Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng aspergillusniger tái tổ hợp

Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp, góp phần vào ứng dụng sinh học và công nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Thị Kim Thu
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Tuyên
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu Tinh Sạch Và Đánh Giá Tính Chất Của Xylanase Từ Chủng Aspergillus niger Tái Tổ Hợp
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lược về enzyme xylanase
• 1.2. Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác
• 1.3. Ứng dụng của enzyme xylanase
• 1.3.1. Các chế phẩm xylanase trên thị trường quốc tế
• 1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc
• 1.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm
• 1.3.4. Trong công nghiệp giấy và bột giấy
• 1.3.5. Các ứng dụng khác
• 1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase
• 1.4.1. Trên thế giới
• 1.4.2. Tại Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 2.1.1. Môi trường
• 2.1.2. Thiết bị thí nghiệm
• 2.2. Phương pháp
• 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase
• 2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase
• 2.2.3. Xác định hàm lượng protein
• 2.2.4. Tinh sạch xylanase
• 2.2.5. Điện di SDS-PAGE
• 2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase
• 2.2.7. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nuôi biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp xylanase
• 3.2. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp
• 3.2.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ
• 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH
• 3.2.3. Dung môi hữu cơ
• 3.2.4. Chất tẩy rửa
• 3.2.5. Ion kim loại
• 3.3. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp
• 3.3.1. Tinh sạch enzyme tự nhiên
• 3.3.2. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp
• 3.4. Khả năng phân giải cơ chất của xylanase tự nhiên và tái tổ hợp
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp

Nghiên cứu về xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Xylanase là một enzyme quan trọng trong quá trình phân giải xylan, một polysaccharid chính trong thành tế bào thực vật. Việc nghiên cứu và phát triển enzyme này không chỉ giúp cải thiện hiệu suất trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, giấy, mà còn góp phần vào việc phát triển các sản phẩm sinh học bền vững.

1.1. Ứng dụng của enzyme xylanase trong công nghiệp

Enzyme xylanase có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong ngành công nghiệp thực phẩm, enzyme này giúp cải thiện chất lượng sản phẩm như bánh mì và nước trái cây. Trong ngành công nghiệp giấy, xylanase hỗ trợ quá trình tẩy trắng và giảm thiểu hóa chất độc hại. Ngoài ra, enzyme này còn được sử dụng trong sản xuất thức ăn gia súc, giúp cải thiện khả năng tiêu hóa của động vật.

1.2. Tình hình nghiên cứu xylanase tại Việt Nam

Tại Việt Nam, nghiên cứu về enzyme xylanase từ các chủng vi sinh vật như Aspergillus niger đang được đẩy mạnh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng nấm mốc có khả năng sản xuất enzyme này với hoạt tính cao, mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm enzyme chất lượng cao phục vụ cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu.

II. Thách thức trong việc sản xuất xylanase tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc sản xuất xylanase tái tổ hợp từ Aspergillus niger vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như điều kiện nuôi cấy, hiệu suất sản xuất và tính ổn định của enzyme là những yếu tố cần được nghiên cứu và cải thiện. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất sẽ giúp nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

2.1. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho Aspergillus niger

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme xylanase. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa các điều kiện này có thể giúp tăng cường khả năng sản xuất enzyme từ Aspergillus niger tái tổ hợp.

2.2. Tính ổn định của enzyme xylanase tái tổ hợp

Tính ổn định của enzyme là một yếu tố quan trọng trong ứng dụng thực tiễn. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme xylanase tái tổ hợp có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như nhiệt độ và pH. Việc nghiên cứu và cải thiện tính ổn định của enzyme sẽ giúp mở rộng khả năng ứng dụng của nó trong các ngành công nghiệp.

III. Phương pháp nghiên cứu xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp

Nghiên cứu về enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp thường sử dụng các phương pháp hiện đại như điện di SDS-PAGE, xác định hoạt tính enzyme và tinh sạch enzyme. Các phương pháp này giúp đánh giá chính xác tính chất và hoạt tính của enzyme, từ đó đưa ra các giải pháp tối ưu cho sản xuất.

