Nghiên cứu: Bước đầu phân lập hợp chất từ lá cây Mắc khén (Zanthoxylum rhetsa)

Tài liệu nghiên cứu khoa học về quá trình phân lập một số hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate của lá cây Mắc khén (Zanthoxylum rhetsa).

• Tác giả: Nguyễn Thị Mai Trinh
• Người hướng dẫn: Pgs. Vũ Đình Hoàng
• Trường học: Đại học Bách khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ Hóa dược và Bảo vệ Thực vật
• Đề tài: Bước đầu phân lập một số hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate của lá cây Mắc khén (Zanthoxylum rhetsa (Roxb.))
• Loại tài liệu: Đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây Mắc khén Zanthoxylum rhetsa

Cây Mắc khén (Zanthoxylum rhetsa (Roxb.)), còn được gọi là cây Sẻn hôi, thuộc chi Muồng truổng (Zanthoxylum), họ Cam (Rutaceae). Đây là một loài cây có nhiều công dụng và hoạt tính sinh học vô cùng quý giá. Cây Mắc khén phân bố rộng rãi ở châu Á, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Trong y học cổ truyền, lá Mắc khén được sử dụng để chữa trị nhiều bệnh lý khác nhau. Tuy nhiên, tại Việt Nam, công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này vẫn còn rất hạn chế. Việc phân lập hợp chất từ lá Mắc khén là cần thiết để khai thác tiềm năng khoa học và ứng dụng thực tiễn của nó.

1.1. Đặc điểm phân loại học của Zanthoxylum rhetsa

Zanthoxylum rhetsa thuộc họ Cam (Rutaceae), một trong những họ lớn nhất thế giới với khoảng 150 chi và gần 1.600 loài. Chi Muồng truổng (Zanthoxylum) có khoảng 250 loài phân bố ở châu Á, châu Phi, Úc, Bắc Mỹ, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, một số ít ở ôn đới. Cây Mắc khén là một loài đặc trưng của các hệ sinh thái rừng tropicale tự nhiên.

1.2. Công dụng và ứng dụng truyền thống

Lá Mắc khén được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian Đông Nam Á. Theo các ghi chép truyền thống, cây này có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, giúp thanh nhiệt và giải độc. Nhiều cộng đồng địa phương sử dụng lá Mắc khén để chế biến thành trà hoặc tinh dầu để điều trị các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa và hô hấp.

II. Phương pháp phân lập hợp chất từ cây Mắc khén

Phân lập hợp chất từ lá Mắc khén được thực hiện thông qua các bước chiết xuất và tinh sạch có hệ thống. Trong đồ án tốt nghiệp tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, các nhà khoa học đã áp dụng chiết xuất với ethyl acetate để tách cặn chiết từ lá cây. Đây là một trong những phương pháp tối ưu nhất để thu được các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính cao. Quá trình phân lập hợp chất bao gồm nhiều bước: chiết xuất, cô đặc, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và phân tích cấu trúc bằng các phương pháp phổ tích.

2.1. Quy trình chiết xuất ethyl acetate

Chiết xuất ethyl acetate là phương pháp được lựa chọn để tách các hợp chất tích cực từ lá Mắc khén. Ethyl acetate là dung môi cực tính trung bình, có khả năng hòa tan tốt các alkaloid, flavonoid và các hợp chất phenolic. Cặn chiết ethyl acetate sau đó được cô đặc dưới áp suất thấp để loại bỏ dung môi và tập trung các hoạt chất.

2.2. Kỹ thuật sắc ký và phân tích cấu trúc

Sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng được sử dụng để tách và tinh sạch các hợp chất riêng lẻ. Các hợp chất đơn chiếm được kiểm định bằng các phương pháp phổ NMR, khối phổ MS và khối phổ nối khối. Những kỹ thuật này cho phép xác định cấu trúc phân tử và tính chất hóa học của từng hợp chất một cách chính xác.

