Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới và thống kê từ GLOBOCAN năm 2018, ung thư phổi là một trong những bệnh lý ác tính có tỷ lệ mắc mới và tử vong cao nhất toàn cầu, với khoảng 2,1 triệu ca mắc mới (chiếm 11,6% tổng số ca ung thư) và hơn 1,76 triệu trường hợp tử vong (chiếm 18,4% tổng số tử vong do ung thư). Tại Việt Nam trong cùng năm, số liệu dịch tễ học ghi nhận 23.667 ca mắc mới và 20.710 ca tử vong, trung bình mỗi ngày có khoảng 60 người phát hiện mắc bệnh. Vấn đề nan giải hàng đầu hiện nay là hơn 84,3% bệnh nhân ung thư phổi tại các bệnh viện lớn được chẩn đoán ở giai đoạn muộn (giai đoạn III và IV). Ở các giai đoạn tiến triển này, tỷ lệ sống sót sau 5 năm chỉ dao động trong khoảng 5% đến 30%, trong khi nếu được phát hiện ở giai đoạn sớm (giai đoạn I và II), cơ hội sống sót sau 5 năm có thể đạt tới 60%.

Trước thực trạng các phương pháp chẩn đoán hình ảnh như chụp X-quang, cắt lớp vi tính (CT) hay sinh thiết mô xâm lấn còn bộc lộ nhiều hạn chế về độ đặc hiệu và nguy cơ tai biến, nghiên cứu biến đổi ngoại gen (epigenetics) mở ra hướng tiếp cận mang tính đột phá. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm với đề tài "Phân tích sự methyl hóa gen SHOX2 ở bệnh ung thư phổi" được thực hiện nhằm mục tiêu phát hiện, định lượng mức độ methyl hóa promoter gen SHOX2 và đánh giá độ chính xác chẩn đoán của dấu ấn này trên bệnh nhân Việt Nam. Nghiên cứu tiến hành khảo sát trên 127 mẫu mô đúc khối paraffin (FFPE) thu thập từ tháng 2/2014 đến tháng 2/2017 tại Bệnh viện Quân Y 175 và 42 mẫu huyết tương thu thập từ tháng 3/2017 đến tháng 3/2018 tại Bệnh viện Quân Y 103. Kết quả đề tài cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy với độ đặc hiệu chẩn đoán đạt trên 90%, góp phần đặt nền móng cho việc ứng dụng sinh thiết lỏng và công nghệ PCR định lượng đặc hiệu methyl trong sàng lọc sớm ung thư phổi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng của lý thuyết di truyền ngoại gen (Epigenetics) và mô hình biến đổi sinh học phân tử trong quá trình hình thành khối u ác tính. Quá trình methyl hóa DNA là một cơ chế ngoại gen phổ biến ở động vật có vú, diễn ra khi gốc methyl (-CH3) được gắn vào vị trí carbon số 5 của vòng cytosine đứng trước guanine (tạo thành 5-methylcytosine) dưới sự xúc tác của các enzyme DNA methyltransferase (bao gồm DNMT1, DNMT3A, DNMT3B). Hiện tượng methyl hóa quá mức (hypermethylation) thường xảy ra tại các đảo CpG có kích thước từ 1 đến 2 kb nằm ở vùng promoter, dẫn đến việc đóng xoắn chất nhiễm sắc và làm câm (silencing) các gen ức chế khối u quan trọng.

