Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sản xuất rượu truyền thống từ các nguồn nguyên liệu giàu tinh bột như gạo, ngô, sắn là nghề thủ công lâu đời gắn liền với nền nông nghiệp Việt Nam. Tại quy mô hộ gia đình ở các vùng nông thôn, quá trình lên men rượu hiện nay chủ yếu dựa vào nguồn bánh men thuốc Bắc được sản xuất theo kinh nghiệm dân gian. Phương thức này khiến hệ vi sinh vật trong bánh men không thuần nhất, hiệu suất chuyển hóa cơ chất chưa cao, khả năng lên men chưa được tối ưu hóa và chất lượng sản phẩm qua các mẻ nấu thiếu tính ổn định.

Để giải quyết vấn đề thực tiễn trên, khóa luận "Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ bánh men thu thập tại Yên Phong - Bắc Ninh" của tác giả Mẫn Văn Hoằng (Chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên) đã tiến hành khảo sát, sàng lọc nguồn vi sinh vật bản địa nhằm thu nhận chủng nấm men thuần khiết có hoạt lực mạnh.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định là: Phân lập và tuyển chọn ra các chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt nhất từ các mẫu bánh men thu thập tại địa phương, đồng thời tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy của chủng tuyển chọn nhằm phục vụ nghiên cứu và định hướng ứng dụng thực tế.

Để hoàn thành mục tiêu trên, đề tài thực hiện 3 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Phân lập các chủng nấm men từ mẫu bánh men thuốc Bắc thu thập tại Yên Phong – Bắc Ninh.
  2. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao nhất và tiến hành định danh sơ bộ chủng ưu tú.
  3. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và sinh trưởng (nguồn carbon, nguồn nitơ, pH ban đầu) của chủng nấm men được lựa chọn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu bánh men thuốc Bắc thu thập tại huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2014 đến tháng 07/2015.
  • Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: Về mặt khoa học, đề tài đánh giá sơ bộ thành phần vi sinh vật nấm men trong bánh men thuốc Bắc địa phương và xác định chủng có hoạt lực cao. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở áp dụng cho các cơ sở sản xuất rượu thủ công tại địa phương và tạo tiền đề cho quá trình lên men ở quy mô công nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và sinh lý học nấm men

Khóa luận tổng quan các kiến thức chuyên ngành về công nghệ sản xuất rượu và đặc điểm sinh học của nấm men:

  • Phân loại rượu: Phân loại theo công nghệ sản xuất gồm rượu chưng cất (Brandy, Whisky, Rhum, Vodka, Gin), rượu lên men thuần túy (rượu vang, sake, rượu nếp than, rượu cần) và rượu pha chế (liqueur, cocktail).
  • Quy trình đường hóa và lên men: Phân tích các phương pháp đường hóa tinh bột (bằng bánh men truyền thống, phương pháp maltase dùng enzyme malt, và phương pháp Myco-Malt sử dụng nấm mốc thuộc chi Aspergillus, Endomycopsis). Quá trình lên men chuyển hóa glucose thành ethanol và CO2 theo con đường Embden - Meyerhof - Parnas (EMP) và chu trình Krebs: $$\text{C}6\text{H}{12}\text{O}_6 \rightarrow 2\text{C}_2\text{H}_5\text{OH} + 2\text{CO}_2 + 27\text{ kcal}$$ hoặc phương trình tổng quát có photphoryl hóa: $$6\text{C}6\text{H}{12}\text{O}_6 + 2\text{ADP} + 2\text{H}_3\text{PO}_4 \rightarrow 2\text{C}_2\text{H}_5\text{OH} + 2\text{CO}_2 + 2\text{ATP} + 2\text{H}_2\text{O}$$ Cơ chế hóa học chia làm thời kỳ cảm ứng (tạo glycerin, CO2 do thiếu acetaldehyde) và thời kỳ tĩnh (tích lũy ethanol qua enzyme alcohol dehydrogenase). Quá trình bị kìm hãm khi có oxy (hiệu ứng Pasteur).
  • Phân tách tạp chất cồn thô: Khi chưng cất, tạp chất được chia thành tạp chất đầu (aldehyde acetic, ethyl acetat), tạp chất cuối (rượu bậc cao: isoamylic, isobutylic) và tạp chất trung gian.
  • Đặc tính sinh học nấm men Saccharomyces cerevisiae: Là loài kỵ khí tùy tiện; có 6 pha sinh trưởng trong hệ kín (tiềm phát, tăng dần, lũy thừa, giảm dần, ổn định, suy vong); nhu cầu dinh dưỡng gồm carbon (đường hexose), nitơ vô cơ (muối amoni) và hữu cơ (peptone, amino acid), photpho, kali, magie, lưu huỳnh cùng các vitamin nhóm B.

