.20).

---

Kết quả và những đóng góp mới

Căn cứ theo công bố chính thức của luận án, các kết quả và đóng góp mới bao gồm:

1. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về các nhóm lectin thực vật gây ngưng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây bệnh qua đường thực phẩm tại Việt Nam.
2. Bước đầu xây dựng được quy trình phát hiện và phân biệt bốn vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến gồm: Escherichia coli gây bệnh (EPEC), Shigella flexneri, Staphylococcus aureus và Salmonella bằng phản ứng ngưng kết với lectin.
3. Đã đưa ra được quy trình tách chiết và tinh chế một số lectin có khả năng ngưng kết đặc hiệu với vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh (EPEC) và vi khuẩn Salmonella (cụ thể là lectin từ hạt Đậu ma và lectin từ cây Tú cầu đỏ).

Về kiến nghị và giải pháp đề xuất:

• Tiếp tục khảo sát, mở rộng sàng lọc thêm các nguồn lectin từ các loài thực vật nhiệt đới khác tại Việt Nam để bổ sung các lectin có ái lực đặc hiệu cao với các vi sinh vật gây bệnh khác.
• Nghiên cứu ứng dụng quy trình phản ứng ngưng kết lectin vào thực tiễn kiểm nghiệm an toàn thực phẩm tại các phòng xét nghiệm quy mô nhỏ, trạm y tế cơ sở nhằm giảm thiểu chi phí và thời gian phân tích.
• Nghiên cứu dẫn xuất lectin gắn hạt huỳnh quang, gắn enzyme hoặc hạt vàng nano nhằm nâng cao độ nhạy và hướng tới chế tạo các bộ sinh phẩm (kit) chẩn đoán nhanh phục vụ kiểm tra thực phẩm tại thực địa.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Phạm vi đối tượng vi khuẩn tập trung vào bốn nhóm chính (Salmonella, Shigella flexneri, EPEC, Staphylococcus aureus), chưa mở rộng kiểm tra trên toàn bộ các nhóm vi khuẩn đường ruột khác hoặc các chủng vi khuẩn hoại tử, sinh bào tử như Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes.
• Nghiên cứu tinh chế chuyên sâu mới tập trung vào hai đối tượng thực vật cụ thể là hạt Đậu ma và cây Tú cầu đỏ.
• Kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên bề mặt (Vi) của vi khuẩn có thể bao bọc lớp kháng nguyên thân (O), làm suy giảm hoặc cản trở phản ứng ngưng kết của lectin, đòi hỏi phải bổ sung bước xử lý nhiệt (đun sôi ở 100°C trong 1 giờ) trước khi thực hiện phản ứng.
• Kết quả ngưng kết mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm trên các chủng phân lập, chưa thử nghiệm trực tiếp trên nền mẫu thực phẩm phức tạp chưa qua nuôi cấy tăng sinh.

Hướng nghiên cứu tiếp:

• Mở rộng khảo sát phổ phản ứng ngưng kết của lectin trên các chủng vi khuẩn lâm sàng và thực phẩm phân lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau.
• Tinh sạch và giải trình tự acid amin của các lectin tiềm năng khác từ hệ thực vật phong phú của Việt Nam.
• Tối ưu hóa điều kiện phản ứng để rút ngắn thời gian xử lý mẫu và hoàn thiện quy trình thành bộ kít chẩn đoán hoàn chỉnh phục vụ kiểm nghiệm cơ sở.

---

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo cụ thể cho các nhóm đối tượng học thuật và ứng dụng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Vi sinh vật học, Hóa sinh học, Công nghệ sinh học và Đảm bảo chất lượng thực phẩm: Có thể sử dụng luận án như một tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp tách chiết protein thực vật, kỹ thuật sắc ký trao đổi ion (cột CM-Sephadex, DE-52 Cellulose), kỹ thuật điện di SDS-PAGE và phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu carbohydrate của lectin.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Tham khảo khung lý thuyết và tổng quan dịch tễ học vi khuẩn ngộ độc thực phẩm, cấu trúc kháng nguyên bề mặt (O, H, K, Vi) của vi khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae và tụ cầu khuẩn, cũng như cơ chế liên kết phân tử giữa lectin và carbohydrate tế bào.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm và người làm chính sách an toàn vệ sinh thực phẩm: Tham khảo các sơ đồ khóa định loại vi khuẩn bằng phản ứng ngưng kết lectin (Hình 3.11, Hình 3.12, Hình 3.13) để xây dựng các quy trình kiểm tra sàng lọc nhanh, chi phí thấp, phù hợp áp dụng tại các phòng phân tích địa phương nơi chưa trang bị máy PCR hoặc hệ thống ELISA tự động.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Lectin là gì và nguyên lý nào giúp lectin có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh?