3.1. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme

Quy trình nuôi cấy Aspergillus niger tái tổ hợp được thực hiện trong môi trường thích hợp để tối ưu hóa sản xuất enzyme xylanase. Sau khi nuôi cấy, enzyme được thu nhận và tinh sạch thông qua các phương pháp như sắc ký và điện di.

3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme

Hoạt tính của enzyme xylanase được đánh giá thông qua các phương pháp định lượng như đo độ hấp thụ quang. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme có thể hoạt động hiệu quả trong các điều kiện khác nhau, từ đó giúp xác định điều kiện tối ưu cho ứng dụng thực tiễn.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của xylanase

Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp có hoạt tính cao và ổn định trong nhiều điều kiện khác nhau. Enzyme này đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, thức ăn gia súc và công nghiệp giấy. Việc phát triển enzyme này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

4.1. Ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm

Enzyme xylanase được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để cải thiện chất lượng sản phẩm như bánh mì và nước trái cây. Việc sử dụng enzyme này giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng cho người tiêu dùng.

4.2. Ứng dụng trong ngành công nghiệp giấy

Trong ngành công nghiệp giấy, enzyme xylanase giúp cải thiện quy trình tẩy trắng và giảm thiểu lượng hóa chất độc hại. Việc sử dụng enzyme này không chỉ giúp tiết kiệm chi phí mà còn bảo vệ môi trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu xylanase

Nghiên cứu về enzyme xylanase từ Aspergillus niger tái tổ hợp đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Với những ứng dụng đa dạng và tiềm năng, enzyme này hứa hẹn sẽ trở thành một sản phẩm quan trọng trong tương lai. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển enzyme này sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo vệ môi trường.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về enzyme xylanase sẽ tiếp tục được mở rộng với mục tiêu phát triển các chủng vi sinh vật mới có khả năng sản xuất enzyme với hoạt tính cao hơn. Các nghiên cứu cũng sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất để giảm chi phí và tăng hiệu quả.

5.2. Ứng dụng bền vững trong công nghiệp

Việc ứng dụng enzyme xylanase trong các ngành công nghiệp sẽ góp phần vào việc phát triển các sản phẩm bền vững, giảm thiểu tác động đến môi trường. Các nghiên cứu trong tương lai sẽ hướng đến việc phát triển các sản phẩm enzyme thân thiện với môi trường, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Xylanase là một enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân xylan – thành phần chính của hemicellulose trong thành tế bào thực vật. Theo ước tính, xylan chiếm phần lớn trong cấu trúc polysaccharide của thực vật, đóng vai trò thiết yếu trong nhiều ngành công nghiệp như giấy, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và dược phẩm. Nhu cầu ứng dụng xylanase ngày càng tăng do khả năng cải thiện hiệu quả sản xuất và giảm thiểu tác động môi trường so với các phương pháp hóa học truyền thống. Tuy nhiên, việc sản xuất enzyme xylanase với hoạt tính cao, ổn định về nhiệt độ và pH vẫn là thách thức lớn trong công nghiệp enzyme.

Luận văn tập trung nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng tái tổ hợp Aspergillus niger VTCC017/pANXlnG2, được tạo ra bằng kỹ thuật tái tổ hợp gen từ Aspergillus oryzae VTCC F187. Mục tiêu cụ thể gồm: tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp, đánh giá các tính chất lý hóa của enzyme và thử nghiệm khả năng thủy phân arabinoxylan cũng như các chế phẩm nông nghiệp. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2020.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển nguồn enzyme xylanase tái tổ hợp có hoạt tính cao, ổn định, phù hợp ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Việc đánh giá tính chất lý hóa enzyme giúp tối ưu hóa điều kiện sử dụng, nâng cao hiệu quả thủy phân polysaccharide và góp phần phát triển công nghệ enzyme thân thiện môi trường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu enzyme xylanase, tập trung vào:

• Cấu trúc và phân loại xylanase: Xylanase được phân thành hai họ chính dựa trên đặc tính xúc tác và cấu trúc bậc ba là họ 10 và họ 11. Họ 10 có khối lượng phân tử cao, pI thấp, thủy phân các liên kết glycosidic cạnh nhánh; họ 11 có khối lượng thấp, pI cao, thủy phân các liên kết glycosidic liên tiếp không thay thế. Cấu trúc bậc ba của enzyme gồm các mảnh β tạo thành vùng xúc tác đặc trưng.

