Luận văn thạc sĩ: Phân lập và thiết kế vector gen NAD(P)H (NQO1) ở người

Luận văn thạc sĩ phân tích phân lập và thiết kế vector mang gen mã hóa nad p h quinone oxidoreductase 1 nqo1 ở người, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Nga
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Đăng Tôn
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân lập và thiết kế vector mang gen NQO1 ở người
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về gen NQO1 và vai trò sinh học

Gen NQO1 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1) là một gen quan trọng mã hóa enzyme có chức năng bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Gen này được định vị trên nhiễm sắc thể số 16 và có cấu trúc gồm các exon và intron. Enzyme NQO1 đóng vai trò then chốt trong con đường Keap1/Nrf2/ARE, giúp điều hòa đáp ứng chống oxy hóa của tế bào. Protein này hoạt động dưới dạng dimer và có khả năng liên kết với các phân tử quinone, giúp detoxify các chất độc hại. Nghiên cứu về phân lập gen NQO1 ở người có ý nghĩa lâm sàng quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế bảo vệ tế bào và ứng dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa.

1.1. Cấu trúc và vị trí của gen NQO1

Gen NQO1 nằm trên NST số 16 và có cấu trúc phức tạp với nhiều exon và intron. Cấu trúc này cho phép các biến thể khác nhau được tạo ra thông qua quá trình alternative splicing. Sự đa dạng về cấu trúc gen ảnh hưởng đến biểu hiện protein và hoạt động enzyme trong các tế bào khác nhau.

1.2. Chức năng enzyme NQO1 trong tế bào

Enzyme NQO1 hoạt động như một detoxification enzyme quan trọng, giúp bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân oxy hóa. Protein này tham gia vào con đường Keap1/Nrf2/ARE, điều hòa biểu hiện các gen chống oxy hóa. Hoạt động này đặc biệt quan trọng trong các tế bào ung thư và tế bào bị tổn thương do hóa chất môi trường.

II. Phương pháp phân lập và thiết kế vector mang gen NQO1

Quy trình phân lập gen NQO1 bắt đầu từ việc thu nhập mRNA từ các tế bào hoặc mô người, sau đó sử dụng kỹ thuật RT-PCR để tạo cDNA mã hóa enzyme NQO1. Vector biểu hiện pcDNA3.1B được chọn làm vector chủ để chứa đoạn cDNA này. Quá trình thiết kế vector tái tổ hợp bao gồm cắt plasmid và cDNA bằng enzyme giới hạn, sau đó kết hợp chúng lại bằng enzyme ligase. Vector tái tổ hợp pcDNA3.1B myc-his-NQO1 được tạo thành để chuẩn bị cho biểu hiện protein NQO1 trong các tế bào động vật. Phương pháp này cho phép tạo ra các dòng plasmid ổn định mang thông tin di truyền của gen NQO1.

2.1. Kỹ thuật PCR nhân gen cDNA NQO1

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để nhân chép đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 từ mRNA. Cặp mồi (primer) được thiết kế cẩn thận để đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu suất nhân chép. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose để xác nhận kích thước và chất lượng đoạn DNA được tạo thành.

2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen NQO1

Vector pcDNA3.1B được cắt bằng enzyme giới hạn tương ứng để tạo đầu dính phù hợp với đoạn cDNA NQO1. Quá trình liên kết DNA được thực hiện bằng enzyme ligase DNA để tạo vector tái tổ hợp pcDNA3.1B myc-his-NQO1. Plasmid này được kiểm chứng bằng PCR và điện di trước khi đưa vào tế bào.