Bên cạnh đó, nghiên cứu ứng dụng lý thuyết về DNA tự do tuần hoàn (ccfDNA) và DNA tuần hoàn có nguồn gốc từ khối u (ctDNA). ccfDNA tồn tại tự do trong huyết tương với nồng độ từ 0 đến 100 ng/ml ở người bình thường (trung bình khoảng 30 ng/ml) và tăng vọt lên mức 0 đến 1000 ng/ml (trung bình 180 ng/ml) ở bệnh nhân ung thư do hiện tượng tế bào chết theo chương trình (apoptosis) tạo ra các đoạn DNA kích thước 166-200 bp hoặc do hoại tử tế bào (necrosis). Locus gen SHOX2 (Short stature homeobox 2) nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 3 (3q25-q26), có kích thước khoảng 10 kb, sở hữu hai đảo CpG lớn ở đầu 5' (kích thước 1,0 kb) và đầu 3' (kích thước 0,5 kb). Sự methyl hóa quá mức tại đảo CpG đầu 5' của SHOX2 đóng vai trò điều hòa tiêu cực các yếu tố phiên mã, liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của tế bào ung thư phổi. Để định lượng mức độ methyl hóa, kỹ thuật xử lý natri bisulfite được ứng dụng nhằm chuyển đổi có chọn lọc các cytosine không methyl hóa thành uracil, trong khi các 5-methylcytosine được bảo toàn nguyên vẹn.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng thiết kế thực nghiệm bệnh - chứng với cỡ mẫu bao gồm 127 mẫu mô FFPE (gồm 76 mẫu ung thư phổi giai đoạn III-IV và 51 mẫu bệnh phổi lành tính) cùng 42 mẫu huyết tương (gồm 20 mẫu ung thư phổi giai đoạn III-IV thể tích 1-4 ml và 22 mẫu đối chứng khỏe mạnh). Phương pháp chọn mẫu tập trung vào các bệnh nhân giai đoạn tiến triển (tỷ lệ bệnh nhân trên 55 tuổi chiếm 73,68% ở nhóm mô và 65,00% ở nhóm huyết tương) nhằm tối ưu hóa việc phát hiện nồng độ DNA methyl hóa trong giai đoạn hoàn thiện quy trình kỹ thuật.

Quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các giai đoạn: tách chiết DNA tổng số từ mô FFPE bằng kit QIAamp DNA FFPE và tách ccfDNA huyết tương bằng kit QIAamp Circulating Nucleic Acid; biến đổi hóa học DNA bằng bộ kit EpiTect Bisulfite; chuẩn bị hệ mẫu chuẩn plasmid dạng thẳng thông qua kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR) với cặp mồi ScaI đặc hiệu, đạt nồng độ tinh sạch trên 20 ng/µl và tỷ số A260/A280 đạt 1,8 đến 2,0. Phân tích định lượng tương đối được thực hiện bằng kỹ thuật PCR định lượng đặc hiệu methyl (qMSP) trên hệ thống Realtime PCR sử dụng hóa chất huỳnh quang SYBR Green Master Mix 2X. Cặp mồi Un-SHOX2-F/R (kích thước sản phẩm 219 bp) không chứa dinucleotide CpG được dùng làm gen tham chiếu đại diện cho tổng lượng DNA sau xử lý bisulfite, trong khi cặp mồi Me-SHOX2-F/R (kích thước sản phẩm 127 bp) đóng vai trò gen đích. Lý do lựa chọn qMSP là nhờ độ nhạy phát hiện cao (phát hiện được mẫu chuẩn ở nồng độ thấp tới 10 copies/µl), khả năng chuẩn hóa tự động qua chu kỳ ngưỡng Ct và chi phí tối ưu hơn nhiều so với kỹ thuật giải trình tự gen bisulfite. Toàn bộ dữ liệu được phân tích bằng kiểm định phi tham số Mann-Whitney, kiểm định Fisher's exact và xây dựng đường cong đặc trưng hoạt động máy thu (ROC) với khoảng tin cậy 95% CI trên phần mềm GraphPad Prism 7 trong suốt timeline nghiên cứu từ năm 2017 đến năm 2019.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phát hiện thứ nhất: Hiệu suất tách chiết và chất lượng DNA từ các nguồn bệnh phẩm đạt tiêu chuẩn cao cho các phản ứng khuếch đại phân tử. DNA tổng số tách từ 6 đến 8 lát cắt mô FFPE đạt nồng độ trung bình 153,49 ng/µl, khuếch đại thành công đoạn gen đích 232 bp trên gel agarose 2%. Đối với hệ thống mẫu chuẩn, phương pháp PCR đảo tạo plasmid dạng thẳng (Me-Shox 3061 bp và Un-Shox 3105 bp) đạt hiệu quả vượt trội so với cắt enzyme giới hạn ScaI, với hệ số tương quan tuyến tính R2 ≥ 0,99 và giá trị tuyệt đối độ dốc đồ thị delta Ct giữa gen đích và gen tham chiếu chỉ là 0,038 (nhỏ hơn nhiều so với ngưỡng giới hạn 0,1), thỏa mãn hoàn hảo điều kiện ứng dụng công thức delta-delta-Ct (2^-ΔΔCt) của Livak.

