MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi sinh vật đang là một vấn đề nghiêm trọng trên toàn thế giới, ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe cộng đồng và nền kinh tế. Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới (bao gồm cả Việt Nam) xảy ra khoảng 600 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây ra cái chết của khoảng 420.000 người mỗi năm, trong đó số ca ngộ độc do vi sinh vật gây ra chiếm tới 66%. Trong số các tác nhân vi sinh vật, Bacillus cereus là một trong những tác nhân gây hư hỏng thực phẩm phổ biến nhất. Chúng là những vi khuẩn gram dương, hình que, có khả năng hình thành bào tử và sinh độc tố gây ngộ độc với hai thể bệnh là thể tiêu chảy và thể gây nôn.
cereus có mặt trong bùn đất, nước thải và các loại thực phẩm như sữa, thịt, rau củ … Hiện nay, một số phương pháp đã được áp dụng trong quá trình bảo quản và chế biến thực phẩm nhằm ức chế vi khuẩn bao gồm các phương pháp xử lý vật lý (nhiệt, áp suất, tia UV …), phương pháp hóa học hay sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên, các phương pháp này có thể làm thay đổi các đặc tính cảm quan và chất lượng của thực phẩm hoặc ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng do dư lượng kháng sinh trong thực phẩm. Do đó việc tìm ra phương pháp mới hiệu quả và an toàn hơn trong bảo quản và chế biến thực phẩm là vấn đề đang rất được quan tâm. Liệu pháp thực khuẩn thể sử dụng các vi rút có khả năng ly giải vi khuẩn (bacteriophage) được xem là liệu pháp hiệu quả do có tính đặc hiệu cao, chi phí thấp, an toàn, thân thiện với môi trường.
Từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn thực khuẩn thể ly giải đặc hiệu Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm” hướng đến mục tiêu sản xuất và ứng dụng dụng thực khuẩn thể để kiểm soát B. Mục đích nghiên cứu: Phân lập và sàng lọc được chủng thực khuẩn thể có khả năng ly giải đặc hiệu với các chủng vi khuẩn Bacillus cereus. Nội dung nghiên cứu: Nội dung 1: Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn thực khuẩn thể có khả năng ly giải các chủng vi khuẩn Bacillus cereus. Nội dung 2: Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sự ổn định thực khuẩn thể.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus cereus B. cereus không chỉ là tác nhân gây hư hỏng thực phẩm mà còn được biết đến rộng rãi với khả năng gây ngộ độc thực phẩm. Các báo cáo hàng năm của Cơ quan An toàn thực phẩm Châu Âu (ESPA) cũng cho thấy B.
cereus là một trong các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm hàng đầu chỉ sau Clostridium botulinum, Salmonella và virus [1]. Trong vòng 5 năm, 2011-2015, có gần 300 vụ bùng phát ngộ độc thực phẩm do B. cereus đã được báo cáo ở các quốc gia Châu Âu [1]. Theo các khảo sát được thực hiện tại Hoa Kỳ, có hơn một triệu ca bệnh liên quan đến thực phẩm mỗi năm là do độc tố vi khuẩn, bao gồm cả B.
Một báo cáo gần đây của Pháp cho rằng B. cereus là một trong những nguyên nhân quan trọng nhất gây ngộ độc thực phẩm tại nước này [2].Tại Trung Quốc, B. cereus được ghi nhận là tác nhân gây bệnh đứng thứ hai với hơn 4000 ca được báo cáo [2]. Tại Việt Nam, ngộ độc thực phẩm đang là một vấn đề nhức nhối, đã có 1.604 vụ ngộ độc được ghi nhận từ năm 2010 đến năm 2020, nguyên nhân gây ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật (chiếm 38,7%), B.