III. Kết quả phân lập các hợp chất từ Zanthoxylum rhetsa

Từ cặn chiết ethyl acetate của lá Mắc khén, các nhà nghiên cứu đã thành công phân lập được một số hợp chất có hoạt tính sinh học. Những hợp chất được phân lập bao gồm các loại alkaloid, flavonoid và hợp chất phenolic khác nhau. Mỗi hợp chất phân lập được phân tích và xác định cấu trúc chi tiết. Các kết quả này không chỉ giúp làm rõ thành phần hóa học của lá Mắc khén mà còn là cơ sở để phát triển các sản phẩm dược phẩm mới. Nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.

3.1. Nhóm hợp chất alkaloid

Alkaloid là một trong những nhóm hợp chất quan trọng được phân lập từ lá Mắc khén. Các alkaloid này có nhiều tác dụng sinh học như kháng khuẩn, chống oxy hóa và giảm viêm. Những alkaloid độc đáo từ chi Zanthoxylum đặc biệt được quan tâm trong nghiên cứu dược phẩm tự nhiên hiện đại.

3.2. Các hợp chất flavonoid và phenolic

Ngoài alkaloid, flavonoid và hợp chất phenolic cũng được phân lập thành công từ lá Mắc khén. Những hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ sức khỏe. Flavonoid là những chất hóa học thiên nhiên có cấu trúc đa dạng và giá trị ứng dụng cao trong công nghiệp dược phẩm.

IV. Ý nghĩa khoa học và ứng dụng thực tiễn

Phân lập hợp chất từ lá Mắc khén có ý nghĩa khoa học sâu sắc trong lĩnh vực hóa dược và công nghệ hóa dược. Kết quả nghiên cứu này cung cấp dữ liệu khoa học chắc chắn về thành phần hóa học của loài cây này, tạo cơ sở cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học sâu hơn. Từ đó, có thể phát triển các sản phẩm dược phẩm hoặc bổ sung dinh dưỡng mới từ hợp chất tự nhiên của Mắc khén. Đây cũng là bước đầu quan trọng trong việc bảo tồn và khai thác bền vững các loài cây y dược quý giá của Việt Nam, góp phần phát triển công nghệ sinh học và nông nghiệp sinh thái tại nước ta.

4.1. Ứng dụng trong phát triển dược phẩm

Các hợp chất phân lập từ Mắc khén có tiềm năng phát triển thành các thuốc hoặc chế phẩm dược mới. Hoạt tính sinh học của những hợp chất này cần được nghiên cứu thêm thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo. Kết quả có thể dẫn đến sản xuất dược phẩm có hiệu quả cao trong điều trị các bệnh lý cụ thể.

4.2. Bảo tồn và phát triển bền vững

Hiểu rõ thành phần hóa học của lá Mắc khén giúp xây dựng chiến lược bảo tồn hiệu quả cho loài cây quý này. Đồng thời, khai thác bền vững các hợp chất hoạt tính từ Mắc khén có thể tạo giá trị kinh tế cho cộng đồng nông dân và phát triển nông thôn. Nghiên cứu này đóng góp vào kho tàng kiến thức về thực vật Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ CÂY MẮC KHÉN .1 Vài nét về họ Rutaceae .2 Giới thiệu chung về chi Zanthoxylum. 2 Lịch sử chi Zanthoxylum. 2 Thực vật học chi Zanthoxylum.

2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học chi Zanthoxylum. 2 Công dụng của một số loài trong chi Zanthoxylum .3 Tổng quan tài liệu về cây Mắc khén. 12 Phân loại khoa học. 12 Những tên gọi khác nhau của cây Mắc Khén.

12 Mô tả cây, phân bố, thu hái, chế biến. 12 Thành phần hóa học cây Mắc khén. 16 Hoạt tính sinh học. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Đối tượng nghiên cứu và phương pháp xử lý mẫu, tạo các cặn chiết .2 Phương pháp sắc ký để phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất.