Lectin là protein hoặc glycoprotein không có chức năng xúc tác enzyme và không có bản chất kháng thể miễn dịch, nhưng có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với các phân tử đường đơn hoặc đường đa. Trên bề mặt tế bào vi khuẩn có chứa nhiều cấu trúc glycan đặc thù như kháng nguyên thân O (lipopolysaccharide ở vi khuẩn Gram âm) hay acid teichoic và peptidoglycan (ở vi khuẩn Gram dương). Khi lectin tiếp xúc với vi khuẩn có cấu trúc đường tương ứng, liên kết đặc hiệu được hình thành; nhờ có nhiều vị trí gắn kết, phân tử lectin kết nối các tế bào vi khuẩn lại với nhau tạo nên hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được.

2. Phương pháp sử dụng lectin có ưu điểm gì so với phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật PCR?

So với phương pháp nuôi cấy truyền thống đòi hỏi nhiều bước thử nghiệm sinh hóa phức tạp và kéo dài từ vài ngày đến hàng tuần, phản ứng ngưng kết lectin diễn ra nhanh chóng chỉ trong 5 đến 10 phút. So với kỹ thuật sinh học phân tử như PCR hay kỹ thuật miễn dịch ELISA vốn đòi hỏi máy móc đắt tiền, sinh phẩm phức tạp và kỹ thuật viên chuyên sâu, phương pháp lectin có chi phí thấp, sử dụng lượng mẫu rất nhỏ (khoảng 1 µg lectin), thuốc thử bền vững, dễ bảo quản và phù hợp triển khai tại các phòng phân tích nhỏ tuyến cơ sở.

3. Hai nguồn lectin thực vật nào được chọn để tinh chế sâu trong luận án và áp dụng phương pháp nào?

Tác giả đã lựa chọn lectin từ hạt Đậu ma và lectin từ cây Tú cầu đỏ để nghiên cứu tinh chế và khảo sát tính chất:

• Lectin hạt Đậu ma: Tinh chế thông qua kết tủa phân đoạn bằng cách điều chỉnh pH (loại protein tạp ở môi trường pH acid và pH 9) và sắc ký trao đổi ion trên cột CM-Sephadex, thu được phân đoạn ĐM-CP2.
• Lectin cây Tú cầu đỏ: Tinh chế thông qua sắc ký trao đổi ion trên cột DE-52 Cellulose. Độ tinh sạch của cả hai chế phẩm đều được kiểm tra bằng điện di biến tính SDS-PAGE.

4. Kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên Vi ảnh hưởng như thế nào đến phản ứng ngưng kết và tác giả xử lý ra sao?

Kháng nguyên K (ở Shigella, E. coli) và kháng nguyên Vi (ở Salmonella) là các kháng nguyên bề mặt bao bọc bên ngoài thành tế bào. Khi tồn tại lớp vỏ bọc này, các gốc đường của kháng nguyên thân O bị che khuất, ngăn cản lectin tiếp cận và làm ức chế phản ứng ngưng kết. Để khắc phục, tác giả áp dụng phương pháp đun sôi canh khuẩn ở nhiệt độ 100°C trong vòng 1 giờ nhằm phá hủy cấu trúc kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên Vi, qua đó bộc lộ kháng nguyên thân O để phản ứng ngưng kết với lectin diễn ra bình thường.