cereus được xem là một trong những nguyên nhân chính [3]. Việc tìm hiểu đặc điểm, cấu trúc của loài vi khuẩn này mang ý nghĩa quan trọng trong việc hỗ trợ tìm phương pháp ngăn ngừa, hạn chế những trường hợp mắc bệnh do B. Phân loại Phân loại quốc tế B. cereus: • Thuộc giới: Bacteria • Ngành (phylum): Firmicutes • Lớp (class): Bacilli • Bộ (order): Bacillales • Họ (family): Bacillaceae • Chi (genus): Bacillus • Loài (species): B.
cereus Thuật ngữ “Bacillus” có nghĩa là “hình que”, trong khi từ “cereus” trong tiếng Latin chỉ sự “giống sáp”, theo đó, kiểu hình của B. cereus có thể dễ dàng nhận biết qua quan sát khuẩn lạc trên đĩa thạch agar hoặc các môi trường chọn lọc khác [4]. Ban đầu, nó được phân lập từ không khí trong một chuồng 3 bò bởi Frankland vào năm 1887 và sau đó được phát hiện bởi Plazikowski vào năm 1906 qua các ca ngộ độc thực phẩm tại Châu Âu [5]. Chi Bacillus được hình thành vào năm 1920 và đã trải qua nhiều thay đổi lớn trong nhiều thập kỉ qua.
Đặc điểm kiểu hình giữa các loài khác nhau là khác nhau, do đó, chúng được sử dụng để phân loại (ví dụ khả năng di chuyển, tán huyết…). Ngoài ra, việc phân loại còn dựa vào đặc điểm sinh hóa, cụ thể là khả năng sản xuất độc tố bệnh than/protein hình nón, protein tinh thể diệt côn trùng và protein synthetase của độc tố gây nôn (cereulide). Những đặc điểm này có thể mất đi, không đồng nhất trong cùng một loài hoặc hiện diện cùng lúc ở nhiều loài, vì vậy, có thể gây khó khăn trong việc phân loại [6]. Đặc điểm hình thái của Bacillus cereus Hình thái tế bào vi khuẩn Vi khuẩn B.
cereus có hình que mảnh thẳng hoặc hơi cong; kích thước tế bào rộng 1,0 – 1,2 µm, dài 3,0 – 5,0 µm, tế bào xuất hiện đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1. Nhiều chủng thuộc B.cereus có khả năng di động nhờ các tiên mao, di chuyển chậm. cereus có khả năng hình thành nội bào tử hình elip hoặc hình trụ mà không làm phồng tế bào; bào tử xuất hiện có màu xanh lục trong tế bào sinh dưỡng màu đỏ qua phương pháp nhuộm bào tế bào Schaeffer-Fulton (Hình 1. Bào tử của B.
cereus có khả năng chống chịu tốt ở các điều kiện môi trường cực đoan như nhiệt độ, tia cực tím, pH hoặc môi trường nghèo dinh dưỡng, cũng như có khả năng đề kháng các hóa chất khử nhiễm, dung dịch ion, ozon. Chính vì khả năng này nên B.cereus được tìm thấy ở hầu hết mọi nơi, nhiều loại môi trường sống, do đó việc ô nhiễm thực phẩm bởi vi khuẩn này là khó có thể tránh khỏi [7]. Tế bào vi khuẩn Bacillus cereus quan sát qua kính hiển vi (Nguồn: Microbiologyinpictures.com) (A) Tế bào quan sát dưới kính hiển vi (B) Tế bào được nhuộm bào tử bằng phương pháp Schaeffer-Fulton Hình thái khuẩn lạc Là loại vi khuẩn dễ phát triển trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường: B. cereus có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ rất rộng từ 10 - 48℃, tối ưu nhất là 28 - 35℃.