20 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký [2]. 20 Cơ sở phương pháp sắc ký [2]. 21 Phân loại các phương pháp sắc ký [9]. 21 Sắc ký lớp mỏng [2] .3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.

24 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR). 24 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS). 24 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy).1 Xử lý mẫu thực vật và điều chế các cặn chiết từ mẫu thực vật .2 Phân lập các hợp chất từ cặn chiết.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được. THẢO LUẬN KẾT QUẢ .1 Xác định cấu trúc hợp chất 1 (β-sitosterol) .2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (3β-hydroxycholest-5 ene-7- one) 34 4.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 3 (hesperidin).

47 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 48 DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance spectroscopy 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy BHT Hydroxyl toluene butylated CDCl 3 Deuterated chloroform DMDO-d 6 Dimethyl sulfoxide - d6 DEPT Distoritionless Enhancement by Polirisation Tranfer DNA Deoxyribonucleic acid DPPH 2,2-diphenyl-1 picryl hydraryl EC 50 Half maximal effective concentration 50% nồng độ tác dụng tối đa ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectra EI-MS Electron Ionization Mass Spectra PMR Proton Mas Spectra HDF Human Dermal Fibroblasts HETCOR Heteronuclear Corelation Spectroscopy HIV Human Immunodeficiency Virus HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IC 50 Half Maximal Inhibitory Concentration 50% nồng độ ức chế tối đa MAO-B Enzyme Monoamin Oxydase B MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MRSAB Methicillin Resistant Staphylococcus aureus Bacteremia SKLM Sắc ký lớp mỏng s singlet d doublet t triplet q quartet dd double doublet m multiplet ppm Part per million J Hằng số tương tác spin-spin δ Độ dịch chuyển hóa học DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Zanthoxylum rhetsa (Roxb.; cành mang lá và quả[16] [6] .2 Quả và hạt Zanthoxylum rhetsa (Roxb.3 Hiệu ứng độc tế bào của các phân đoạn khác nhau của Z. rhetsa ở các nồng độ khác nhau (µg / mL), kháng tế bào u ác tính B16-F10. Dữ liệu được biểu thị bằng trung bình của ba thí nghiệm độc lập.

Quercetin đã được sử dụng như là sự kiểm soát tích cực [31].4 Hiệu ứng độc tế bào của các hợp chất phân lập từ Z. rhetsa ở các nồng độ khác nhau (µg / mL) đối với các tế bào u ác tính B16-F10. Dữ liệu được biểu thị bằng trung bình của ba thí nghiệm độc lập. Quercetin đã được sử dụng như là sự kiểm soát tích cực [31].1 Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ lá cây Zanthoxylum rhetsa .2 Sơ đồ phân lập hợp chất 1, 2 và 3 từ cặn chiết ethyl acetate của lá cây Zanthoxylum rhetsa .1 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 .2 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 .3 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (β-sitosterol) .4 Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 .7 Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 .9 Phổ DEPT của hợp chất 2 .10 Phổ HSQC của hợp chất 2 .11 Phổ HMBC của hợp chất 2 .12 Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (3β-hydroxycholest-5 ene-7-one) .13 Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 .16 Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 .19 Phổ DEPT của hợp chất 3 .20 Phổ HSQC của hợp chất 3 .21 Phổ HMBC của hợp chất 3 .22 Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 (hesperidin).

46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất tinh khiết (53) - (58) kháng khuẩn trong thí nghiệm khuếch tán giếng thạch agar [24] .1 Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất 2 và của hợp chất 3β- hydroxycholest-5 ene-7-one .2 Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 3 và của hợp chất Hesperidin. TỔNG QUAN VỀ CÂY MẮC KHÉN 1.1 Vài nét về họ Rutaceae Họ Rutaceae (họ Cửu lý hương hay họ Vân hương, còn gọi là họ Cam hay họ Cam chanh hoặc họ Cam quýt) là một họ thực vật trong bộ Bồ hòn (Sapindales) [33]. Họ Cam được nghiên cứu từ thời Linnaeus (1753) với 7 chi và 19 loài [1], [11]. Công trình nghiên cứu tương đối toàn diện và có hệ thống về họ Cam cuối thế kỷ 19 phải kể đến A.

