MỞ ĐẦU Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lƣợng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay ngƣời ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật và đƣợc ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm nhƣ hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền và có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp. Nhiều enzym đƣợc khai thác từ vi sinh vật đƣợc tập trung nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua nhƣ proteaza, amylaza, cellulaza,….
Những năm sau này ngƣời ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzym khác đó là kitinaza, đây là enzym thủy phân kitin. Kitinaza rất phổ biến trong cuộc sống và đƣợc tìm thấy ở các loài bao gồm vi khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Kitinaza phân huỷ kitin, đó là polysaccarit dồi dào thứ hai trong tự nhiên sau khi xenlulôzơ. Do đó, kitinaza rất quan trọng để duy trì một sự cân bằng giữa cacbon và nitơ bị mắc kẹt trong kitin, dạng không hòa tan.
Vì vậy, kitinaza là công nghệ sinh học lớn đang rất đƣợc giới khoa học quan tâm bởi các lý do: thứ nhất, các enzym này có thể đƣợc sử dụng để chuyển đổi phế liệu giàu kitin thành các sản phẩm hữu ích; thứ hai, có thể khai thác kitinaza dùng cho sự kiểm soát của mầm bệnh nấm và côn trùng; thứ ba, kitinaza chất ức chế khả năng tăng trƣởng có chứa kitin (thực vật) mầm bệnh và côn trùng bệnh dịch hạch cần kitinaza cho sự phát triển bình thƣờng. [12, 19] Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong những nƣớc có điều kiện thiên nhiên ƣu đãi đặc biệt cho ngành nuôi trồng thuỷ sản. Trong những năm qua đã có những Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học phát triển vƣợt bậc và song song với sự phát triển đó, hàng năm các nhà máy chế biến thuỷ sản của nƣớc ta thải ra một lƣợng phế liệu giàu kitin khá lớn. Nguồn phế liệu thuỷ sản này một phần đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc số còn lại chỉ một phần nhỏ sử dụng để sản xuất kitin còn chủ yếu thải ra gây ô nhiễm môi trƣờng.
Vì vậy nghiên cứu công nghệ tạo ra các sản phẩm hữu ích từ nguồn phế liệu này là một vấn đề không chỉ có ý nghĩa lí luận mà còn có ý nghĩa thực tiễn rất thiết thực. Tuy nhiên việc ứng dụng kitin và kitinaza cho sản xuất các sản phẩm có ý nghĩa là một việc không mấy dễ dàng. Dù kitin đƣợc sản xuất hàng năm với con số lớn nhƣng khó tinh chế bởi sự có mặt của prôtêin và CaCO3. Thêm vào đó trong quá trình xử lý cần trung hoà bằng bazơ hoặc axit, quá trình tẩy rửa gây ô nhiễm môi trƣờng nƣớc.
Vì vậy sử dụng quá trình sinh học để tách chiết kitin là điều hết sức cần thiết [40]. Thêm vào đó vi sinh vật phân giải kitin thì có nhiều nhƣng việc phân lập và xác định hoạt tính kitinaza của chúng còn nhiều khó khăn đặc biệt là việc xác định các điều kiện tối ƣu. Trong quá trình xác định hoạt tính có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng, đồng thời khoảng giới hạn hoạt động của các yếu tố ảnh hƣởng đó thƣờng lớn và thay đổi ở mỗi loài vi sinh vật. Với ý nghĩa thực tiễn đó tôi thực hiện đề tài “ Phân lập một số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym” nhằm góp phần cung cấp thêm vào bảo tàng giống một số chủng vi khuẩn có hoạt tính kitinaza cao, nghiên cứu một số đặc tính của chúng để có thể ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tạo ra các chế phẩm vi sinh có hiệu quả cao mang lại lợi ích cho con ngƣời.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ KITIN 1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của kitin trong tự nhiên Kitin là một polysaccarit tồn tại trong tự nhiên với sản lƣợng rất lớn (đứng thứ 2 sau xenlulôzơ). Kitin rất phổ biến trong tự nhiên và nó đƣợc tìm thấy nhƣ một vật liệu cấu trúc của các loài sinh vật sống hiện nay [41]. Ở một số động vật nguyên sinh có tiêm mao, roi và amip kitin cấu tạo nên vỏ bào xác. Một số tảo (nhƣ tảo silic, tảo cát) và nấm (nhƣ Candida albicans, Neurospora crassa,…) kitin là thành phần chính của thành tế bào.
Động vật không xƣơng sống nhƣ giun tròn, chân đốt, thân mềm và côn trùng,…kitin là thành phần chủ yếu của bộ xƣơng ngoài. Trong động vật bậc cao monome của kitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và găn liền các vết thƣơng ở da. [29, 44] Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ hàm lƣợng kitin khá cao. Vì vậy, vỏ tôm, cua, ghẹ thƣờng là nguyên liệu chính để sản xuất kitin.
Kitin có khối lƣợng phân tử lớn, cấu trúc phức tạp, là tập hợp các monosaccarit ( N-acetyl- β-D-glucôzamine) liên kết với nhau bởi cầu nối glucôzit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa, rất hiếm khi kitin tồn tại ở trạng thái tự do và hầu nhƣ luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị với các prôtêin, CaCO3 và các hợp chất phản ứng khác.[29, 44] Về mặt lịch sử, kitin dƣợc Henry Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Năm 1823 Galier phân lập đƣợc một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là kitin. Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học 1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin.