5. Sơ đồ khóa định loại trong luận án phân biệt những nhóm vi khuẩn nào?

Dựa trên tính đặc hiệu ngưng kết của các nhóm lectin, luận án đã xây dựng các sơ đồ khóa định loại:

• Sơ đồ khóa định loại các chủng vi khuẩn Escherichia coli (Hình 3.11).
• Sơ đồ khóa định loại các chủng thuộc chi Staphylococcus (Hình 3.12).
• Sơ đồ khóa định loại tổng quát (Hình 3.13 và Bảng 3.13) cho phép phân biệt bốn nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến gồm: Escherichia coli gây bệnh (EPEC), Shigella flexneri, Staphylococcus aureus và Salmonella.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ sinh học của tác giả Mai Thị Đàm Linh đã khảo sát hệ thống khả năng ngưng kết của các nhóm lectin thực vật đối với các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp tại Việt Nam. Công trình đã tinh sạch thành công hai chế phẩm lectin từ hạt Đậu ma và cây Tú cầu đỏ bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, xác định các đặc tính hóa sinh, độ bền nhiệt, độ bền pH và tính đặc hiệu đường của chúng. Đồng thời, nghiên cứu đã bước đầu xây dựng sơ đồ khóa định loại cho phép nhận diện và phân biệt bốn nhóm vi khuẩn Salmonella, Shigella flexneri, EPEC và Staphylococcus aureus, đặt nền tảng thực nghiệm cho việc phát triển các công cụ chẩn đoán vi sinh vật nhanh, chi phí thấp tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Thực phẩm an toàn có vai trò quyết định đối với sức khỏe con ngƣời, tới chất lƣợng cuộc sống hiện tại cũng nhƣ phát triển giống nòi. Việc không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) có thể dẫn đến ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng thực phẩm và bệnh do thực phẩm. Mỗi năm Việt Nam có khoảng 2 triệu ngƣời bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc có liên quan đến thực phẩm, chi phí cho việc giải quyết các vụ ngộ độc ƣớc tính trên 2000 tỷ đồng/năm [2]. Nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm thƣờng gặp là do hóa chất, do độc tố, do vi sinh vật …Tuy nhiên nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm là do nhiễm vi khuẩn và chủ yếu tập trung vào các vi khuẩn nhƣ: Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Staphylococus aureus, Vibrio cholerae, Clostridium perfringens…[40].

Số lƣợng các ca ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn vẫn ngày càng tăng, không chỉ ở những nƣớc đang phát triển mà cả các nƣớc có nền kinh tế vững mạnh. Để làm giảm nguy cơ ngộ độc thức ăn cần có nhiều biện pháp đồng bộ từ việc trang bị kiến thức cho những ngƣời liên quan trực tiếp đến thực phẩm, chủ động làm sạch môi trƣờng, thực hiện quy trình vệ sinh đề phòng sự ô nhiễm và đặc biệt là cần thƣờng xuyên kiểm tra phát hiện mức độ ô nhiễm vi khuẩn gây bệnh đối với thực phẩm. Có rất nhiều phƣơng pháp khác nhau để kiểm tra, phát hiện sự có mặt của vi khuẩn trên thực phẩm nhƣ phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống, phƣơng pháp sử dụng sinh học phân tử hay phƣơng pháp miễn dịch. Phƣơng pháp sử dụng sinh học phân tử cho kết quả nhanh, chính xác nhƣng lại tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị và nguyên vật liệu đồng bộ với chi phí cao trong khi phƣơng pháp truyền thống đòi hỏi thời gian và công sức lớn của kỹ thuật viên và vẫn là phƣơng pháp đƣợc dùng phổ biến tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam [72].

Tuy vậy, phƣơng pháp vẫn gặp phải một số khó khăn khi triển khai tại các phòng thí nghiệm nhỏ. Hƣớng nghiên cứu sử dụng lectin trong phát hiện, phân loại vi khuẩn đang đƣợc quan tâm trong thời gian gần đây. Ƣu 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] điểm của phƣơng pháp này là cho kết quả nhanh, không đắt tiền, độ lặp lại cao, các nguyên liệu trong thí nghiệm bền và dễ bảo quản [45], đặc biệt là có thể triển khai tại các phòng thí nghiệm phân tích nhỏ. Lectin là một protein không có chức năng xúc tác, không có tính chất miễn dịch nhƣng có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị các carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate đƣợc liên kết [55].