III. Biến nạp vector vào tế bào và xác minh plasmid

Sau khi tạo thành công vector tái tổ hợp, bước tiếp theo là biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli 10β thông qua phương pháp transformation. Các tế bào được nuôi trên môi trường LB có chứa ampicilin để lựa chọn những tế bào đã nhận plasmid. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết và kiểm chứng bằng PCR và digestion với enzyme giới hạn để xác nhận sự có mặt của đoạn cDNA NQO1. Các dòng plasmid dương tính được chuẩn bị cho các thí nghiệm biểu hiện tiếp theo. Kỹ thuật này đảm bảo rằng vector mang gen NQO1 được tạo thành chính xác trước khi sử dụng trong các ứng dụng sinh học phân tử.

3.1. Quy trình biến nạp và lựa chọn tế bào

Plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào khả biến E. coli 10β bằng phương pháp heat shock. Tế bào được phục hồi trên môi trường lỏng trước khi nuôi cấy trên môi trường LB-agar có chứa ampicilin. Chỉ những tế bào đã nhận plasmid mới có khả năng sống sót, tạo thành các colony chứa vector mang gen NQO1.

3.2. Xác minh và tinh sạch plasmid tái tổ hợp

Plasmid tái tổ hợp được tách chiết từ các tế bào E. coli dương tính. Kiểm chứng bằng PCR, điện di và digestion với enzyme giới hạn để xác nhận sự có mặt chính xác của đoạn cDNA mã hóa NQO1. Các plasmid được tinh sạch và lưu trữ để sử dụng trong biểu hiện protein.

IV. Biểu hiện protein NQO1 và ứng dụng lâm sàng

Vector mang gen NQO1 được đưa vào các tế bào động vật (như tế bào HCT, MFC-7, JHH) để thực hiện biểu hiện tạm thời của protein NQO1. Kỹ thuật transfection được sử dụng để đưa plasmid vào tế bào nuôi cấy. Biểu hiện protein được kiểm tra bằng SDS-PAGE và Western blot để xác nhận kích thước protein (kD) và mức độ biểu hiện. Protein NQO1 được tạo thành dưới dạng fusion protein có tag myc-his để dễ dàng phát hiện và tinh sạch. Nghiên cứu này có ý nghĩa trong việc tìm hiểu cơ chế hoạt động của NQO1 và khả năng ứng dụng trong các liệu pháp chống oxy hóa, đặc biệt là trong điều trị bệnh ung thư và độc tính do hóa chất môi trường gây ra.

4.1. Phương pháp biểu hiện protein NQO1 trong tế bào động vật

Vector pcDNA3.1B myc-his-NQO1 được đưa vào các dòng tế bào như HCT, MFC-7, JHH bằng phương pháp transfection. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung huyết thanh. Biểu hiện tạm thời của protein NQO1 được theo dõi theo thời gian để xác định mức độ và thời gian tối ưu.

4.2. Ứng dụng lâm sàng và ý nghĩa nghiên cứu

Nghiên cứu về phân lập và thiết kế vector gen NQO1 có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế bảo vệ tế bào. Ứng dụng lâm sàng bao gồm phát triển các liệu pháp chống oxy hóa, nghiên cứu liên quan đến biến đổi gen và ảnh hưởng của dioxin đối với sức khỏe con người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Quinon đại diện cho một lớp các chất trung gian độc hại mà có thể tạo ra một loạt các tác động nguy hại trong cơ thể, bao gồm cả khả năng gây độc cấp tính, immunotoxicity, và ung thư. Các cơ chế tác động ảnh hưởng do quinon gây ra là rất phức tạp, và nó gây tổn hại cho tế bào có thể xảy ra thông qua quá trình alkyl hóa các protein quan trọng hay cả DNA của tế bào. Ngoài ra quinon là các phân tử hoạt động oxi hóa khử cao có thể tạo các semiquinone dẫn đến hình thành dạng phản ứng oxi hóa (ROS) đặc biệt bao gồm cả superoxide, hydrogen peroxide, và cuối cùng là gốc hydroxyl. Sự sản xuất ROS có thể gây bất lợi oxi hóa nghiêm trọng trong tế bào thông qua sự hình thành các phân tử lớn của tế bào bị oxi hóa bao gồm cả chất béo, protein và DNA, tạo cơ sở cho lão hóa và ung thư.

