Nghiên cứu phân lập thực khuẩn thể ly giải Vibrio spp. gây bệnh trên tôm

Nghiên cứu phân lập thực khuẩn thể ly giải vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh trên tôm tại Quảng Ninh, một giải pháp sinh học tiềm năng cho ngành nuôi trồng.

• Tác giả: Ngo Thi Huyen Trang
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập và đánh giá khả năng ly giải vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh trên tôm của thực khuẩn thể thu thập tại tỉnh Quảng Ninh
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về phân lập thực khuẩn thể ly giải Vibrio trên tôm

Phân lập thực khuẩn thể ly giải Vibrio là một phương pháp sinh học tiên tiến trong điều trị bệnh trên tôm nước lợ. Vi khuẩn Vibrio spp. gây ra các bệnh vibriosis nghiêm trọng, đặc biệt là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND), làm gây thiệt hại kinh tế lớn cho các trang trại nuôi tôm. Thực khuẩn thể (bacteriophage) là những vi khuẩn gây bệnh tự nhiên của Vibrio, có khả năng ly giải mạnh mẽ và có thể được ứng dụng trong phòng trừ bệnh. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và đánh giá khả năng ly giải vi khuẩn Vibrio của các thực khuẩn thể từ môi trường tự nhiên tại vùng nuôi tôm Quảng Ninh.

1.1. Bệnh vibriosis trên tôm nước lợ

Bệnh vibriosis là những bệnh nhiễm vi khuẩn Vibrio gây tổn thương nặng nề trên tôm. Các triệu chứng bao gồm hoại tử gan tụy, bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) và viêm gan tụy. Vi khuẩn Vibrio có khả năng tấn công nhanh, gây tỷ lệ chết cao trên tôm nuôi. Các yếu tố như mật độ nuôi, chất lượng nước và tình trạng miễn dịch của tôm ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của bệnh.

1.2. Vai trò của thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh

Thực khuẩn thể (bacteriophage) là những sinh vật có khả năng ly giải vi khuẩn Vibrio một cách hiệu quả. Đây là giải pháp thay thế an toàn hơn so với kháng sinh. Phương pháp phòng trừ bằng thực khuẩn thể giúp giảm khối lượng vi khuẩn gây bệnh, nâng cao sức khỏe tôm nuôi mà không gây kháng thuốc.

II. Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn Vibrio

Phân lập vi khuẩn Vibrio spp. từ mẫu tôm bệnh và nước ao nuôi là bước quan trọng đầu tiên. Các mẫu được thu thập từ các ao nuôi tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tại Quảng Ninh. Sau đó, mẫu được nuôi cấy trên môi trường TCBS ở 37°C trong 24 giờ để phân lập các chủng Vibrio tiềm năng. Định danh vi khuẩn được thực hiện thông qua phân tích trình tự gen 16S rRNA so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI), xác định chính xác các chủng vi khuẩn nguy hiểm.

2.1. Phương pháp phân lập và sàng lọc

Phương pháp phân lập sử dụng môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) là chọn lọc đặc biệt cho Vibrio. Các chủng được tuyển chọn dựa trên hình thái khuẩn lạc đặc trưng. Sàng lọc thực khuẩn thể được tiến hành từ mẫu nước ao bằng phương pháp kháng thể, xác định những thực khuẩn thể có khả năng ly giải vi khuẩn Vibrio hiệu quả nhất.

2.2. Định danh trình tự 16S rRNA

Định danh trình tự 16S rRNA là phương pháp phân tích di truyền thực tế nhất. DNA của các chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng PCR (Polymerase Chain Reaction), sau đó so sánh với các chủng tham chiếu trong cơ sở dữ liệu quốc tế, giúp xác định chính xác loài và chủng Vibrio.