Độ pH từ 4,9 – 9,3, tối ưu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 7 - 7,2 và hoạt độ nước từ 0,92 đến 1,0.cereus hình thành khuẩn lạc lớn (3 – 8 mm), màu xám, bề mặt phẳng, thường có rìa gồ ghề, vòng tan huyết β xung quang khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cừu (Hình 1.2A); trên môi trường MYPA (Mannitol-Egg Yolk- Polymyxin đỏ), B.cereus có khuẩn lạc nhỏ (2 – 3 mm), rìa răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vòng đục do thủy phân lecithin lòng đỏ trứng (Hình 1. Hình thái khuẩn lạc B. cereus trên môi trường thạch máu cừu (B) B. cereus trên môi trường MYPA 5 Đặc điểm sinh hóa Để phân biệt B.
cereus với các vi khuẩn trong Bacillus nhóm 1(B. thuringiensis …) dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm được trình bày trong bảng sau: Bảng 1. Đặc điểm sinh hóa của B. cereus so sánh với các loài Bacillus khác có họ hàng gần Đặc tính Loài B.
thuringiensis Kỵ khí + + + Sinh Catalase + + + Thủy phân Casein + + + Khử Nitrate + + + Phản ứng Voges – + + + Proskauer Sinh trưởng ở NaCl 7% + + + Sinh trưởng ở 60℃ - - - Sử dụng glucose + + + Di động +* - +* Tán huyết trên thạch +* - +* máu cừu Kháng kháng sinh β- +* - +* lactam Tạo tinh thể protein độc - - + Chú thích: + phản ứng dương tính; +* hơn 95% chủng có phản ứng dương tính; - phản ứng âm tính. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus B. cereus được xác nhận là sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa vào năm 1947 khi nhiều người bị tiêu chảy phải nhập viện tại Na Uy sau khi ăn sốt vani [8]. 20 năm sau, dạng bệnh nôn mửa được mô tả khi có các trường hợp ngộ độc thực phẩm xuất hiện ở Anh sau khi ăn cơm chín.
Đó cũng là lần đầu tiên người ta công nhận rằng B. cereus tạo ra ít nhất hai loại độc tố khác nhau là nguyên nhân gây ra tiêu chảy hoặc nôn [9]. Tại Nhật Bản, tổng số có 5.141 vụ ngộ độc thực phẩm đã xảy ra giữa năm 1982 và 1986; trong số đó, số vụ 6 gây ra bởi nhiễm vi sinh vật là 3. cereus gây ra 73 vụ.
Trong khoảng thời gian 10 năm, năm 1986 đến năm 1995, đã diễn ra 852 vụ bùng phát ngộ độc thực phẩm, 26.173 ca mắc bệnh và 20 ca tử vong được báo cáo ở Đài Loan. Trong số các ca bệnh này có 555 trường hợp (chiếm 65% số ca mắc) là ngộ độc do nhiễm vi sinh vật. Loại vi khuẩn gây bệnh thứ ba trong số những vụ ngộ độc này là B. Khi tóm tắt dữ liệu về các bệnh do tiêu dùng thực phẩm và sản phẩm thịt của Trung Quốc từ năm 1991 đến năm 1994 của Cơ quan Thanh tra Thực phẩm khu vực Hà Lan, Simone và cộng sự (1997) đã báo cáo 2.621 vụ ngộ độc, trong đó có 7.567 người bị bệnh.
Trong số các tác nhân gây bệnh đã biết, B. cereus ở mức cao nhất, chiếm 19% [10]. Theo báo cáo mới nhất của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (2007) về sự bùng phát dịch bệnh, B. cereus là tác nhân gây ra 77 vụ dịch và gây ra 17,1% trường hợp do độc tố vi khuẩn.
Tại Việt Nam, việc ngộ độc do B. cereus đã không còn mới lạ. Tháng 1 năm 2021, vụ ngộ độc tập thể do B. cereus gây ra tại một khu công nghệ thuộc tỉnh Phú Yên đã khiến 80 công nhân phải nhập viện điều trị, đây chỉ là một trong vô số những ca ngộ độc thực phẩm xảy ra tại Việt Nam nguyên nhân từ loại vi khuẩn gây bệnh này.
Phần lớn các ca ngộ độc thực phẩm do B.cereus không được báo cáo. Nguyên nhân là do triệu chứng bệnh ngắn và nhẹ nên các bệnh nhân thường không đi khám. Hơn nữa, các trường hợp ngộ độc do B.