Luận văn: Phân lập gen mã hóa protein P10 virus lúa lùn sọc đen

Luận văn nghiên cứu phân lập, biểu hiện gen P10 virus lúa lùn sọc đen và ứng dụng tạo kháng thể giúp chẩn đoán bệnh hại lúa tại Việt Nam.

• Tác giả: Phạm Thị Vân
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Xuân Hội
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân lập và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ P10 của virus gây bệnh lúa lùn sọc đen ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về bệnh lúa lùn sọc đen và virus SRBSDV

Bệnh lúa lùn sọc đen (Rice Stripe Virus Disease - RBSDV) là một trong những bệnh vi-rút nguy hiểm nhất gây hại cho cây lúa ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á. Bệnh được gây ra bởi virus lúa lùn sọc đen phương Nam (SRBSDV) - một loại vi-rút thuộc chi Fijivirus, họ Reoviridae. Virus này có cấu trúc vỏ hình đa diện icosahedral kiểu T=13, chứa các protein quan trọng như protein vỏ P10. Rầy lưng trắng (Sogatella furcifera) là vector chính truyền bệnh. Tại Việt Nam, bệnh lúa lùn sọc đen gây thiệt hại kinh tế lớn, làm giảm năng suất và chất lượng lúa. Việc nghiên cứu và phân lập gen P10 có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán, phòng chống bệnh và tạo giống lúa kháng bệnh.

1.1. Triệu chứng và tác hại của bệnh lúa lùn sọc đen

Cây lúa nhiễm bệnh lúa lùn sọc đen thể hiện các triệu chứng đặc trưng như lùn dừa, lá có những vệ sọc đen dài. Bệnh làm cây lúa tươi xanh bị suy giảm, thân ngắn, lá nhỏ và hẹp. Các cây bị nhiễm sớm có thể chết trước khi phát triển, còn cây nhiễm muộn sẽ cho năng suất thấp, hạt không lẫn. Virus SRBSDV gây thiệt hại lên tới 50-100% sản lượng lúa, tùy thuộc vào thời kỳ nhiễm bệnh.

1.2. Đặc điểm của virus SRBSDV và protein vỏ P10

Virus lúa lùn sọc đen là một vi-rút nhân 10 đoạn RNA và chứa 12 loại protein cấu trúc. Trong đó, protein vỏ P10 là một protein ngoài đặc trưng, đóng vai trò quan trọng trong sự nhận biết vỏ vi-rút và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch. Nghiên cứu biểu hiện gen P10 giúp sản xuất protein tái tổ hợp để tạo kháng thể đa dòng.

II. Phương pháp phân lập và nhân dòng gen P10

Phân lập gen P10 từ cDNA phân đoạn S10 của virus SRBSDV là bước quan trọng trong nghiên cứu. Quá trình bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) để nhân bản đoạn gen P10 một cách đặc hiệu. Sau đó, sản phẩm PCR được ghép nối vào vector pGEMT - một vector nhân dòng phổ biến. DNA tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. Việc kiểm tra plasmid tái tổ hợp được thực hiện thông qua phản ứng PCR và giải trình tự nucleotide. Quá trình này cho phép tạo ra các bản sao gen P10 trong lượng lớn, tạo cơ sở cho bước biểu hiện protein tái tổ hợp P10 tiếp theo.

2.1. Nhân bản gen P10 bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR sử dụng các cặp oligonucleotide đặc hiệu để nhân bản đoạn gen P10 từ cDNA của phân đoạn S10. Các điều kiện PCR được tối ưu hóa với nhiệt độ biến tính, ghép nối, và kéo dài phù hợp. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kích thước và độ tinh sạch. Quá trình này tạo ra đoạn DNA P10 có độ dài xác định.

2.2. Ghép nối và kiểm tra vector tái tổ hợp

Đoạn gen P10 được ghép nối vào vector pGEMT sử dụng enzyme DNA ligase. Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, sau đó kiểm tra bằng PCR và giải trình tự DNA. Các khuẩn lạc lac trắng chứa plasmid tái tổ hợp được chọn để nhân dòng gen P10 và tạo DNA mẫu cho bước tiếp theo.

III. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp P10

Sau khi phân lập gen P10 thành công, bước tiếp theo là biểu hiện protein tái tổ hợp P10 trong hệ thống vi khuẩn. Đoạn gen P10 được chuyển từ vector pGEMT vào vector biểu hiện pET28a có khả năng tạo ra protein với tag His6, giúp tinh sạch dễ dàng. Vector tái tổ hợp pET28a/P10 được biến nạp vào E. coli BL21(DE3). Việc cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG được kiểm soát chặt chẽ về nồng độ, nhiệt độ và thời gian. Protein tái tổ hợp P10 được tách chiết từ dịch chiết tế bào vi khuẩn và tinh sạch thông qua cột Ni2+ agarose. Kết quả kiểm tra bằng SDS-PAGE và Western blotting cho thấy hiệu quả biểu hiện cao.