III. Phân lập và tinh sạch thực khuẩn thể ly giải Vibrio

Phân lập thực khuẩn thể là giai đoạn quan trọng để tìm kiếm những sinh vật có khả năng ly giải vi khuẩn Vibrio mạnh mẽ. Phương pháp phân lập sử dụng kỹ thuật nhỏ giọt trên môi trường thạch hai lớp với vi khuẩn ký chủ (V. alginolyticus D1) như chất rắn nền. Sau khi phân lập được thực khuẩn thể C1 và C1 với khả năng ly giải Vibrio tiềm năng, tiến hành tinh sạch bằng cách lấy một vết tan đơn và nuôi cấy lặp lại trên môi trường mới để đạt độ tinh sạch cao nhất.

3.1. Kỹ thuật phân lập bằng phương pháp nhỏ giọt

Phương pháp nhỏ giọt (spot method) trên môi trường thạch hai lớp là kỹ thuật chuẩn để phân lập thực khuẩn thể. Lớp dưới chứa vi khuẩn ký chủ Vibrio, lớp trên là môi trường thạch có chứa các thực khuẩn thể. Sau ủ 24-48 giờ, những vết tan xinh hình tròn cho biết hoạt tính ly giải mạnh mẽ của thực khuẩn thể đó.

3.2. Quy trình tinh sạch và tuyển chọn

Tinh sạch thực khuẩn thể được thực hiện qua nhiều lần lấy vết tan đơn. Lựa chọn những thực khuẩn thể có khả năng ly giải Vibrio cao nhất dựa trên kích cỡ và hình dạng vết tan. Đánh giá khả năng ức chế được thực hiện thông qua các phép đo mật độ quang học (OD) và quan sát hình thái vi khuẩn để chọn chủng thực khuẩn thể tốt nhất.

IV. Đánh giá khả năng ly giải và các yếu tố ảnh hưởng

Đánh giá khả năng ly giải vi khuẩn của thực khuẩn thể C1 được thực hiện thông qua nhiều thí nghiệm in vitro. Tỷ lệ lây nhiễm (MOI) là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả ly giải Vibrio. Đường cong sinh trưởng đơn bậc của thực khuẩn thể được xây dựng để hiểu rõ chu kỳ sống của nó. Ngoài ra, các điều kiện như nhiệt độ và pH cũng ảnh hưởng lớn đến sự ổn định của thực khuẩn thể, quyết định khả năng bảo quản và ứng dụng thực tế của nó trong điều trị bệnh trên tôm.

4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ lây nhiễm MOI

Tỷ lệ lây nhiễm (MOI) định nghĩa số lượng thực khuẩn thể trên một tế bào vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy MOI khác nhau ảnh hưởng đến hiệu quả ly giải Vibrio và đường cong sinh trưởng của vi khuẩn. Khi MOI tăng, tốc độ ly giải nhanh hơn, nhưng cần tìm điểm cân bằng tối ưu để đạt hiệu quả cao nhất.

4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới ổn định

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố chính ảnh hưởng sự ổn định của thực khuẩn thể C1. Thí nghiệm cho thấy thực khuẩn thể có hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 25-30°C và pH 7.0-8.0. Các điều kiện ngoài khoảng này làm giảm khả năng ly giải và thời gian bảo quản. Bảo quản ở nhiệt độ thấp (4°C) giúp duy trì hiệu lực lâu dài của thực khuẩn thể trong ứng dụng thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Dựa trên vị trí địa lý và tự nhiên ưu đãi, Việt Nam đang đẩy mạnh ngành công nghiệp nuôi trồng và chế biến thuỷ sản. Kim ngạch xuất khẩu tôm của Việt Nam đã đạt 4,3 tỷ USD năm 2023, tăng 13-14% so với năm 2022. Ðịnh hướng đến năm 2025, chế biến xuất khẩu thủy sản tiếp tục là động lực thúc đẩy phát triển nuôi trồng thuỷ sản, khai thác thuỷ sản và mang lại nhiều lợi ích kinh tế ngành, nâng cao thu nhập và đời sống lao động nghề tôm. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng tôm tiếp tục phải hứng chịu sự xuất hiện của nhiều loại dịch bệnh gây chết hàng loạt.