• Cơ chế xúc tác enzyme xylanase: Enzyme thủy phân ngẫu nhiên các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan, tạo ra oligosaccharide và xylose. Cơ chế xúc tác bao gồm giai đoạn tạo trung gian đồng hóa trị enzyme-cơ chất, sau đó phân tách nhờ phân tử nước, giải phóng sản phẩm.

• Ứng dụng công nghiệp của xylanase: Xylanase được sử dụng trong tẩy trắng bột giấy, cải thiện chất lượng bánh mì, làm trong nước ép trái cây, nâng cao hiệu quả tiêu hóa thức ăn chăn nuôi và nhiều ứng dụng khác.

• Công nghệ tái tổ hợp gen: Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để nhân bản và biểu hiện gen xylanase trong các hệ thống vi sinh vật như nấm sợi Aspergillus niger, nấm men Pichia pastoris và vi khuẩn E. coli nhằm tăng năng suất và cải thiện đặc tính enzyme.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng Aspergillus niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp được sử dụng làm mẫu nghiên cứu. Gen mã hóa xylanase G2 từ A. oryzae VTCC F187 được nhân dòng và chèn vào vector pAN7.1GluA, sau đó chuyển vào A. niger VTCC017.

• Phương pháp nuôi cấy và sinh tổng hợp enzyme: Chủng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường YPG cảm ứng hygromycin, lắc 180 vòng/phút, ủ 72 giờ ở 30°C. Dịch nuôi được thu thập để tinh sạch enzyme.

• Tinh sạch enzyme: Sử dụng cột sắc ký ProBondTM resin gắn đuôi His-tag để tinh sạch xylanase tái tổ hợp. Đối với enzyme tự nhiên từ A. oryzae, áp dụng sắc ký lọc gel Sephadex G200 và sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex.

• Xác định hoạt tính enzyme: Định lượng hoạt tính xylanase bằng phương pháp quang phổ theo Miller (1959), đo lượng đường khử giải phóng từ cơ chất xylan bằng phản ứng DNS ở bước sóng 540 nm.

• Xác định hàm lượng protein: Phương pháp Bradford, đo hấp thụ ở bước sóng 595 nm, sử dụng BSA làm chuẩn.

• Đánh giá tính chất lý hóa: Xác định nhiệt độ và pH tối ưu, độ bền nhiệt và pH, ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa và ion kim loại đến hoạt tính enzyme.

• Thử nghiệm thủy phân cơ chất: Sử dụng enzyme xylanase tái tổ hợp và tự nhiên để thủy phân arabinoxylan và các chế phẩm nông nghiệp như bột đậu tương, bột lõi ngô, bột cám gạo, bột bã mía, bột gỗ mục. Phân tích sản phẩm thủy phân bằng sắc ký lớp mỏng TLC.

• Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm MS Excel 2016 và GraphPad Prism 8 để tính toán và biểu diễn kết quả dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (X ± SD). Các chỉ số như hoạt tính riêng, hiệu suất tinh sạch, độ sạch enzyme được tính theo công thức chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase tái tổ hợp: Sau 72 giờ nuôi cấy, enzyme xylanase tái tổ hợp từ A. niger VTCC017/pANXlnG2 đạt hoạt tính 105 IU/ml, gần bằng với enzyme tự nhiên từ A. oryzae VTCC-F187 (114 IU/ml). Quá trình tinh sạch bằng cột ProBondTM resin thu được enzyme tinh khiết với hoạt tính riêng 1102,5 IU/mg protein, hiệu suất thu hồi 52,6% và độ sạch tăng 2,2 lần so với dịch thô.

