MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Phospho là nguyên tố đa lượng quan trọng của thực vật, chiếm khoảng 0,2% trọng lượng khô của cây. Nó tham gia cấu tạo nên các thành phần của tế bào như: axit nucleic, phospholipid và ATP (Adenosin Triphosphat). Do đó, thực vật không thể sinh trưởng, phát triển nếu không có nguồn cung cấp chất dinh dưỡng phospho thích hợp.
Axit phytic (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate) và các muối cation hỗn hợp của axit phytic, được gọi là phytate, là một nhóm các hợp chất phospho hữu cơ được tìm thấy rộng rãi trong thiên nhiên. Trong các hệ sinh thái trên cạn, chúng được thực vật tổng hợp, tích lũy trong hạt trong thời kỳ chín và được coi là dạng dự trữ chính của cả phosphat và inositol trong hạt và ngũ cốc thực vật. Axit phytic và phytate rất được quan tâm, nó là nguồn cung cấp phospho cho thực vật [32]. Các dạng phytate khác nhau tồn tại dưới dạng đất sét hoặc kết tủa dưới dạng các muối sắt, muối nhôm có tính axit hoặc các muối canxi không hoà tan trong đất.
Hơn nữa, phytate có khả năng tạo phức với các ion kim loại cần thiết cho độ phì của đất nên có ảnh hưởng xấu đến sự tăng trưởng của thực vật [33]. Chuyển hóa các dạng phospho vô cơ không hòa tan thành dạng mà thực vật có thể hấp thu được là nhờ vi khuẩn phân giải phosphat. Các dạng phospho hữu cơ, đặc biệt là phytate thì phải được khoáng hóa bởi phytase (myo-inositol hexakisphosphat phosphohydrolase) để có phospho cho cây trồng, quá trình này cần có sự tham gia của vi khuẩn sản sinh phytase. Vi sinh vật (VSV) phân giải axit phytic và phytate có mặt ở khắp nơi trong đất và đóng một vai trò quan trọng trong chu trình phospho trong tự 2 nhiên [29].
Do đó, việc sử dụng chúng làm phân bón sinh học hoặc chất kiểm soát để cải thiện nông nghiệp đã là vấn đề trọng tâm của nhiều nhà nghiên cứu. Các chế phẩm vi khuẩn đã được sử dụng để tăng năng suất cây trồng ở một số quốc gia và là sản phẩm thương mại. Một số vi khuẩn có khả năng thúc đẩy sự sinh trưởng ở thực vật và là tác nhân kiểm soát sinh học, nhưng trong hầu hết các trường hợp, những khó khăn trong việc thu được các công thức nghiên cứu và chưa tìm ra các nguyên tắc hoạt động của chúng một cách đầy đủ. Điều đó đã cản trở việc sử dụng mục đích thương mại của chúng [16].
Phytase là enzyme có tác dụng thủy phân phytate tạo thành phospho và myo-inositol, vì thế có thể sử dụng phytase để thay thế các chất bổ sung phosphate hiện có. Phytase còn góp phần giúp cho cây có thể hấp thụ nguồn nitơ và kali tốt hơn, và được xem như một nguồn thay thế phân bón hóa học [35]. Ngoài ra, phytase còn được sử dụng làm chất phụ gia thức ăn, ứng dụng trong y tế như: phòng ngừa các biến chứng bệnh tiểu đường, chống viêm và chống ung thư thông qua sự hình thành các phosphate myo-inositol. Hơn nữa, phytase cũng đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy, xử lí bã thải sắn, nâng cao giá trị sử dụng, giá trị kinh tế cho bã thải sắn và hạn chế ô nhiễm môi trường do quá trình sản xuất tinh bột sắn gây ra [6].