3.1. Thiết kế vector biểu hiện pET28a mang gen P10

Vector pET28a được chọn vì có khả năng biểu hiện protein cao trong E. coli. Đoạn gen P10 được cắt từ plasmid pGEMT/P10 bằng các enzyme giới hạn BamHI và XhoI, sau đó ghép nối vào vector pET28a tương ứng. Plasmid tái tổ hợp pET28a/P10 được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự DNA để xác nhận hướng và vị trí chèn.

3.2. Cảm ứng biểu hiện và tinh sạch protein P10

E. coli BL21(DE3) mang vector pET28a/P10 được cảm ứng bằng IPTG ở nồng độ 0,4-1 mM. Protein tái tổ hợp P10 được tích lũy dưới dạng thể bao gồm. Sau ly tâm, tế bào được hòa tan và tinh sạch protein thông qua cột Ni2+ agarose. Độ tinh sạch được đánh giá bằng SDS-PAGE 12%, cho thấy protein với kích thước dự kiến.

IV. Ứng dụng kháng thể đa dòng kháng P10 trong chẩn đoán SRBSDV

Kháng thể đa dòng kháng protein P10 được gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch bằng cách tiêm protein tái tổ hợp P10 theo lịch định trước. Sau các lần tiêm, huyết thanh được thu lấy và tinh sạch kháng thể IgG bằng cột sắc ký protein A-sepharose. Kháng thể tinh sạch được đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu bằng các kỹ thuật Dot Blot, Western blotting và ELISA. Phương pháp ELISA được sử dụng để phát hiện SRBSDV trong mẫu mô lúa bệnh và rầy truyền bệnh. Kết quả cho thấy kháng thể có độ nhạy cao, có thể phát hiện virus ở nồng độ rất thấp, mở ra ứng dụng thực tiễn trong chẩn đoán sớm bệnh lúa lùn sọc đen.

4.1. Gây đáp ứng miễn dịch và tinh sạch kháng thể

Chuột bạch được tiêm bắp tơ hoặc tĩnh mạch với protein tái tổ hợp P10 pha với adjuvant. Các mũi tiêm tăng cường được thực hiện theo lịch định. Huyết thanh được thu lấy sau 7-10 ngày từ lần tiêm cuối cùng. Kháng thể IgG được tinh sạch từ huyết thanh bằng protein A-sepharose, loại bỏ các immunoglobulin khác và chất ô nhiễm.

4.2. Phát hiện SRBSDV bằng ELISA và ứng dụng thực tiễn

Phương pháp ELISA sử dụng kháng thể đa dòng để phát hiện SRBSDV trong mẫu cây lúa bệnh và rầy. Độ nhạy của kháng thể được đánh giá bằng các mẫu virus pha loãng khác nhau. Kết quả ELISA cho độ hấp thụ OD492 cao, chỉ ra khả năng chẩn đoán tốt. Ứng dụng thực tiễn bao gồm sàng lọc giống lúa kháng bệnh, kiểm tra môi trường giống, phát hiện sớm bệnh trong cộng đồng cây trồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực lâu đời nhất và cũng là cây ngũ cốc quan trọng cung cấp nguồn lƣơng thực cho khoảng 2/3 dân số thế giới. Ở nƣớc ta, cây lúa đã trở thành cây lƣơng thực chủ lực liên quan đến việc làm và thu nhập của khoảng 80% số hộ nông dân. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, ngành trồng lúa đang phải đối mặt với nhiều khó khăn thách thức, nhất là thiên tai, biến đổi khí hậu, đặc biệt là dịch bệnh xảy ra thƣờng xuyên đã ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo. Do các đặc điểm về địa lý và khí hậu, Việt Nam là giao lộ các luồng di chuyển của nhiều loại côn trùng, trung gian truyền dịch; do đó các bệnh virus có diễn biến rất phức tạp, lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại lớn.

Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, bệnh lúa lùn sọc đen (LSĐ) đã bùng phát với diện tích nhiễm bệnh lên tới 5.506 ha, trong đó gần 3.510 ha bị mất trắng. Đến tháng 10/2010 bệnh đã phát triển và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng diện tích nhiễm bệnh lên tới 24. Bằng phƣơng pháp sinh học phân tử, bƣớc đầu nguyên nhân gây bệnh lạ nêu trên đã đƣợc xác định là do virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam (Southern rice black strike dwarf virus - SRBSDV). Đây là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus – 2, thuộc họ Reoviridae.

Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự tƣ̀® S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn RNA sợi đôi. Phân đoạn S10 có kích thƣớc nhỏ nhất, mã hóa một protein vỏ ngoài virus và có độ bảo thủ cao nên thƣờng đƣợc chọn trong các nghiên cứu nhằm phát hiện các virus trong chi Fijivirus. Việc chẩn đoán cây bị nhiễm SRBSDV hiện nay đều đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp RT-PCR nhằm phát hiện phân đoạn RNA sợi đôi của virus có trong mẫu bệnh cây. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, chi phí tốn kém đồng thời không thuận tiện cho việc tiến hành với điều kiện ngoài đồng ruộng.

Việc xác định tác nhân gây bệnh mất nhiều thời gian, chi phí cao đã dẫn tới khó khăn 1 trong việc ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh làm thiệt hại nhiều hecta sản lƣợng lƣơng thực. Vì vậy, việc sớm tìm ra phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh là việc làm vô cùng quan trọng và cấp bách hiện nay. Với mục đích biểu hiên đoan gen P10 mã hoá protein vỏ virus làm tiền đề cho phát triển kit chẩn đoán nhanh , chính xác bệnh lúa lùn sọc đen phƣơng viêc Nam dƣa trên phƣơng pháp ELISA , chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lâp va biểu hiên gen mã hoá protein vỏ P10 của virus gây bệnh lú a lùn soc đen ở Việt Nam” nhằm phục vụ công tác chẩn đoán sớm bêṇ h haị trên đồng ruôṇ g. 2 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS HẠI LÚA Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân chính làm giảm sản lƣợng nông nghiệp, dẫn đến sản lƣợng nông nghiệp không ổn định và gây ra tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu, cân bằng sinh thái bị phá vỡ do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học đã làm cho diễn biến phát sinh dịch và mức độ gây hại của các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào hết. Trong sản xuất nông nghiệp có khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp nhƣ cây ngô, đậu tƣơng… và khoảng 16 loại virus gây hại cho lúa (phụ lục 1). Trong số các virus hại lúa, ngoài Rice hoja blanca virus (một ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một luteovirus, phân bố tại châu Âu) và Rice stripe necrosis virus (một furovirus, phân bố tại châu Phi) thì 13 virus còn lại đều phát hiện thấy tại các nƣớc trồng lúa châu Á.

Tuy nhiên, chỉ có 5 bệnh virus gây hại nghiệm trọng và phổ biến trên lúa là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời [7, 11-13, 16]. Nghề trồng lúa ở Việt Nam đã và đang phải đối mặt với các đợt dịch bệnh virus diễn ra liên tiếp và đang diễn biến rất phức tạp. Trong khi dịch virus vàng lùn và lùn xoắn lá ở miền Nam chƣa kết thúc thì các tỉnh miền Bắc và miền Trung đang phải đối mặt với dịch SRBSDV. Vì vậy, định hƣớng nghiên cứu bệnh virus hại lúa trong giai đoạn hiện nay cần phải có sự kết hợp hài hòa giữa nghiên cứu đối ứng và nghiên cứu dài hơi.

Nghiên cứu đối ứng tập trung vào khâu chỉ đạo sản xuất và phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh từ đó xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả. Trong khi đó , nghiên cứu dài hơi tập trung vào khâu xác định bản chất hệ gen, mức độ đa dạng di truyền, tính độc và mức độ đột biến để xác định danh tính tác nhân gây bệnh, hoàn thiện các quy trình chẩn đoán chính xác, nguy cơ phát sinh chủng mới và tiến tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả tác nhân gây bệnh dựa trên công 3 nghệ gen. Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt môi giới truyền bệnh, trồng giống kháng rầy, luân canh… Gần đây, trƣớc tình hình gây h ại và diễn biến phát dịch bệnh virus rất phức tạp, Nhà nƣớc đã quan tâm nhiều đến việc đầu tƣ nghiên cứu và áp dụng các thành tựu khoa học và công nghệ trên thế giới trong việc phát hiện và phòng chống bệnh virus lúa, vì vậy đã nâng cấp một bƣớc đáng kể năng lực trong nghiên cứu và phòng chống virus hại lúa ở Việt Nam. Một số cơ quan nghiên cứu nhƣ Viện Bảo vệ thực vật và Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã hoàn thiện quy trình chẩn đoán dựa trên kháng huyết thanh, RT-PCR và đã sản xuất đƣợc kháng huyết thanh cho virus vàng lùn và lùn xoắn lá; đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho virus lúa cỏ (Rice grassy stunt virus-RGSV), lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus-RRSV), lùn sọc đen (Rice black streaked dwarf virus-RBSDV), lúa sọc (Rice stripe virus-RSV), tungro (Rice tungro spherical virus-RTSV) và lùn sọc đen phƣơng Nam (Southern rice black strike dwarf virus-SRBSDV).

Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng lùn và lùn xoắn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật. Các nghiên cứu về virus hại lúa tại Viện Di truyền và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các nghiên cứu phân tử nhƣ giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng công nghệ gen nhƣ công nghệ RNAi. Hiện Viện Di truyền đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn và lùn xoắn lá lúa trên Ngân hàng gen; đã xác định các gen quan trọng và các đoạn trình tự bảo thủ của các gen virus (không trùng lặp với trình tự gen của cây chủ); đã thiết kế các vector RNAi mang gen có khả năng làm bất hoạt virus và đã nhận đƣợc một số cây chuyển gen. Gần đây, trong một hợp tác nghiên cứu với Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia Nhật Bản, Viện Di truyền đã sản xuất đƣợc 7 bộ kit chẩn đoán 7 loại virus gây bệnh trên lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: virus lúa cỏ (RGSV), lùn xoắn lá (RRSV), lùn sọc đen (RBSDV), lúa sọc (RSV), tungro (Rice tungro spherical virus-RTSV), tungro (Rice tungro bacilliform virus RTBV), bệnh lúa lùn 4 (Rice dwarf virus-RDV) và vết u lùn lúa (Rice gall dwarf virus-RGDV) với số lƣợng đủ cho hợp tác nghiên cứu và chẩn đoán.

Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong thời gian qua là đáng ghi nhận nhƣng vẫn chƣa thể đáp ứng đƣợc với diễn biến phức tạp của dịch virus hiện nay, đặc biệt là SRBSDV. Vì vậy các nghiên cứu về virus hại lúa cần phải nâng lên một bƣớc, tập trung vào các nghiên cứu chuyên sâu mang tính chất dài hơi để giải quyết tận gốc căn nguyên nhƣ các nghiên cứu về bản chất phân tử, diễn biến phát dịch và các biện pháp kiểm soát dựa trên kỹ thuật phân tử nhƣ siêu biểu hiện gen, bất hoạt gen và đột biến. BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN VÀ VIRUS SRBSDV 1. Bệnh lúa lùn sọc đen 1.

Tình hình bệnh trên thế giới Bệnh lúa LSĐ là bệnh do virus lúa lùn sọc đen (Rice black streaked dwarf virus-RBSDV) gây ra và đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1952 [27]. RBSDV đƣợc ghi nhận gây hại và gây thành dịch ở các nƣớc Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc. Đợt dịch bệnh đầu tiên ở Nhật bản đƣợc ghi nhận trên ngô vào những năm 1957 – 1961, rồi trên lúa và ngô những năm 1965 – 1967. Ở Trung Quốc dịch bệnh đã xảy ra vào năm 1963 và sau đó 1965 – 1967 trên lúa, ngô, lúa mì và đại mạch.

Tỷ lệ bệnh RBSDV đạt cao điểm vào các năm 1975 và 1976 [22]. Ngoài những đợt cao điểm phát triển của bệnh kể trên thì bệnh lúa LSĐ thƣờng chỉ xuất hiện cục bộ và rải rác với tỷ lệ nhiễm thấp ở cả 3 nƣớc. Tại cùng một khu vực bị bệnh thì RBSDV thƣờng gây hại nghiêm trọng trên ngô và ít nghiêm trọng hơn trên lúa cũng nhƣ các cây trồng khác. Một số nơi nhƣ Tohuku, phía bắc Nhật Bản, virus này chỉ gây hại trên ngô mà không gây hại trên lúa.

Chỉ có một vùng nhỏ ở Hokkaido, phía Bắc của Tohoku, RBSDV gây hại cả trên ngô và trên lúa nhƣng với tỷ lệ nhiễm thấp [18]. Tại Nhật Bản, các nhà nghiên cứu đã phát hiện có mối quan hệ chặt chẽ giữa sự tăng cao tỷ lệ nhiễm bệnh LSĐ với sự tăng mạnh của các diện tích gieo cấy lúa sớm. Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm bệnh giảm mạnh sau năm 1968 và nguyên nhân chính 5 là do sự sụt giảm đáng kể các diện tích gieo cấy lúa mì và đại mạch. Ở Trung Quốc, sự bùng phát dịch những năm 1963 – 1967 đƣợc cho là do sự gia tăng đột biến các diện tích trồng lúa mì [33].