2. Tính chất lý hóa của enzyme tái tổ hợp: Nhiệt độ tối ưu của enzyme là 55°C với hoạt tính đạt 1058,9 IU/mg. Enzyme duy trì hơn 53% hoạt tính sau 24 giờ ủ ở 50°C. pH tối ưu là 6,5, enzyme bền trong dải pH 4,0-8,0 với hoạt tính còn lại trên 78% sau 24 giờ ủ. Các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone, isopropanol (30% v/v) làm giảm hoạt tính enzyme còn 41-72%, methanol giảm nhẹ còn 85%.

3. Ảnh hưởng của ion kim loại và chất tẩy rửa: Một số ion kim loại như Fe2+, Cu2+, Hg+ làm giảm hoạt tính enzyme đáng kể, trong khi các ion Mg2+, Ca2+ ít ảnh hưởng. Chất tẩy rửa Tween 80, Tween 20, Triton X-100 duy trì hoạt tính enzyme trên 70%, SDS làm giảm mạnh hoạt tính.

4. Khả năng thủy phân arabinoxylan và các chế phẩm nông nghiệp: Enzyme xylanase tái tổ hợp có khả năng thủy phân arabinoxylan hiệu quả, tạo ra các oligosaccharide và monosaccharide như xylose và arabinose, được xác định bằng sắc ký lớp mỏng TLC. So với enzyme tự nhiên, enzyme tái tổ hợp cho hiệu suất thủy phân tương đương hoặc cao hơn khoảng 5-10%.

Thảo luận kết quả

Kết quả biểu hiện enzyme xylanase tái tổ hợp trong A. niger VTCC017/pANXlnG2 cho thấy hoạt tính enzyme được cải thiện đáng kể so với các hệ thống biểu hiện khác như Pichia pastoris (41 IU/ml) hay E. coli (30 IU/ml). Điều này phù hợp với đặc tính sinh học của nấm sợi Aspergillus niger có khả năng tiết enzyme ngoại bào hiệu quả.

Tính ổn định nhiệt độ và pH của enzyme tái tổ hợp cho thấy enzyme phù hợp với điều kiện công nghiệp, đặc biệt trong các quy trình tẩy trắng bột giấy và chế biến thực phẩm, nơi nhiệt độ và pH có thể biến động. Mức độ chịu đựng dung môi hữu cơ và ion kim loại cũng phản ánh tính bền vững của enzyme trong môi trường phức tạp.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, enzyme xylanase G2 tái tổ hợp có nhiệt độ tối ưu và pH tương tự các enzyme xylanase từ Aspergillus khác (nhiệt độ 55-58°C, pH 5-6,5). Hoạt tính riêng cao và độ tinh sạch đạt được cho thấy quy trình tinh sạch bằng cột ProBondTM resin hiệu quả, thuận tiện cho sản xuất quy mô lớn.

Khả năng thủy phân arabinoxylan và các chế phẩm nông nghiệp chứng minh tiềm năng ứng dụng enzyme trong ngành thức ăn chăn nuôi và công nghiệp thực phẩm, giúp tăng giá trị dinh dưỡng và cải thiện tiêu hóa.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính enzyme theo nhiệt độ và pH, bảng so sánh hoạt tính trước và sau tinh sạch, cũng như sắc ký lớp mỏng thể hiện sản phẩm thủy phân.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và biểu hiện enzyme: Tăng cường điều kiện nuôi cấy chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 như điều chỉnh pH, nhiệt độ, thời gian cảm ứng để nâng cao hoạt tính enzyme lên trên 120 IU/ml trong vòng 72 giờ. Chủ thể thực hiện: Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, thời gian 6 tháng.

2. Phát triển quy trình tinh sạch enzyme quy mô công nghiệp: Áp dụng công nghệ sắc ký ProBondTM resin kết hợp với các bước lọc sơ bộ để thu hồi enzyme tinh khiết với hiệu suất trên 60%, giảm chi phí sản xuất. Chủ thể thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học, thời gian 1 năm.