Quinon phổ biến trong tự nhiên và là một phần quan trọng cuả các hợp chất tự nhiên có trong thực vật, nấm và vi khuẩn. Chúng ta tiếp xúc với quinon không chỉ thông qua chế độ ăn uống mà còn thông qua các chất gây ô nhiễm như benzen, các hydrocarbon mạch vòng hay do chính chúng ta tạo ra như estrogen, catecholamin. Nhiều bằng chứng mạnh mẽ cho thấy cơ chế độc tính của quinon liên quan tới các bệnh lý đã được biết đến của các hợp chất trên. Tế bào chúng ta cũng có rất nhiều cơ chế để chống lại những ảnh hưởng tiêu cực của quinon và một trong số đó chính là NAD(P)H:quinone oxidoreductae 1 (NQO1), một enzyme đi đầu trong hàng rào bảo vệ tế bào chống lại các tác động gây độc của các hợp chất quinon.

Enzyme oxi hóa khử quinon chất nhận NADH- NQO1 là một flavoprotein được phân bố rộng rãi, phụ thuộc FAD, thúc đẩy sự khử 2 điện tử quinon, quioneimines, nitroaromatics, và azo dyes. Sự khử này làm giảm mức quinon và giảm thiểu cơ hội tạo phản ứng oxy trung gian và giảm các nhóm thiol nội bào. NQO1 là một enzyme cảm ứng mạnh được điều khiển bởi con đường Keap/Nrf2/ARE. Bằng chứng cho thấy tầm quan trọng chức năng chống oxi hóa của NQO1 trong stress oxi hóa được cung cấp bởi các mức độ biểu hiện cảm ứng NQO1 (knockout hoặc knockdown) liên quan đến tăng và giảm khả năng nhạy cảm tương ứng với stress oxi hóa.

Hơn nữa độc tính benzen được tăng cường rõ rệt khi NQO1 1 Nguyễn Th Thanh K20 Sinh học thực suy giảm hoạt tính. Ở người các đa hình ức chế hoạt động của NQO1 liên quan đến sự tăng cường khuynh hướng bệnh tật. Nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra vai trò bảo vệ mới của NQO1, dường như không liên quan đến hoạt động của enzyme. NQO1 bám vào giúp ổn định nhân tố ức chế khối u p53 chống lại sự phân hủy của proteasomal.

Hơn nữa NQO1 xuất hiện để điều khiển tính phân hủy của protein khác. Những phát hiện này có thể cho thấy một vai trò chọn lọc “gatekeeping” trong việc điều khiển sự phân hủy proteasomal của các protein đặc hiệu, do đó mở rộng vai trò bảo vệ tế bào của NQO1 vượt xa khả năng chống oxi hóa hiệu quả cao của nó. Để cung cấp một mô hình nghiên cứu xác định vai trò của NQO1 trong hoạt hóa các yếu tố bioreductive, chúng tôi thực hiện đề tài phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa enzyme NQO1 với mục tiêu: 1. Tạo ra vector tái tổ hợp chứa đoạn gen mã hóa enzyme NQO1.

Thiết kế vector biểu hiện tạm thời thành công đoạn gen đó trong tế bào động vật HEK. 2 Nguyễn Th Thanh K20 Sinh học thực ƣơn TỔNG QUAN TÀI LI U 1. Tổng quan về gen NQO1 1.1 Giới thiệu chung về gen NQO1 Gen NQO1 mã hóa cho enzyme NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 là enzyme có nhiều vai trò bảo vệ tế bào, ngoài chức năng xúc tác còn có chức năng mở rộng [56]. NQO1 là một flavoprotein phụ thuộc FAD được phân bố rộng rãi xúc tác cho sự phân giải quinon, quinoneimines, nitroaromatics, và azo dyes.