Phát hiện thứ hai: Mức độ methyl hóa gen SHOX2 ở nhóm ung thư phổi tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng lành tính (giá trị p < 0,001). Trên mẫu mô FFPE, tỷ lệ methyl hóa ở nhóm ung thư phổi đạt giá trị trung bình vượt trội so với nhóm bệnh phổi lành tính. Khi thiết lập ngưỡng cut-off phân định dựa trên chỉ số Youden và tỷ lệ dương tính giả không quá 5%, phân tích methyl hóa SHOX2 trên mẫu mô FFPE đạt độ nhạy trên 80% và độ đặc hiệu đạt trên 95%, với diện tích dưới đường cong ROC (AUC) đạt giá trị ấn tượng trên 0,90 (khoảng tin cậy 95% CI: 0,85 - 0,96).

Phát hiện thứ ba: Trên mẫu sinh thiết lỏng ccfDNA từ huyết tương, dấu ấn methyl hóa SHOX2 thể hiện tiềm năng chẩn đoán rõ rệt với độ nhạy đạt 65,00% (13/20 mẫu) và độ đặc hiệu đạt 90,91% (20/22 mẫu đối chứng âm tính), giá trị diện tích dưới đường cong AUC đạt trên 0,80. Sự chênh lệch tỷ lệ phát hiện giữa các giai đoạn bệnh được ghi nhận với độ nhạy ở giai đoạn IV đạt 80,00%, cao hơn so với mức 60,00% ở giai đoạn III.

Phát hiện thứ tư: Khảo sát hiện tượng nhiễm DNA ngoại lai từ tế bào bạch cầu trên 8 mẫu ccfDNA ngẫu nhiên bằng phản ứng PCR khuếch đại các đoạn 250 bp và 580 bp trên gel polyacrylamide 8% đã cho thấy sự xuất hiện của các băng DNA kích thước lớn. Điều này chứng minh quá trình thu nhận và bảo quản mẫu huyết tương thông thường có thể làm ly giải một phần bạch cầu, giải phóng DNA tổng số vào dịch tuần hoàn.

Thảo luận kết quả

Khi xem xét dữ liệu nghiên cứu, các kết quả phân tích định lượng mức độ methyl hóa được mô tả rất trực quan thông qua đồ thị đường cong ROC và biểu đồ phân tán giá trị delta-delta-Ct. Biểu đồ đường cong ROC cho thấy đường biểu diễn độ nhạy theo (1 - độ đặc hiệu) tiệm cận góc trên bên trái, minh chứng cho độ chính xác cao của xét nghiệm. Đồng thời, bảng đối chiếu các giá trị cut-off khác nhau chỉ ra rằng việc lựa chọn điểm cắt tối ưu giúp kiểm soát tỷ lệ dương tính giả của nhóm chứng ở mức dưới 5%, đảm bảo độ tin cậy tuyệt đối khi áp dụng vào sàng lọc lâm sàng.

Về mặt cơ chế phân tử, hiện tượng methyl hóa promoter gen SHOX2 làm suy giảm sự gắn kết của các yếu tố phiên mã, dẫn đến ức chế phiên mã gen SHOX2. Sự bất hoạt này tác động dây chuyền tới các con đường tín hiệu điều hòa chu kỳ tế bào và ức chế biệt hóa, tạo điều kiện cho tế bào biểu mô phế quản tăng sinh mất kiểm soát. Kết quả đạt được trong nghiên cứu này hoàn toàn tương đồng với các công bố quốc tế. Nghiên cứu của các tác giả trên thế giới từng ghi nhận độ nhạy 67,6% trên dịch rửa phế quản và độ nhạy khoảng 60% đến 68% trên mẫu huyết tương với độ đặc hiệu luôn duy trì trên 90%. Độ nhạy trên mẫu huyết tương (65,00%) thấp hơn so với mẫu mô FFPE (trên 80%) là điều hoàn toàn hợp lý trong sinh học khối u, bởi lẽ lượng ctDNA giải phóng vào hệ tuần hoàn chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ (thường dưới 1% tổng lượng ccfDNA) và bị phân mảnh mạnh mẽ. Hơn nữa, sự hiện diện của các đoạn DNA 250 bp và 580 bp từ bạch cầu bị vỡ đã làm tăng nền DNA không methyl hóa, làm giảm nhẹ độ nhạy khuếch đại của phản ứng qMSP trên mẫu lỏng.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng của dấu ấn methyl hóa gen SHOX2 trong chẩn đoán và điều trị ung thư phổi, nghiên cứu đề xuất 4 nhóm giải pháp trọng tâm:

  1. Chuẩn hóa quy trình thu thập và tiền xử lý mẫu sinh thiết lỏng: Đề nghị các cơ sở y tế chuyển đổi sang sử dụng ống lấy máu chuyên dụng chứa chất bảo quản tế bào (như ống Cell-Free DNA BCT) và áp dụng quy trình ly tâm hai bước tốc độ thấp (1.000 - 3.000 g trong 10-15 phút) nhằm hạ tỷ lệ vỡ bạch cầu xuống dưới 3%, hoàn thành xây dựng hướng dẫn chuẩn trong vòng 6 tháng tới do các phòng xét nghiệm huyết học và sinh học phân tử phụ trách.
  2. Mở rộng thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm trên cỡ mẫu lớn: Triển khai thu thập tối thiểu 300 mẫu bệnh phẩm ung thư phổi giai đoạn sớm (giai đoạn I và II) tại 3 bệnh viện chuyên khoa tuyến trung ương trong thời gian 18 đến 24 tháng, nhằm tinh chỉnh giá trị điểm cắt cut-off và nâng diện tích dưới đường cong AUC trên huyết tương đạt trên 0,88. Chủ thể thực hiện là các nhóm nghiên cứu phối hợp giữa trường đại học và bệnh viện ung bướu.
  3. Tích hợp mô hình đa dấu ấn sinh học phân tử (Panel Biomarkers): Thiết kế phản ứng Multiplex Realtime PCR kết hợp định lượng methyl hóa gen SHOX2 cùng với gen PTGER4 hoặc RASSF1A và các đột biến EGFR, hướng tới mục tiêu nâng độ nhạy chẩn đoán toàn diện trên mẫu huyết tương từ 65% lên trên 85% trong lộ trình 2 năm, do các viện nghiên cứu công nghệ sinh học y dược chủ trì.
  4. Đẩy mạnh sản xuất và thương mại hóa kit xét nghiệm chẩn đoán nội địa: Hoàn thiện hồ sơ sở hữu trí tuệ và chuyển giao công nghệ quy trình qMSP cho các doanh nghiệp dược phẩm, phấn đấu đưa bộ kit chẩn đoán SHOX2 đạt tiêu chuẩn ISO 13485 vào phục vụ lâm sàng trong vòng 12 đến 18 tháng, giúp giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân tại Việt Nam từ 40% đến 50% so với kit nhập khẩu từ châu Âu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và học viên sau đại học chuyên ngành Sinh học phân tử, Di truyền học: Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình thiết kế cặp mồi đặc hiệu bisulfite, kỹ thuật PCR đảo tạo plasmid chuẩn thẳng và phương pháp tính toán định lượng tương đối delta-delta-Ct chuẩn xác, phục vụ trực tiếp cho các đề tài nghiên cứu về biến đổi ngoại gen và sinh học ung thư.
  2. Bác sĩ lâm sàng chuyên khoa Ung bướu, Hô hấp và Chẩn đoán hình ảnh: Tài liệu là nguồn tham khảo giá trị giúp bác sĩ hiểu rõ cơ chế phân tử và độ tin cậy của dấu ấn SHOX2, hỗ trợ chỉ định cận lâm sàng trong các ca bệnh khó sinh thiết mô hoặc có hình ảnh tổn thương mờ nhạt trên phim CT lồng ngực.
  3. Kỹ thuật viên xét nghiệm y sinh tại các bệnh viện và trung tâm xét nghiệm: Cung cấp tài liệu đào tạo thực hành chi tiết về quy trình kiểm soát chất lượng mẫu mô FFPE, kỹ thuật chiết tách ccfDNA huyết tương và các biện pháp loại bỏ nguy cơ dương tính giả do primer-dimer hoặc tạp nhiễm DNA bạch cầu.
  4. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và nhà hoạch định chính sách y tế: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm trên người Việt Nam để định hướng đầu tư phát triển các bộ kit chẩn đoán sinh thiết lỏng "Made in Vietnam", góp phần xây dựng chiến lược sàng lọc sớm ung thư phổi ở cấp độ y tế dự phòng cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao hiện tượng methyl hóa gen SHOX2 lại có giá trị chẩn đoán cao trong ung thư phổi? Sự methyl hóa quá mức tại đảo CpG promoter của gen SHOX2 xảy ra rất phổ biến ở các tế bào biểu mô ung thư phổi nhưng lại có tần suất rất thấp ở các mô phổi lành tính. Hiện tượng biến đổi ngoại gen này xuất hiện từ giai đoạn rất sớm của quá trình sinh u, do đó việc phát hiện SHOX2 methyl hóa cho phép phân biệt tổn thương ác tính với độ đặc hiệu lâm sàng cao vượt trội trên 90%.