Xuất phát từ các vấn đề thực tiễn nêu trên, tôi đã chọn thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phân lập vi sinh vật sản xuất phytase trong đất tại huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên”. Nghiên cứu này được thực hiện với các mục tiêu là phân lập vi khuẩn sản xuất phytase và tối ưu hóa sản xuất phytase trên các thông số khác nhau làm cơ sở để tạo chế phẩm sinh học từ các chủng VSV sản xuất phytase. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập vi khuẩn sản xuất phytase và tối ưu hóa sản xuất phytase 3 trên các thông số khác nhau làm cơ sở để tạo chế phẩm sinh học từ các chủng VSV sản xuất phytase. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.
Đối tượng nghiên cứu Các chủng VSV có khả năng sản xuất enzyme phytase được phân lập ở các địa điểm đất trồng cây nông nghiệp và đất có hoạt động chăn nuôi gia súc, gia cầm tại địa bàn huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên. Phạm vi nghiên cứu - Lấy các mẫu đất trồng lúa, trồng rau laghim và đất có hoạt động chăn nuôi lợn, nuôi gà, nuôi vịt tại huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên; - Nghiên cứu sự phân bố của các chủng VSV sản xuất phytase; - Phân lập, đánh giá hoạt tính enzyme và tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sản xuất phytase mạnh; - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tối ưu cho chủng VSV sinh phytase ngoại bào; - Ứng dụng dịch nuôi cấy của các chủng VSV tuyển chọn đến giai đoạn đầu của sự sinh trưởng và phát triển ở cây lúa (Oryza stativa L). Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu sự phân bố của VSV sản xuất phytase trên đất trồng lúa, trồng laghim và đất có hoạt động chăn nuôi lợn, nuôi gà, nuôi vịt tại huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên. - Phân lập, tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sản xuất phytase mạnh trên môi trường đất trồng lúa, trồng rau laghim và đất có hoạt động chăn nuôi lợn, nuôi gà, nuôi vịt tại huyện Phú Hòa, tỉnh Phú Yên.
4 - Bước đầu nghiên cứu ứng dụng sinh khối nuôi cấy các chủng VSV sản xuất phytase mạnh và thử nghiệm trên giai đoạn đầu phát triển của cây lúa. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài sẽ bổ sung cho các nghiên cứu trước về sự phân bố của các chủng VSV sản sinh phytase. Ý nghĩa thực tiễn Các chủng VSV phân lập sẽ là nguồn nguyên liệu để ứng dụng tạo chế phẩm sinh học thay thế phân bón hóa học bổ sung phospho cho cây trồng tại địa phương một cách hợp lí.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về enzyme phytase 1. Khái niệm Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases) là một loại phosphatase xúc tác quá trình thủy phân phytate thành myo-inositol, inositol phosphate và phosphat vô cơ [29]. Công thức hóa học axit phytic: C6H18O24P6 Trọng lượng phân tử: 660.
Công thức hóa học axit phytic 1. Khối lượng phân tử Phytase của vi khuẩn có khối lượng phân tử biến thiên từ 35-50 kDa (trừ phytase từ vi khuẩn Klebsiella aerogenes có 2 dạng phân tử cảm ứng). Phytase từ eukaryote như nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thường được glycosyl hóa và có khối lượng phân tử cao hơn. Đối với phytase của nấm sợi nằm trong khoảng từ 85-150 kDa.
Đối với phytase của nấm men khoảng 500 kDa. Đối với phytase của thực vật và động vật nằm trong khoảng từ 50-150 kDa [5]. Phân loại Hiện nay, phytase được phân loại như sau: - Dựa vào vị trí carbon trong vòng myo-inositol của quá trình dephosphoryl hóa phytate được bắt đầu, phytase được phân thành 3 nhóm chính là: nhóm 3-phytase (EC 3.72) và 6-phytase (EC 3. - Dựa trên pH hoạt động tối ưu, phytase được phân thành 2 nhóm chính: phytase axit và phytase kiềm [37].