Trong đó, bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. hay còn gọi là vibriosis là một trong những nguyên nhân gây bệnh chính ở tôm, ước tính gây thiệt hại khoảng 1 tỷ USD mỗi năm trên toàn thế giới. Tiêu biểu, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) do Vibrio parahaemolyticus và bệnh phân trắng (White Feces Disease, WFD) do Vibrio alginolyticus là một trong những bệnh nguy hiểm xảy ra phổ biến và gây thiệt hại đối với nghề nuôi tôm trong những năm gần đây. Sử dụng kháng sinh để ngăn ngừa và điều trị nhiễm khuẩn Vibrio spp.

đã được áp dụng ở nhiều nơi, dẫn đến sự xuất hiện các chủng kháng kháng sinh. Do vậy, các giải pháp nuôi trồng tôm không sử dụng kháng sinh mà vẫn đảm bảo năng suất nuôi trồng tôm đã và đang được nghiên cứu, phát triển trên toàn thế giới. Việc sử dụng các chủng vi khuẩn probiotic có khả năng tạo ra kháng sinh sinh học, cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh và nâng cao hệ miễn dịch của tôm đã và đang được sử dụng. Nhược điểm của giải pháp này là thời gian phát triển của vi khuẩn chậm và nhiều vi khuẩn probiotic không thể phát triển ở điều kiện thực tế.

Trước bối cảnh đó, thực khuẩn thể (bacteriophage) đã trở thành một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn. Nhờ đặc tính ly giải tế bào vi khuẩn chủ, khả năng phát tán và tính đặc hiệu, thực khuẩn thể được sử dụng trong phòng trừ vi khuẩn Erwinia amylovora trên cây đào và Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris gây bệnh héo xanh và đốm trên cà chua. Hơn nữa, thực khuẩn thể cũng được chứng minh đặc hiệu và an toàn trong ức chế vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về phân lập TKT và đánh giá hoạt tính ly giải một cách hệ thống trên các chủng Vibrio gây bệnh tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam.

Chính vì tiềm năng 2 nghiên cứu và ứng dụng của thực khuẩn thể, đề tài: “Nghiên cứu phân lập và đánh giá khả năng ly giải vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh trên tôm của thực khuẩn thể thu thập tại tỉnh Quảng Ninh” được thực hiện nhằm tạo ra bộ chủng giống và hướng đến mục tiêu sản xuất chế phẩm thực khuẩn thể nhằm kiểm soát các vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên tôm. Mục đích của đề tài: Phân lập được vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên tôm và thực khuẩn thể có khả năng lây nhiễm và ly giải vi khuẩn Vibrio từ các mẫu nước ao nuôi tôm tại tỉnh Quảng Ninh. Nội dung nghiên cứu: (1) Phân lập và định danh các chủng Vibrio spp.

từ mẫu tôm bệnh và nước ao nuôi tôm. (2) Phân lập và sàng lọc thực khuẩn thể có khả năng ly giải các chủng Vibrio phân lập được. (3) Đánh giá khả năng ly giải vi khuẩn Vibrio của thực khuẩn thể được tuyển chọn. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.

Tình hình dịch bệnh và các tác nhân gây bệnh vibriosis trên tôm 1. Tình hình dịch bệnh trên tôm nước lợ Tại Việt Nam, diện tích thả nuôi tôm nước lợ của 6 tháng đầu năm 2023 đạt 656 nghìn ha, tăng 6,4% so với cùng kỳ năm 2022, trong đó tôm sú là 605 nghìn ha, tôm thẻ chân trắng là 51 nghìn ha. Sản lượng tôm các loại nửa đầu năm 2023 ước tính đạt 467 nghìn tấn, tăng 4,1% so với cùng kỳ năm 2022. Trong đó, sản lượng tôm sú 119,3 nghìn tấn, tăng 1,2%, tôm thẻ chân trắng 312,5 nghìn tấn, tăng 5,2%.