Bề mặt của tế bào vi khuẩn có nhiều gốc đƣờng có khả năng tƣơng tác với lectin, mang tính đặc hiệu cao. Do vậy, dựa vào mối tƣơng tác lectin – vi khuẩn có thể nhận biết đƣợc nhóm vi khuẩn nào có liên kết đặc hiệu với lectin, từ đó sử dụng lectin để nhận biết đƣợc nhóm này. Đã có nhiều công bố về việc sử dụng lectin để phát hiện một số vi khuẩn, điển hình nhƣ lectin từ đậu tƣơng (SBA) và ốc sên (HPA) để nhận biết Bacillus anthracis – vi khuẩn gây bệnh than – một vi khuẩn rất khó phân biệt với các chủng Bacillus khác, lectin mầm lúa mỳ (WGA) giúp phát hiện vi khuẩn Neisseria…[41]. Lectin đã trở thành một chất thử tiêu chuẩn dùng trong phân loại vi sinh vật học [110].

Thêm vào đó vì lectin có hoạt độ cao nên tác dụng ở những nồng độ rất loãng, có tính đặc hiệu và có thể sử dụng ở dạng dẫn xuất gắn enzym, vàng, các đồng vị phóng xạ hoặc các chất chuẩn. Nguồn lectin đƣợc sử dụng nghiên cứu trong phân loại vi khuẩn thƣờng có nguồn gốc từ thực vật do có nhiều ƣu điểm nhƣ nồng độ lectin cao, đặc hiệu với nhiều loại đƣờng, dễ tách chiết…[56]. Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới với nguồn thực vật phong phú. Đây chính là nguồn cung cấp lectin dồi dào mà chƣa đƣợc khám phá.

Trong nƣớc, các lectin thực vật mới đƣợc tập trung nghiên cứu về các đặc tính, quá trình tinh sạch và ứng dụng trong y học. Hƣớng nghiên cứu ứng dụng lectin trong phát hiện vi sinh vật chỉ đƣợc bắt đầu một vài năm trở lại đây. Kết quả bƣớc đầu cho thấy việc xác định các vi khuẩn gây bệnh bằng lectin có độ đặc hiệu cao, ổn định, cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và ít tốn kém [20, 21, 22]. Tuy vậy các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc thăm dò khả năng 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ngƣng kết của lectin đối với một số loài vi khuẩn.

Tại Việt Nam chƣa có công trình nghiên cứu nào thống kê đầy đủ về mối tƣơng tác đặc hiệu của lectin với các loài vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh qua thực phẩm. Do tiềm năng ứng dụng lớn của lectin, luận án đƣợc tiến hành với những mục tiêu: 1. Phát hiện, nghiên cứu, tuyển chọn đƣợc các nhóm lectin tƣơng tác đặc hiệu với các nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập tại Việt Nam. Tinh chế, xác định đƣợc một số tính chất các lectin có biểu hiện tƣơng tác đặc hiệu với vi khuẩn, bƣớc đầu xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm bằng phản ứng ngƣng kết với lectin.

Những đóng góp mới của luận án: 1. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về các nhóm lectin thực vật gây ngƣng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây bệnh qua đƣờng thực phẩm. Bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình phát hiện và phân biệt 4 vi khuẩn Eschesrichia coli gây bệnh (EPEC), Shigella flexneri, Staphylococcus aureus và Salmonella bằng lectin. Đã đƣa ra đƣợc quy trình tinh chế tách chiết một số lectin có ngƣng kết đặc hiệu với vi khuẩn Eschesrichia coli gây bệnh (EPEC) và vi khuẩn Salmonella.

11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1. Trên Thế giới Theo ƣớc tính của WHO (2008), hàng năm trên Thế giới có khoảng 130 triệu ngƣời mắc bệnh tiêu chảy, trong đó xấp xỉ 70% là do truyền qua đƣờng ăn uống nhƣ ăn phải thực phẩm bị nhiễm bẩn, hóa chất hay vi sinh vât gây bệnh [108]. Cũng theo WHO, hơn 49 nƣớc đang phát triển trung bình có tỷ lệ chết do tiêu chảy ở trẻ em dƣới 5 tuổi là 6,6%, chiếm 36% ca tử vong do mọi nguyên nhân của trẻ em dƣới 5 tuổi. Ở Mỹ, theo thống kê của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh (CDC) thì mỗi năm có khoảng 5% dân số bị ngộ độc trong năm, với khoảng 5000 ngƣời chết [40].