Môi trường nuôi cấy và hóa chất

Đề tài sử dụng các môi trường chuyên dụng sau:

Tên môi trường / Dung dịch Thành phần cấu tạo (trên 1 lít nước cất) Mục đích sử dụng
Môi trường Hansen Glucose: 20 g; Peptone: 10 g; KH2PO4: 3 g; MgSO4·7H2O: 2,5 g; Agar: 20 g Phân lập, nhân giống và giữ giống nấm men
Môi trường Malt - Cao nấm men - Peptone Malt: 3 g; Cao nấm men: 3 g; Glucose: 10 g; Peptone: 5 g Tăng sinh khối và nuôi cấy thử nghiệm sinh hóa
Thuốc nhuộm Xanh methylene 30 ml dung dịch xanh methylene + 1 ml dung dịch KOH 10% trong 100 ml nước Nhuộm màu tiêu bản quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi

Thiết bị phục vụ thí nghiệm gồm: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ cấy vi sinh, kính hiển vi quang học, buồng đếm hồng cầu, máy đo mật độ quang UV-Vis, máy đo pH, cân phân tích và cồn kế tiêu chuẩn.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp nghiền và pha loãng mẫu: Mẫu bánh men được nghiền mịn, lấy 1 g hòa tan với 9 ml nước cất vô trùng, sau đó pha loãng liên tiếp theo nồng độ bậc 10 ($10^{-1}$ đến $10^{-7}$).
  • Quy trình phân lập 10 bước: Gồm thu thập mẫu, hòa loãng mẫu, pha loãng bậc 10, chuẩn bị môi trường Hansen, hấp khử trùng ($121^\circ\text{C}$ trong 15 phút), cấy trải trên đĩa thạch ở các độ pha loãng khác nhau, nuôi ủ ở $30^\circ\text{C}$ từ 24 - 48 giờ, chọn khuẩn lạc cấy sang môi trường lỏng, cấy ria sang môi trường rắn để làm thuần, cấy truyền sang ống thạch nghiêng bảo quản ở $4^\circ\text{C}$.
  • Phương pháp quan sát hình thái: Quan sát đại thể khuẩn lạc trên đĩa petri (kích thước, màu sắc, độ bóng, mép khuẩn lạc, tâm khuẩn lạc); soi kính hiển vi qua tiêu bản sống và tiêu bản nhuộm xanh methylene.
  • Phương pháp đo mật độ quang (OD): Xác định sự tích lũy sinh khối tế bào nấm men ở bước sóng $\lambda = 620\text{ nm}$ qua các mốc thời gian (0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h).
  • Phương pháp thử khả năng lên men bằng ống Durham: Đánh giá hoạt lực sinh khí $\text{CO}_2$ đẩy ống Durham lên cao 5 cm trong ống nghiệm chứa dịch đường (glucose, lactose, saccarose) và dịch chiết malt ở các tỷ lệ pha loãng (9:1, 8:2, 7:3).
  • Thử hoạt tính Catalase: Nhỏ trực tiếp dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$ lên sinh khối nấm men trên phiến kính, quan sát hiện tượng sủi bọt khí để xác định vi sinh vật kỵ khí tùy tiện.
  • Phương pháp chưng cất xác định nồng độ cồn: Lấy 100 ml dịch sau lên men (nhiệt độ $20^\circ\text{C}$), bổ sung nước cất định mức đến 300 ml, tiến hành chưng cất thu 100 ml rượu thô, đo bằng cồn kế và tính toán nồng độ rượu theo công thức: $$N_1 = \frac{N_2 \times V_2}{V_1}$$ Trong đó: $N_1$ là nồng độ cồn cần tính; $N_2$ là độ cồn đo được từ dịch chưng cất; $V_1$ là thể tích dịch lên men đem chưng cất ($100\text{ ml}$); $V_2$ là thể tích rượu thô thu được ($100\text{ ml}$).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc nghiên cứu vi sinh vật bản địa trong sản xuất rượu truyền thống; xác định mục tiêu chung, 3 yêu cầu nghiên cứu, cùng ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài tại địa bàn huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các nghiên cứu về công nghệ sản xuất rượu: phân loại đồ uống có cồn; các phương pháp đường hóa nguyên liệu chứa tinh bột; động học và các phản ứng sinh hóa của quá trình lên men rượu; phân tích chi tiết cấu tạo tế bào (vỏ tế bào, nguyên sinh chất, ribosome, ty thể, nhân tế bào), các hình thức sinh sản (vô tính nảy chồi, hữu tính tạo bào tử nang), các pha sinh trưởng và nhu cầu trao đổi chất của nấm men Saccharomyces cerevisiae.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn gốc mẫu bánh men thuốc Bắc; thời gian và địa điểm thực hiện; danh mục thiết bị, hóa chất; thành phần các môi trường Hansen, môi trường Malt - Cao nấm men - Peptone; quy trình phân lập 10 bước; các kỹ thuật thực nghiệm đo OD 620 nm, buồng đếm hồng cầu, ống Durham thử đường và dịch malt, thử phản ứng catalase và kỹ thuật chưng cất xác định độ cồn.