3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme trong công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi: Thử nghiệm bổ sung enzyme xylanase tái tổ hợp vào quy trình sản xuất bánh mì, nước ép trái cây và thức ăn gia súc để đánh giá cải thiện chất lượng sản phẩm và hiệu quả kinh tế trong 6-12 tháng.

4. Khảo sát tính ổn định enzyme trong môi trường công nghiệp thực tế: Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố như ion kim loại, dung môi, chất tẩy rửa trong quy trình sản xuất để điều chỉnh công thức enzyme phù hợp, đảm bảo hoạt tính và độ bền enzyme. Chủ thể thực hiện: Các doanh nghiệp sản xuất enzyme, thời gian 1 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu về enzyme tái tổ hợp, kỹ thuật biểu hiện và tinh sạch enzyme, phát triển công nghệ enzyme mới.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và công nghiệp chế biến thực phẩm, giấy: Áp dụng kết quả nghiên cứu để cải tiến quy trình sản xuất enzyme xylanase, nâng cao chất lượng sản phẩm và giảm chi phí.

3. Chuyên gia phát triển thức ăn chăn nuôi: Tận dụng enzyme xylanase để cải thiện tiêu hóa thức ăn, tăng hiệu quả sử dụng nguyên liệu và nâng cao sức khỏe vật nuôi.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách khoa học công nghệ: Đánh giá tiềm năng ứng dụng công nghệ enzyme tái tổ hợp trong phát triển ngành công nghiệp sinh học xanh, thúc đẩy đổi mới sáng tạo.

Câu hỏi thường gặp

1. Xylanase là gì và vai trò của nó trong công nghiệp?
   Xylanase là enzyme thủy phân liên kết β-1,4 trong xylan, thành phần chính của hemicellulose. Nó được ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy, cải thiện chất lượng bánh mì, làm trong nước ép trái cây và tăng hiệu quả tiêu hóa thức ăn chăn nuôi.

2. Tại sao sử dụng chủng tái tổ hợp Aspergillus niger để biểu hiện xylanase?
   Aspergillus niger có khả năng tiết enzyme ngoại bào cao, dễ nuôi cấy và thích hợp cho sản xuất công nghiệp. Chủng tái tổ hợp giúp tăng hoạt tính enzyme và cải thiện tính ổn định so với enzyme tự nhiên.

3. Phương pháp tinh sạch enzyme xylanase được sử dụng như thế nào?
   Tinh sạch enzyme sử dụng cột sắc ký ProBondTM resin gắn His-tag giúp thu nhận enzyme tinh khiết với hiệu suất cao, kết hợp với các bước ly tâm và lọc sơ bộ để loại bỏ tạp chất.

4. Enzyme xylanase có bền với nhiệt độ và pH không?
   Enzyme xylanase tái tổ hợp nghiên cứu có nhiệt độ tối ưu 55°C và pH tối ưu 6,5, duy trì hoạt tính tốt trong dải pH 4-8 và nhiệt độ 25-50°C, phù hợp với nhiều ứng dụng công nghiệp.

5. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tái tổ hợp như thế nào?
   Enzyme tái tổ hợp có khả năng thủy phân arabinoxylan hiệu quả, tạo ra các sản phẩm oligosaccharide và monosaccharide, giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng và ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi và công nghiệp thực phẩm.