Tác giả là người đầu tiên nghiên cứu khá kỹ về các đặc điểm từ hình thái ngoài của cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản, đến số lượng nhiễm sắc thể, phân bố địa lý, cổ sinh vật, mối quan hệ thân cận giữa các taxon trong họ Cam. Tác giả cũng là người đầu tiên định hướng cho việc sử dụng tổng hợp các đặc điểm trong phân loại họ Cam, điều đó cho phép phân định giữa các taxon có căn cứ vững chắc hơn. Vì vậy, sau này nhiều công trình nghiên cứu về họ Cam đều dựa trên nền tảng hệ thống của A. Engler, sử dụng các đặc điểm mà ông đã lựa chọn.

Tác giả đã chia họ Cam thành 6 phân họ (subfamily), 10 tông (tribus) và 25 phân tông (subtribus), khoảng 150 chi và gần 1.600 loài trên toàn thế giới [35]. Người đầu tiên nghiên cứu họ Cam ở Việt Nam là Loureiro (1790). Tác giả đã mô tả 6 chi và 12 loài có ở Việt Nam [23]. Trần Kim Liên (2003) trong công trình “Danh lục các loài thực vật Việt Nam” thống kê và cập nhập danh pháp hiện nay của 27 chi và 128 loài trong họ Cam có ở Việt Nam.

Đây là công trình khái quát cơ bản về họ Cam ở Việt Nam [10]. Gần đây nhất, năm 2012, Bùi Thu Hà với công trình “Nghiên cứu phân loại họ Cam (Rutaceae Juss.) ở Việt Nam” tác giả đã mô tả, vẽ hình chi tiết và đưa ra phân loại các chi và loài cho họ Cam, đồng thời đã công bố ở Việt Nam có 107 loài, 1 phân loài và 3 thứ thuộc 26 chi, 5 tông và 3 phân họ [6]. Đặc điểm hình thái của họ Cam ở Việt Nam: Đa số là cây thân gỗ nhỏ, một số chi cây bụi và thân thảo. Hoa thường mọc thành cụm hoa hình xim với nhiều dạng khác nhau: dạng ngủ, dạng tán, dạng chùy,.Hoa đều, chia thành 4 hoặc 5, có mùi thơm mạnh.

Họ cam thường gặp các kiểu quả: quả nang khi nang mở các hạt 1 dính với các mảnh nang hoặc không dính với các mảnh nang; quả hạch; quả mọng kiểu quả có múi khi quả chín, một phần tế bào ở vỏ quả giữa và vỏ quả trong rời nhau, mỗi lá noãn tạo thành một múi, trong mỗi múi có nhiều hạt [6].2 Giới thiệu chung về chi Zanthoxylum Lịch sử chi Zanthoxylum Chi Hoàng mộc (Zanthoxylum) thuộc họ Cam (Rutaceae). Các loài trong chi này có tên chung bắt nguồn từ Hy Lạp là “Xanthonxylon”, có nghĩa là màu vàng; xylon có nghĩa là gỗ. Vì vậy một số tác giả dùng từ Xanthozylum thay vì gọi chi này là Zanthoxylum. Năm 1757 Linné thành lập nên chi Zanthoxylum và kể từ đó nó bị nhầm lẫn với chi Fagara.