Cấu trúc của kitin. Qua nghiên cứu sự thuỷ phân kitin bằng enzym hay HCl đậm đặc ngƣời ta thấy kitin là một chuỗi polysaccarit của N- acetyl-D- glucozamin đƣợc tạo lên bởi mối liên kết β (1-4) glicozit với công thức tổng quát (C8H15O5N)n. Các chuỗi kitin riêng rẽ có thể dạng xoắn vì mỗi phân tử đƣờng bị đảo ngƣợc so với những phân tử đƣờng cạnh, dẫn đến sự ổn định về cấu trúc của chúng. Chính sự khác biệt này đã tăng cƣờng liên kết hiđrô giữa polyme liền kề, do đó tăng độ bền trong ma trận kitin.
Cấu trúc hoá học kitin đƣợc thể hiện qua hình 1. Cấu trúc hoá học của kitin Bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X ngƣời ta đã chứng minh đƣợc kitin có ba dạng cấu trúc dị hình là α, β và γ- kitin trong đó dạng phổ biến nhất là α - kitin. Các dạng này của kitin do sự sắp xếp khác nhau về hƣớng của mỗi mắt xích (N- acetyl- Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 8 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học D glucozamin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm (- CH2OH), phần đuôi mũi tên chỉ nhóm ( - NHCOCH3), thì các cấu trúc α, β và γ kitin đƣợc mô tả nhƣ sau.[13, 28, 36, 45] Dạng α- kitin Dạng β- kitin Dạng γ- kitin Dạng α- kitin đƣợc tìm thấy trong khoang của thuỷ tức,bộ xƣơng ngoài của động vật chân đốt, vỏ giun tròn, răng bào của động vật thân mềm.
Do cách sắp xếp nhƣ vậy, ngoài có liên kết hiđrô trong mỗi lớp còn có liên kết hiđrô giữa các lớp, sự sắp xếp theo nguyên tắc đối song song đó đã tạo ra tấm kitin rất bền vững. Dạng β- kitin tìm thấy trong tảo silic, bộ xƣơng ngoài côn trùng, kén và là thành phần chính của thành tế bào nấm, vỏ động vật thân mềm và một số động vật chân đốt. Dạng γ- kitin là hỗn hợp của hai dạng α và β- kitin có trong dạ dày của mực ống, hai dạng β và γ- kitin sắp xếp chiều các monome khác biệt so với dạng α- kitin nhƣ miêu tả trên dẫn đến là dạng kém bền và dễ thoái hoá.2 Đặc tính của kitin.[29] Kitin có mầu trắng hay trắng phớt hồng, không mùi, không vị, không tan trong nƣớc, trong môi trƣờng kiềm, axít loãng và các dung môi hữu cơ nhƣ rƣợu, ete,…nhƣng tan trong một số dung dịch kiềm đặc nóng. Kitin ổn định với chất ôxi hoá mạnh nhƣ thuốc tím( KMnO4) ôxi già (H2O2), nƣớc ja ven,…lợi dụng tính chất này ngƣời ta sử dụng các chất oxi hoá trên để khử màu cho kitin.
Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 9 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40-50%) ở nhiệt độ cao kitin bị mất gốc acetyl và trở thành kitosan hoặc trong dung dịch HCl đậm đặc kitin bị cắt mạch thu đƣợc glucozamin. Kitin dễ dàng bị phân huỷ bằng việc phân cắt liên kết glicôzit dƣới tác dụng của kitinaza đƣợc tiết ra bởi một số vi sinh vật, thực vật và động vật. [7, 16, 2014] Kitin Kitinaza Kitin Deacetylaza (GlcNAc)2 Kitosan N- Acetyl Glucozamindaza kitosanaza GlcNAc (GlcN)2 Deacetylaza Glucozamindaza GlcN Hình 2: Con đƣờng phân giải kitin Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 10 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học 1.3 Ô nhiễm môi trường có nguồn gốc kitin Xuất khẩu thuỷ sản đã và đang là ngành kinh tế thu đƣợc lợi nhuận cao không chỉ cho nền kinh tế nƣớc ta mà còn cho nền kinh tế thế giới. Tuy nhiên, một thực trạng đáng báo động hiện nay là song song với sự gia tăng kinh tế thì vấn đề ô nhiễm môi trƣờng do chất thải rắn (vỏ tôm, cua, ghẹ…) của các nhà máy chế biến thuỷ sản xuất khẩu thải ra môi trƣờng cũng tăng lên đáng kể.
Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của ngành thuỷ sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lƣợng tôm năm 2003 là 193973 tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể lên tới 40 – 70% khối lƣợng nguyên liệu. Tƣơng ứng với sản lƣợng tôm hàng năm sẽ có khối lƣợng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm đƣợc tạo ra. Biết rằng các chất gây ô nhiễm môi trƣờng ở đây có nguồn gốc kitin vẫn lƣu trữ giá trị kinh tế lớn nên bất chấp hậu quả vì thu lợi trƣớc mắt đã mọc lên nhiều cơ sở sơ chế vỏ đầu tôm địa phƣơng.