Kim ngạch xuất khẩu tôm đạt 1,56 tỷ USD, chiếm 38% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cả nước [1]. Tuy nhiên, diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại là gần 21.250 ha tại 22 tỉnh, thành phố trong năm 2023, tăng 7,9% so với cùng kỳ năm trước. Thiệt hại chủ yếu được ghi nhận ở các mô hình nuôi tôm quảng canh, quảng canh cải tiến và tôm lúa, nơi mà nguồn nước dễ bị ô nhiễm và chịu nhiều tác động của con người. Các tác nhân gây bệnh thường là vi rút (hội chứng Taura, vi rút đầu vàng), vi khuẩn (hội chứng chết sớm/ bệnh hoại tử gan tụy cấp tính, hội chứng phát quang, hội chứng phân trắng), bào tử (bệnh microsporidosis) và ký sinh trùng (bệnh mang amip).

Thiệt hại chủ yếu là do vi khuẩn gây bệnh đốm trắng, hoại tử gan tụy cấp tính, hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô và đỏ thân. Các bệnh trên được xác định và thuộc nhóm bệnh vibriosis do vi khuẩn Vibrio spp. Không chỉ tôm, bệnh này còn gây tử vong hoàn toàn cho nuôi trồng thủy sản biển và động vật có vỏ bị nhiễm bệnh trong các trại giống và ao nuôi thương phẩm [2]. Vibriosis là bệnh gây bởi vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, V.

Cuối năm 2019, bệnh này được gọi là “bệnh hậu ấu trùng thủy tinh” khiến tỷ lệ tôm chết hàng loạt (khoảng 90%) trong vòng chưa đầy 48 giờ bị nhiễm bệnh tại các trại sản xuất giống tôm ở Trung Quốc [4]. Ngoài yếu tố mầm bệnh, các yếu tố môi trường như thay đổi độ mặn, nhiệt độ và oxy hòa tan thấp trong nước ao nuôi tôm có thể khiến vi khuẩn nhân lên nhanh chóng trong máu tôm, từ đó gây bùng phát dịch [5]. Bệnh vibriosis không chỉ gây thiệt hại lớn với ngành nuôi tôm thế giới mà còn gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm ở Việt Nam. Tôm nuôi bị các 4 bệnh phổ biến như hoại tử gan tuỵ cấp tính, bệnh phân trắng, bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô, bệnh do vi bào tử trùng, hội chứng phân trắng.

Năm 2022, tổng diện tích nuôi tôm bị thiệt hại là trên 23,4 nghìn ha, tăng 15,5% so với năm 2021. Trong năm 2022, tổng diện tích tôm nước lợ xác định được do dịch bệnh là trên 7,1 nghìn ha, chiếm 30,4% diện tích tôm bị thiệt hại. Theo số liệu đầu năm 2023, cả nước có trên 1,6 nghìn ha tôm nuôi tại 6 tỉnh bị thiệt hại với tổng diện tích xác định được bệnh là khoảng 688 ha, chiếm 42,7% tổng diện tích tôm thiệt hại chủ yếu tại tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh và các địa phương khác. Các bệnh vibriosis điển hình trên tôm nước lợ 1.

Bệnh hoại tử gan tuỵ cấp tính Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND) trước đây gọi là hội chứng tôm chết sớm là một bệnh nghiêm trọng trên tôm do V. paraheamolyticus gây ra. AHPND được báo cáo lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2009, sau đó được báo cáo ở các nước Châu Á khác (Bangladesh, Trung Quốc, Malaysia, Philippines, Thái Lan và Việt Nam), Bắc Mỹ (Mexico và Hoa Kỳ) và Trung Mỹ (Costa Rica) [6]. Bệnh AHPND đã được Tổ chức Thú y Thế giới liệt kê là bệnh nguy hiểm đối với tôm vào năm 2017.