- Dựa vào cấu trúc, phytase được phân thành 4 phân nhóm chính là: histidine axit phosphatase (HAPhy), β-propeller phytase (BPPhy), protein tyrosine phosphatase (PTP)-like phytase (PTPhy) và purple axit phosphatase (PAPhy) [50]. Hình mô phỏng cấu trúc các dạng phytase 1. Cơ chế hoạt động của enzyme phytase Enzyme phytase tham gia thủy phân phytate thành inositol, phosphat 7 và các nguyên tố hóa trị hai khác (Hình 1. Enzyme phytase xúc tác quá trình chuyển đổi lần lượt các nhóm phosphat có trong axit phytic để tạo ra các tiền chất IP5, IP4, IP3, IP2 và IP1, với inositol và axit phosphoric là các sản phẩm cuối cùng.
Các nguồn enzyme phytase khác nhau có các quá trình xúc tác khác nhau. Tuy nhiên, trong điều kiện invivo, quá trình thủy phân sẽ không hoàn toàn và tạo ra hỗn hợp các este inositol-phosphate [55]. Sơ đồ biểu diễn quá trình thủy phân phytate Phytase phân cắt các liên kết phosphoester (đường màu đỏ) để giải phóng các nhóm phosphate, myo-inositol, các ion kim loại và các protein liên kết 1. Hoạt tính phytase Hoạt tính của phytase thường được đo bằng lượng phosphat vô cơ được giải phóng ra trên 1 phút từ một chất nền đã chọn trong điều kiện pH và nhiệt độ nhất định.
Cũng giống như các enzyme khác, hoạt động hoặc chức năng của phytase bị ảnh hưởng bởi các đặc tính vốn có của enzyme và các điều kiện hoạt động. Các đặc tính sau của phytase có ý nghĩa thực tế: * Tính đặc hiệu của cơ chất Đã có nghiên cứu chuyên sâu về tính đặc hiệu của cơ chất và ái lực 8 của các phytase khác nhau [26],[54]. coli, Bacillus sp.) dường như có ái lực cao với axit phytic, trong khi phytases thực vật và một số enzyme nấm thay đổi enzyme từ A. fumigatus có tính đặc hiệu cơ chất rộng hơn và có khả năng khử phân loại các phosphat inositol thấp hơn [54].
* pH và nhiệt độ tối ưu Hầu hết các phytase được phân lập có pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 4,5-6, nhưng phytases từ Bacillus sp. pH tối ưu là trung tính hoặc kiềm [17] hay pH của A. niger phytase (phyA) là 2,5 và 5,5 và sẽ giảm hoạt động giữa hai điểm này [42] Nhiệt độ tối ưu của hầu hết các phytase thực vật và VSV nằm trong khoảng từ 45 đến 60°C. Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu của này lại ngăn cản hoàn toàn hoạt động của phytase trong dạ dày của bò, ở gia cầm, ở cá thì thấp hơn, nằm trong khoảng 37-40°C.
* Tính ổn nhiệt Vì thức ăn thương mại thường được đóng viên, một quy trình sử dụng nhiệt độ cao (60-80°C) và hơi nước, tất cả các enzyme thức ăn cần phải ổn định nhiệt để tránh mất hoạt tính đáng kể trong quá trình này. Một nhược điểm chính của các enzyme ổn định nhiệt là hoạt tính cụ thể của chúng thường thấp ở nhiệt độ môi trường xung quanh, điều này có liên quan đến độ cứng và do đó làm giảm tính linh hoạt của protein. Lớp phủ hóa học của phytase đã được sử dụng để cải thiện độ bền nhiệt của chúng, nhưng lớp phủ có thể ảnh hưởng đến việc giải phóng và chức năng của các enzyme trong dạ dày. Vì vậy việc phun chế phẩm phytase lỏng cho thức ăn sau khi ép viên có thể làm giảm hoạt tính do quá trình ép viên, nhưng làm tăng chi phí lao động và thiết bị.
Tìm năng ứng dụng của enzyme phytase Phytases được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực, bao gồm: công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi, công nghiệp giấy và bột giấy, trong y học, bảo vệ môi trường, đồng thời thúc đẩy sự tăng trưởng ở thực vật.