Phần 4: Kết quả thảo luận

Trình bày chi tiết dữ liệu thực nghiệm qua các bước nghiên cứu:

  • Kết quả phân lập và đo OD: Từ mẫu bánh men thu thập, tác giả đã phân lập được 50 chủng nấm men thuần khiết, ghi nhận đầy đủ đặc điểm hình thái khuẩn lạc (màu trắng sữa, trắng ngà, bề mặt bóng/nhăn, có tâm hoặc không tâm) và chỉ số OD từ 0h đến 36h. Qua đánh giá tốc độ tăng sinh khối, tác giả đã chọn ra 6 chủng sinh trưởng mạnh nhất: 22.1, 26.2, 28.2, 32.3, 32.4, 34.1.
  • Thử nghiệm khả năng lên men các loại đường: Thử nghiệm với ống Durham trong 30 giờ theo dõi thời gian sinh khí $\text{CO}_2$ đẩy ống nổi lên 5 cm. Kết quả cho thấy chủng 34.1, 28.2 và 22.1 có thời gian làm nổi ống ngắn nhất đối với glucose và các đường khác.
  • Thử nghiệm lên men trên dịch chiết malt: Thử nghiệm ở các tỷ lệ pha loãng dịch malt:nước cất (9:1, 8:2, 7:3). Chủng 34.1 thể hiện tốc độ lên men nhanh nhất ở mọi tỷ lệ pha loãng.
  • Thử hoạt tính Catalase: Cả 3 chủng ưu tú (22.1, 28.2, 34.1) khi tiếp xúc với dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$ đều sủi bọt khí mạnh, xác nhận các chủng thuộc nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện.
  • Xác định nồng độ cồn sau chưng cất: Tiến hành chưng cất dịch lên men từ tinh bột cơm và dịch malt. Kết quả khẳng định chủng 34.1 đạt hàm lượng ethanol cao nhất trong các chủng tuyển chọn.
  • Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng 34.1:
    • Nồng độ đường glucose: Nồng độ tối thích cho sinh trưởng phát triển là 3%.
    • Nguồn nitơ (peptone): Hàm lượng peptone tối thích đạt 10 g/l.
    • Độ pH ban đầu: Khoảng pH thích hợp nhất cho chủng phát triển là $\text{pH} = 6$.
  • Định danh sơ bộ: Kết hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc (hình tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm), hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi và đặc tính sinh hóa, chủng 34.1 được định danh sơ bộ thuộc loài Saccharomyces cerevisiae và đặt tên khoa học là Saccharomyces cerevisiae 34.1.