  2. Kỹ thuật sinh thiết lỏng qua ccfDNA huyết tương có những ưu điểm gì so với sinh thiết mô truyền thống? Sinh thiết lỏng qua tách chiết ccfDNA từ 1 đến 4 ml huyết tương là phương pháp không xâm lấn, loại bỏ hoàn toàn các tai biến lâm sàng nguy hiểm như tràn khí màng phổi hoặc chảy máu do sinh thiết kim. Phương pháp này khắc phục được tính không đồng nhất của khối u, cho phép theo dõi động học đáp ứng điều trị và lấy mẫu lặp lại nhiều lần ở những bệnh nhân không thể phẫu thuật.

  3. Tại sao bắt buộc phải chuyển đổi plasmid chuẩn sang dạng mạch thẳng trong định lượng Realtime PCR? Các plasmid tái tổ hợp khi nhân dòng trong vi khuẩn thường tồn tại ở dạng siêu xoắn hoặc vòng tròn khép kín, gây cản trở không gian đối với sự bắt cặp của cặp mồi và làm giảm hiệu suất kéo dài của enzyme Taq polymerase. Việc sử dụng kỹ thuật PCR đảo để đưa plasmid về dạng thẳng giúp hiệu suất khuếch đại đạt mức lý tưởng 95% đến 100%, đảm bảo độ dốc chuẩn hóa tuyệt đối cho phương pháp Livak.

  4. Sự tạp nhiễm DNA từ tế bào bạch cầu ảnh hưởng như thế nào đến kết quả phân tích ccfDNA? Khi tế bào bạch cầu bị vỡ trong quá trình lấy mẫu và bảo quản máu, một lượng lớn DNA nhân không bị methyl hóa (kích thước lớn 250 bp đến 580 bp) sẽ giải phóng vào huyết tương. Lượng DNA này làm tăng nền DNA không methyl hóa, dẫn đến hiện tượng pha loãng nồng độ ctDNA đích và làm giảm độ nhạy phát hiện của phản ứng realtime PCR.

  5. Điều kiện tiên quyết để áp dụng công thức tính toán delta-delta-Ct của Livak trong nghiên cứu này là gì? Phương pháp delta-delta-Ct yêu cầu hiệu suất khuếch đại của gen đích (Me-SHOX2) và gen tham chiếu (Un-SHOX2) phải tương đương nhau, với độ chênh lệch hiệu suất không vượt quá 5%. Trong nghiên cứu này, giá trị tuyệt đối độ dốc đồ thị delta Ct theo nồng độ đạt mức 0,038 (nhỏ hơn nhiều so với giới hạn 0,1), chứng minh hai phản ứng có hiệu suất khuếch đại tương đương và đủ điều kiện định lượng chính xác.

Kết luận

  • Luận văn đã thiết lập và chuẩn hóa thành công quy trình phân tích định lượng mức độ methyl hóa gen SHOX2 bằng kỹ thuật qMSP trên cả hai hệ mẫu mô FFPE và ccfDNA huyết tương với độ tin cậy khoa học cao.
  • Phương pháp PCR đảo được hoàn thiện xuất sắc để tạo plasmid chuẩn dạng thẳng (Me-Shox và Un-Shox), đạt độ dốc chênh lệch delta Ct là 0,038, đáp ứng hoàn hảo yêu cầu của mô hình định lượng tương đối 2^-ΔΔCt.
  • Kết quả thực nghiệm khẳng định dấu ấn methyl hóa SHOX2 đạt độ nhạy trên 80% và độ đặc hiệu trên 95% trên mẫu mô FFPE (AUC > 0,90), đồng thời đạt độ nhạy 65,00% và độ đặc hiệu 90,91% trên mẫu huyết tương.
  • Nghiên cứu phát hiện hiện tượng giải phóng DNA bạch cầu kích thước 250 bp và 580 bp vào ccfDNA, qua đó đề xuất các giải pháp kỹ thuật chuẩn hóa quy trình ly tâm và bảo quản mẫu sinh thiết lỏng.
  • Trong giai đoạn tiếp theo từ năm 2024 đến năm 2026, các cơ sở nghiên cứu và bệnh viện cần nhanh chóng mở rộng cỡ mẫu sàng lọc giai đoạn sớm, phát triển panel đa dấu ấn phân tử và đẩy mạnh sản xuất kit chẩn đoán nội địa nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện sớm ung thư phổi tại Việt Nam.