Bệnh gây chết hàng loạt đến 100% trong vòng 30–35 ngày sau khi thả hậu ấu trùng vào ao nuôi tôm, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu trong thập kỷ qua do bệnh lý diễn ra nhanh chóng, nguyên nhân phức tạp và đặc điểm lan rộng của bệnh. Ngoài ra, các chủng V. punensis cũng gây ra bệnh này nhưng chiếm ở mức thấp. Tác nhân gây bệnh được xác định là hai loại độc tố giống Pir là PirA và PirB được mã hóa bởi một plasmid [7].

Hai loài tôm Penaeus vannamei và Penaeus monodon đã được chứng minh là dễ nhiễm bệnh này. Các dấu hiệu lâm sàng có thể nhìn thấy bao gồm chán ăn, chậm lớn, lờ đờ, bơi lội thất thường, gan tụy nhợt nhạt đến trắng, đường tiêu hóa rỗng, vỏ mềm và các đốm hắc tố trong gan tụy. Đường tiêu hóa bên trong của vật chủ (đặc biệt là ruột giữa trước, manh tràng, dạ dày và gan tụy) bị ảnh hưởng bởi các chủng vi khuẩn gây bệnh, làm ảnh hưởng đến phản ứng phòng vệ toàn diện [8]. Phân tích mô học của gan tụy cho thấy các tế bào biểu mô bị bong tróc, hoại tử biểu mô ống và thâm nhiễm tế bào máu.

Các quá trình viêm và 5 sự hình thành hắc tố của mô ống cũng có thể được quan sát thấy bằng phương pháp chụp cắt mặt của tế bào gan tuỵ. Sự xâm nhập của Vibrio bắt đầu trong dạ dày tôm và sau đó lan đến vùng thượng thận nơi chất độc được giải phóng [9]. Bệnh phân trắng Bệnh phân trắng (White feces disease, WFD) thường được phát hiện khi quan sát thấy các chuỗi phân màu trắng nổi trên mặt ao và tôm đột ngột giảm lượng ăn, tôm chậm lớn hoặc chết nếu không điều trị kịp thời, gây thiệt hại kinh tế lớn cho các trang trại nuôi tôm [10]. Bệnh có các biểu hiện đặc trưng là phân lỏng, đường ruột có màu vàng nâu chuyển dần sang màu trắng sữa.

Bệnh phân trắng hiện chưa rõ nguyên nhân thực sự nhưng vi khuẩn Vibrio spp. là tác nhân thường gặp với tỉ lệ nhiễm trên 40% trên tôm nhiễm bệnh phân trắng. Trương Minh Út và cộng sự (2021) đã cảm nhiễm tôm với hai tổ hợp vi khuẩn V. parahaemolyticus cho thấy tôm có các dấu hiệu bệnh lý đường ruột như phân lỏng và màu trắng sữa đặc trưng tương tự như tôm thẻ chân trắng bị bệnh phân trắng thu từ ao nuôi [11].

Khi hệ thống miễn dịch yếu, tôm cũng bị nhiễm động vật nguyên sinh gây ra hiện tượng vỏ màu sẫm [12]. Bệnh này đã được báo cáo từ ngành nuôi tôm sú (P. monodon) và tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) ở một số nước châu Á như Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia.

Quan sát mô ruột cho thấy thành ruột mỏng kết hợp với sự bong ra của các tế bào biểu mô ruột và sự giảm hoặc biến mất của vi nhung mao. Mô bệnh học của tôm bị bệnh phân trắng cũng cho thấy những tổn thương đáng chú ý ở gan tụy [13]. Đặc điểm phân loại và hình thái của vi khuẩn Vibrio Thuật ngữ “Vibrio” xuất phát từ tiếng Latin “vibrate” [14]. Các tài liệu sớm nhất về một bệnh nhiễm trùng Vibrio có trước kỷ nguyên Kitô giáo trong thế kỷ thứ 5 trước Công nguyên.