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận tổng kết toàn bộ số liệu thu được của đề tài (phân lập 50 chủng, chọn lọc 6 chủng sơ bộ, chọn 1 chủng ưu tú S. cerevisiae 34.1 đạt độ cồn 11,55%) và nêu đề nghị mở rộng nghiên cứu ứng dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp.


Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm then chốt

Khóa luận đã ghi nhận các số liệu thực nghiệm định lượng chính xác qua các bảng tổng hợp sau:

Bảng kết quả thử nghiệm lên men các loại đường của 6 chủng nấm men tuyển chọn sơ bộ:

Ký hiệu chủng Khả năng lên men Glucose (thời gian làm nổi ống Durham 5 cm) Khả năng lên men Lactose Khả năng lên men Saccarose
22.1 Nổi sau 18 giờ Nổi sau 18 giờ Không nổi
26.2 Nổi sau 30 giờ Nổi sau 34 giờ Không nổi
28.2 Nổi sau 16 giờ Nổi sau 25 giờ Nổi sau 19 giờ
32.3 Nổi sau 30 giờ Không nổi Nổi sau 34 giờ
32.4 Nổi sau 27 giờ Không nổi Nổi sau 30 giờ
34.1 Nổi sau 12 giờ Nổi sau 20 giờ Nổi sau 21 giờ

Từ kết quả thử nghiệm đường và dịch chiết malt, 3 chủng 22.1, 28.2 và 34.1 được đưa vào chưng cất dịch lên men. Kết quả chưng cất xác định nồng độ cồn cho thấy chủng 34.1 vượt trội với độ cồn đo được đạt 11,55%.

Bảng thông số tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Saccharomyces cerevisiae 34.1:

Yếu tố khảo sát Khoảng khảo sát Giá trị tối thích xác định
Nồng độ đường Glucose Khảo sát theo các dải nồng độ cơ chất 3%
Hàm lượng Peptone (nguồn Nitơ) Khảo sát các nồng độ peptone bổ sung 10 g/l
Độ pH ban đầu Khảo sát dải pH môi trường nuôi cấy pH = 6

Đóng góp của đề tài

  1. Đóng góp khoa học: Đã sàng lọc và phân lập thuần khiết được 50 chủng nấm men bản địa từ bánh men thuốc Bắc tại huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh; cung cấp dữ liệu mô tả hình thái và động học tăng sinh mật độ quang OD 620 nm của tập đoàn nấm men địa phương.
  2. Đóng góp thực tiễn: Tuyển chọn được chủng nấm men ưu tú Saccharomyces cerevisiae 34.1 có khả năng sinh cồn cao (11,55%), đồng thời thiết lập được bộ thông số môi trường tối ưu (glucose 3%, peptone 10 g/l, pH 6) làm cơ sở cho việc cải tiến quy trình lên men rượu thủ công và bán công nghiệp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của đề tài: Do điều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm còn hạn chế, việc định danh chủng nấm men 34.1 mới dừng lại ở mức định danh sơ bộ dựa trên các phương pháp truyền thống (quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào vi học và thử nghiệm đặc tính sinh hóa, lên men đường, thử catalase), chưa tiến hành giải trình tự gen sinh học phân tử (vùng gen 18S rRNA/ITS) để xác định danh tính chủng ở mức độ chính xác tuyệt đối.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Tác giả đề nghị tiếp tục triển khai các nghiên cứu sâu hơn về đặc tính công nghệ, độ bền cồn, khả năng chịu nhiệt và khảo sát thử nghiệm chủng Saccharomyces cerevisiae 34.1 trên các mô hình lên men quy mô lớn hơn để tiến tới ứng dụng trong sản xuất rượu quy mô công nghiệp.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:

  • Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sau thu hoạch và Kỹ thuật vi sinh - lên men.
  • Nội dung tham khảo hữu ích:
    • Quy trình thực nghiệm 10 bước phân lập và làm thuần nấm men từ nguồn mẫu bánh men truyền thống.
    • Phương pháp bố trí thí nghiệm ống Durham theo dõi động học sinh khí $\text{CO}_2$ để đánh giá tốc độ lên men các loại đường khác nhau.
    • Quy trình chưng cất, xác định độ rượu bằng cồn kế và phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng (carbon, nitơ, pH) đến sinh khối nấm men.

Câu hỏi thường gặp

1. Đề tài đã phân lập được bao nhiêu chủng nấm men và thu thập từ đâu?

Đề tài đã phân lập được 50 chủng nấm men thuần khiết từ các mẫu bánh men thuốc Bắc thu thập tại địa bàn huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh.

2. Tiêu chí nào được sử dụng để sàng lọc từ 50 chủng ban đầu xuống 6 chủng và 3 chủng?

Tác giả sàng lọc 50 chủng xuống 6 chủng (22.1, 26.2, 28.2, 32.3, 32.4, 34.1) dựa trên tốc độ tăng sinh khối qua giá trị mật độ quang OD đo ở bước sóng 620 nm từ 0h đến 36h. Sau đó, từ 6 chủng tiếp tục thử khả năng lên men các loại đường (glucose, lactose, saccarose) bằng ống Durham để chọn ra 3 chủng có thời gian sinh khí làm nổi ống nhanh nhất là 22.1, 28.2 và 34.1.

3. Chủng nấm men nào được tuyển chọn cuối cùng và đạt độ cồn bao nhiêu?

Chủng nấm men được tuyển chọn cuối cùng là chủng 34.1, được định danh sơ bộ là Saccharomyces cerevisiae 34.1. Sau khi lên men dịch tinh bột và dịch malt, dịch chưng cất của chủng này đạt độ cồn 11,55%, cao nhất trong các chủng thử nghiệm.

4. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Saccharomyces cerevisiae 34.1 gồm những thông số nào?

Qua các thí nghiệm khảo sát đơn yếu tố, điều kiện nuôi cấy tối thích cho chủng 34.1 được xác định là: nồng độ đường glucose đạt 3%, hàm lượng peptone bổ sung đạt 10 g/l, và độ pH ban đầu của môi trường là pH = 6.

5. Thử nghiệm hoạt tính Catalase được thực hiện như thế nào và cho kết quả ra sao?

Thử nghiệm Catalase được thực hiện bằng cách lấy sinh khối tế bào của từng chủng lên phiến kính và nhỏ trực tiếp vài giọt dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$. Kết quả cả 3 chủng tiềm năng (22.1, 28.2, 34.1) đều sủi bọt khí mạnh, chứng minh các chủng này mang enzyme catalase và thuộc nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện.


Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Mẫn Văn Hoằng đã thực hiện thành công việc phân lập 50 chủng nấm men từ bánh men thuốc Bắc tại Yên Phong – Bắc Ninh và tuyển chọn được chủng ưu tú Saccharomyces cerevisiae 34.1 có hoạt lực lên men mạnh với độ cồn sau chưng cất đạt 11,55%. Công trình cũng đã xác định chính xác các thông số nuôi cấy tối ưu cho chủng này gồm nồng độ glucose 3%, peptone 10 g/l và pH ban đầu bằng 6. Đây là kết quả thực nghiệm có giá trị khoa học và cung cấp dữ liệu thực tiễn tin cậy cho các nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh trong sản xuất rượu truyền thống và công nghiệp.