Năm 1896, Engler phân biệt giữa 2 chi này bằng nét đặc trưng: Chi Zanthoxylum có 1 bao hoa, còn chi Fagara có 2 bao hoa. Brizicky đã khám phá ra một số loài trung gian giữa 2 chi, từ đó kết luận chi Zanthoxylum và chi Fagara là một vào năm 1962. Cuối cùng vào năm 1966, Hartley đã gộp 2 chi này làm một dưới cái tên Zanthoxylum. Tuy nhiên, một số người vẫn dùng nhóm Fagara [29], [36].

Thực vật học chi Zanthoxylum Trên thế giới, chi Zanthoxylum có 250 loài cây thân gỗ và cây bụi có lá rụng có nguồn gốc từ ôn đới và cận nhiệt đới. Tại Việt Nam thì chi này có 10 loài. Cây thân gỗ trong chi này có tán lá, ít nhánh và vươn lên đến 20 mét, gai trên thân và cành cây. Lá kép lông chim lẻ, một số ít có 3 lá chét, các lá chét mọc cách hoặc mọc đối, lá mép nguyên hay có răng nhỏ, khe các răng thường có điểm tuyến tinh dầu tương đối to.

Cụm hoa hình chuỳ hoặc ngù, mọc ở đỉnh hoặc ở nách lá. Hoa đơn tính hoặc lưỡng tính. Bao hoa xếp 1-2 vòng. Bộ nhị gồm 4-10 nhị, đỉnh trung đới có một điểm tuyến.

Bộ nhuỵ gồm có 2-5 lá noãn rời, mỗi lá noãn có 1-2 noãn và không dính nhau hoàn toàn. Vòi nhuỵ hợp hoặc rời nhau, hơi cong, núm nhuỵ dạng đầu. Quả nang, vỏ ngoài có nhiều tuyến tinh dầu, khi chín vở quả trong rời nhau, mỗi mảnh quả có từ 1-2 hạt, dính trên cuống noãn phình to, rốn hạt dạng sợi ngắn, phẳng, vỏ hạt dòn, màu nâu đen, bóng. Lá mầm dẹt, phôi rất ngắn [29].

Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học chi Zanthoxylum Việc sàng lọc hóa học sơ bộ đã cho thấy sự phong phú của glycoside, coumarin, flavonoid, phenol và tannin trong dịch chiết ethanol thô của các loài 2 trong chi Hoàng mộc (Zanthoxylum). Tuy nhiên không phát hiện được phytosterol, anthocyanin và phlobatann. Trong Zanthoxylum oxyphyllum và Mắc khén (Zanthoxylum rhetsa) rất phong phú flavonoid, coumarin; 1 lượng phenol và tannin. Zanthoxylum armatum , Zanthoxylum oxyphyllum và Zanthoxylum rhetsa đã hiển thị sự hiện diện đáng kể của tannin, glycoside.

Dịch chiết ethanol thô của lá Zanthoxylum armatum rất phong phú flavonoid, glycoside, tannin và dấu vết của phenol, carbohydrate, coumarin và lignin. Số lượng chất chuyển hóa thứ cấp tối đa được sàng lọc trong chiết xuất ethanol thô của Mắc khén (Zanthoxylum rhetsa) với sự phong phú của flavonoid, glycoside, coumarin, protein, acid amin, tannin tiếp theo là phenol, alkaloid, terpenoid và có dấu vết của carbohydrate và quinones. Hiện tại phân tích định tính khám phá cho khả năng rộng hơn để khai thác hiệu quả và năng suất của các thứ cấp khác nhau chất chuyển hóa từ dịch chiết ethanolic thô của các loài [22], [27], [28], [29], [30]. Alkaloid Alkaloid là hợp chất quan trọng nhất đối với chi Zanthoxylum, bởi vì chúng có mặt ở hầu hết các loài và được tìm thấy trong tất cả các cơ quan thực vật, có nhiều trong thân cây và vỏ rễ.

Các alkaloid chính được phân lập từ chi chia làm hai loại: isoquinoline (benzophenanthridine, benzylisoquinoline, aporphin, protoberberine và berberine) và quinoline.