NQO1 đã được phát hiện và đặt tên DT-diaphorase (DPNH=NADH và TPNH=NADPH) bởi Lars Ernster vào năm 1958, và được thể hiện thông qua sự ức chế phản ứng oxi hóa khử vitamin K do dicoumarol đã được mô tả bởi Marki và Martius. Vai trò chống oxi hóa trực tiếp cơ bản của NQO1 trong cơ chế xúc tác: làm giảm 2 điện tử ở một loạt các quinon thành hydroquinone tương ứng bằng cách sử dụng NADPH hoặc NADH như chất cho điện tử [24]. Như vậy, NQO1 chuyển điện tử của quinon tham gia vào các phản ứng hoặc làm suy giảm sulfhydryl hoặc giảm sự mất 1 điện tử tạo ra semiquinone và các phản ứng khác nhau tạo ra các hợp chất oxi hóa trung gian như kết quả chu trình oxi hóa khử. Thêm vào đó, các sản phẩm hydroquinone của các phản ứng NQO1 có thể chuyển hóa glucuronide và các gốc sulfate do đó dễ dàng được bài tiết ra ngoài.

Đáng chú ý, sự khử quinon được tìm thấy ở hàng loạt các sinh vật nhân chuẩn từ nấm men đến động vật có vú [27]. Mặc dù trong nhiều hệ thống, các chức năng và sự điều hòa của các enzyme phức tạp vẫn được tìm hiểu, nhưng rõ ràng là trong các trường hợp khử quinon là đi đầu trong bảo vệ tế bào với điều kiện là có nhiều lớp bảo vệ [28, 30, 34]. Xung quanh thời điểm khám phá ra NQO1, Williams-Ashman và Huggins [68] đã tìm thấy enzyme này đã phản ứng mạnh trong gan chuột bởi azo dye và các hydrocarbon mạch vòng. Hơn nữa với sự hiệu quả của NQO1 trong bảo vệ chống lại độc tố và khả năng gây ung thư của các hydrocarbon mạch vòng, Huggins cho thấy sử dụng định lượng hoạt tính NQO1 như một phương pháp sàng lọc để xác định hiệu quả các tác nhân bảo vệ.

Trong những năm cuối thập niên 80 Hans Prochaska và các cộng sự [55] phát triển thử nghiệm sinh học định lượng cao trong đĩa 96 giếng cho NQO1 tế bào gan chuột. 3 Nguyễn Th Thanh K20 Sinh học thực Thử nghiệm này hiện đang được sử dụng rộng rãi để sàng lọc cho hoạt tính gây cảm ứng NQO1 của các hợp chất tinh khiết hay hỗn hợp phức tạp, phân đoạn cho các hỗn hợp đó và xác định chính xác tác dụng của các chất gây cảm ứng [32]. Hơn nữa, nhiều hợp chất hóa học đã được tìm thấy cảm ứng NQO1 trong thử nghiệm này đã trực tiếp chỉ ra vai trò bảo vệ chống lại các độc tố và gây ung thư của hàng loạt chất gây ung thư trong một số tổ chức đích và ngược lại. Cấu trúc gen NQO1 Gen NQO1 nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể 16 tại vị trí 16q22.

Gen NQO1 có kích thước khoảng 20 kb, trong đó kích thước mRNA là 2912bp và có sáu exon bị gián đoạn bởi năm intron. Vị trí của gen mã hóa NQO1 trên NST số 16 [72] Exon đầu tiên là dài 118 bp và mã hóa cho hai loại axit amin G, M và một codon khởi đầu đầu tiên của exon thứ hai. Exon thứ sáu là lớn nhất trong số các exon, có chiều dài là 1833 bp. Phân tích trình tự của exon thứ sáu cho thấy sự hiện diện của 4 chuỗi tín hiệu tiềm năng polyadenylation (AATAAA).