Tại Pháp, hàng năm có khoảng 75 vạn ca ngộ độc thực phẩm (1210 ca/10 vạn dân) trong đó 7 vạn ca cấp cứu trong tình trạng nguy kịch, 113 nghìn ca phải nhập viện [80]. Tại Thái Lan, Ân Độ, Philipin có khoảng 100 ngƣời vào viện hằng ngày do nguyên nhân sử dụng thực phẩm không an toàn. Theo thống kê ở Philipin thì tiêu chảy là một trong 10 nguyên nhân gây bệnh chính với tổng số 19. Đặc biệt năm 2011, một biến chủng E.

coli cực độc đã gây tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm bùng phát tại Đức và một số nƣớc châu Âu khác với 16 ngƣời chết và hơn 1.000 ngƣời mắc bệnh, trong đó gần 400 ngƣời có nguy cơ tử vong. Theo Trung tâm Kiểm soát và Ngăn ngừa dịch bệnh châu Âu (ECDC), đã có 9 trƣờng hợp đƣợc thông báo ở Thụy Điển, 4 ngƣời trong số đó có đi du lịch tới phía bắc nƣớc Đức. Vụ dịch này đã gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp châu Âu khi ECDC thông báo vi khuẩn bị lây nhiễm qua các thực phẩm nhƣ dƣa chuột, cà chua, giá đỗ… 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tại Việt Nam Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 3000 - 5000 nạn nhân nhập viện và 30 - 100 ca tử vong [4].

Nhà nƣớc cũng phải dành một kinh phí rất lớn cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên nhân ngộ độc. Theo cục ATVSTP, năm 2012 số vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra trong toàn quốc có giảm nhẹ so với cuối năm 2010 nhƣng số ngƣời chết và nhập viện có chiều hƣớng tăng cao so với năm 2011 (Bảng 1. Số ngƣời mắc tăng so với năm trƣớc là 54,8%, số ngƣời nhập viện tăng 43,5%, số ngƣời tử vong tăng 53,6%. Số ca mắc ngộ độc thực phẩm tập trung cao nhất ở miền Đông Nam Bộ chiếm 51,91%.

Số tử vong do ngộ độc thực phẩm tập trung nhiều ở các vùng núi phía Bắc chiếm 51,81% [4,107].1 Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam (nguồn: http://vfa.vn/) Năm 2010 2011 2012 Số vụ ngộ độc 175 148 168 Số ca mắc 5664 4700 5541 Số ca tử vong 51 27 34 Số ca nhập viện 3978 3663 4335 Nguyên nhân hàng đầu trong các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Trong số đó, vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao và là nguyên nhân chính gây ra các vụ tiêu chảy hàng loạt (chiếm 33-49%) [2]. Các vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp là Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholerae… Bệnh thƣờng xảy ra do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến, bảo quản nhƣ thức ăn nấu chƣa kĩ, để lâu ở nhiệt độ thƣờng, thực hiện khâu vệ sinh kém…[23]. Salmonella là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc do vi khuẩn, có trong nhiều loại thực phẩm (đồ nguội, thịt nguội, nghêu sò, gà chƣa nấu chín, sản phẩm từ sữa sống…) nhất là các món ăn chế biến từ trứng tƣơi hoặc còn hơi tƣơi sống [40].

Độc tố từ vi sinh vật cũng là một trong các nguyên nhân chiếm 20-30% các vụ ngộ độc thực phẩm tập thể. 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trong số này, vi khuẩn Staphylococcus aureus hiện diện nhiều trong các món ăn làm bằng tay (bánh ngọt), vi khuẩn Clostridium perfringens hay phát sinh trong các món đƣợc nấu, nƣớng và hâm nóng. Ngoài ra, ngộ độc thực phẩm còn có nguyên nhân là do thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất (chiếm11-27%) nhƣ cyanua, asen, các kim loại nặng, benladol, hóa chất bảo quản thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật. 27% số vụ ngộ độc là do ăn phải thực phẩm còn tồn đọng hóa chất hay bị đầu độc qua nƣớc, thức ăn, không khí… 1.