Trong tất cả các intron, intron thứ hai là nhỏ nhất (116 bp). Trong đó, trình tự nucleotide mã hóa cho protein NQO1 chỉ chiếm có 4% tổng số nucleotide của gen (Bảng 1). Kích thước các exon và intron của gen mã hóa cho enzyme NQO1. Trình tự gen và promoter NQO1 đã được xác định lần lượt là 2423bp và 2123bp.

Trong nghiên cứu Asma Chinigarzadeh cùng cộng sự (2012) đã phân lập thành công đoạn 2.123 bp từ vị trí bắt đầu phiên mã tham gia vào điều hòa sự sao chép của gen NQO1 [21]. Các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu tiềm năng vị trí điều hòa ARE nằm ở - 477 tính từ vị trí bắt đầu phiên mã. Cấu trúc gen NQO1 với các intron và exon [72] 1.3 Sự điều hòa NQO1 bởi con đường Keap/Nrf2/ARE Một dãy các chất hóa học có khả năng cảm ứng [29] tăng cường NQO1 được thông qua con đường trung gian KEAP1/ Nrf2/ARE. Bằng cách kiểm soát biểu hiện một dãy hơn 100 gen bảo vệ tế bào, con đường này là cần thiết cho sự thích ứng của tế bào động vật và các sinh vật khác với rất nhiều tác nhân gây stress như ái lực và oxi hóa [44, 50, 51].

Như tên của con đường, ba thành phần tế bào là trung tâm quan trọng đối với các cơ chế bởi sự phiên mã của nhiều gen được điều hòa: - Yếu tố phản ứng chống oxi hóa (ARE), trình tự DNA có mặt ở vùng điều hòa trước của gen và liên ứng TGAG/CNNNGC. Trong trường hợp gen NQO1 chuột trình tự chính xác đã được sửa bởi John Hayes và cộng sự [39, 52] đã chỉ ra rằng các nucleotide nhất định trước đây được cho là dư thừa trong ARE chức năng có vai trò thiết yếu, trong khi những nucleotide khác trước đó được coi là thiết yếu thì không cần thiết. - Nrf2 một nhân tố phiên mã zitrer leucine cơ bản của họ cap-n’collar liên kết như một heterodimer với protein nhỏ Maf, tới ARE do đó tăng cường tín hiệu phiên mã. 5 Nguyễn Th Thanh K20 Sinh học thực - Keap1 (Kelch- như protein liên kết ECH), protein cảm biến các tác nhân gây cảm ứng một protein ức chế đa domain họ Keap cái mà gắn với Nrf2 và thúc đẩy uquitination và phân hủy proteasomal [42] bởi chức năng như một adaptor nối Cul3 dựa trên E3 [70].

Con đường Keap1/Nrf2/ARE [15] Trong điều kiện cơ bản (mũi tên nét đứt), protein hai domain Keap1 nối kết yếu tố phiên mã Nrf2 qua miền Kelch và thúc đẩy sự ubiquitination và sự phân hủy proteasomal của yếu tố phiên mã có chức năng như một bộ chuyển đổi cho Cul3 dựa trên ligase E3. Gây cảm ứng cho tất cả đều phản ứng với nhóm sulfhydryl, thay đổi hóa học cụ thể phản ứng mạnh aa cysteine của Keap1 mà sau đó mất khả năng nhằm vào đích Nrf2 cho sự phân hủy. Do đó, Nrf2 được ổn định và di chuyển (mũi tên) vào nhân nơi mà nó liên kết với AREs và gây nên biểu hiện của NQO1 và một dãy > 100 gen bảo vệ tế bào khác. Một vài mô hình khác nhau được đề xuất cho cơ chế về sự điều hòa của con đường Keap/Nrf2/ARE.

Mô hình phổ biến rộng rãi nhất là cảm ứng, tất cả các phản ứng với nhóm sulfhydryl [40], phản ứng mạnh thay aa cystein của chất cảm biến Keap cái mà sau đó mất khả năng phân hủy đích Nrf2.