Kết luận

• Đã tinh sạch thành công enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp với hoạt tính riêng đạt 1102,5 IU/mg protein, hiệu suất thu hồi 52,6%.
• Enzyme có nhiệt độ tối ưu 55°C, pH tối ưu 6,5, bền trong dải pH 4-8 và nhiệt độ 25-50°C, phù hợp ứng dụng công nghiệp.
• Enzyme chịu được ảnh hưởng của nhiều ion kim loại và dung môi hữu cơ ở mức độ nhất định, thể hiện tính ổn định cao.
• Khả năng thủy phân arabinoxylan và các chế phẩm nông nghiệp của enzyme tái tổ hợp tương đương hoặc vượt trội so với enzyme tự nhiên.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu quy trình nuôi cấy, tinh sạch và ứng dụng enzyme trong công nghiệp thực phẩm, giấy và thức ăn chăn nuôi trong các giai đoạn tiếp theo.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các phòng thí nghiệm và doanh nghiệp phối hợp triển khai nghiên cứu ứng dụng enzyme xylanase tái tổ hợp trong quy mô công nghiệp, đồng thời phát triển các sản phẩm enzyme đa dạng, thân thiện môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Xylan một loại polysacharid chiếm phần lớn trong thành phần hemicellulose của thành tế bào thực vật. Để phân giải hoàn toàn xylan thành xylose cần có sự phối hợp của nhiều loại xylanase khác nhau với các chức năng khác nhau (endo-β-1,4-D- xylanase, EC 3.1; acetyl xylan esterase; EC 3. Endoxylanase có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase dùng cho công nghiệp bột giấy, hỗ trợ quy trình tẩy trắng, giúp giảm hóa chất độc (chlorine) thường dùng để tẩy lignin trong giấy [14], làm trong nước hoa quả, rượu vang, bia, tạo đường xylitol cho công nghiệp bánh kẹo [67].

Xylanase thủy phân hemicellulose tạo arabinoxylan (AX) và chuỗi oligosaccharid arabinoxylan ngắn hơn (arabinoxylanoligosaccharid-AXOS). Arabinoxylan (AX) là một thành phần chất xơ chính được tìm thấy trong một loạt các loại ngũ cốc, được dùng cho chế độ ăn kiêng có tác dụng tốt đối với sức khỏe con ngườ. Nên arabinoxylan được định hướng dùng làm phẩm chức năng [71, 61, 57]. Rất nhiều chủng vi sinh vật tự nhiên từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi được công bố có khả năng sản xuất xylanase, trong đó nấm mốc là sinh vật tiềm năng có khả năng tổng hợp xylanase hoạt tính cao [38].

Vì những lý do ứng dụng khác nhau, rất nhiều loại xylanase được sản xuất từ chủng Bacillus [14] và chủng nấm Aspergillus như Aspergillus awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus giganteus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger và Aspergillus sydowii đã được tinh sạch và đánh giá một số tính chất lý hóa của xylanase [33, 34, 49, 57, 62, 85]. Các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới đã tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp xylanase như E. Chủng Aspergillus niger VTCC017/pANXlnG2 đã được tạo ra từ việc nhân đoạn gen xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC F187, gen mã hóa xylanase được chèn vào vector biểu hiện pAN7.1GluA với cặp mồi đặc hiệu, plasmid tái tổ hợp được đưa vào A. niger VTCC 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] 017 với chất cảm ứng hygromycin sau 72 giờ nuôi cấy chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase cao.

Với mong muốn ứng dụng chủng vào thực tế sản xuất enzyme xylanase tái tổ hợp định hướng nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan và các chế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp” với mục tiêu sau: 1. Tinh sạch được enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp 2. Đánh giá các tính chất lý hóa của xylanase tái tổ hợp 3. Thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme xylanase tái tổ hợp và enzyme xylanase tự nhiên.

2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lƣợc về enzyme xylanase 1. Định nghĩa Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.8 có [67]: Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-D- xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β- xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan tạo thành các oligosacharid ngắn (oligoxylose) và xylose (Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy phân xylan [67] 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Phân loại Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật. Chúng được phân chia thành hai nhóm dựa vào sự tương đồng về đặc tính lý hóa như là khối lượng phân tử, điểm đẳng điện và các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng: Enzyme endo-xylanase họ 10 gồm các enyzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (trước đây gọi là họ F). Enzyme endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được (trước đây gọi là họ G) [52, 73]. Sự khác biệt về đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase là endo-xylanase của họ 10 có khả năng thủy phân các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó [41].

Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế. Ngoài việc phân loại enzyme xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng đã tiến hành nghiên cứu, phân chia enzyme xylanase thành những nhóm nhỏ hơn. Sapag và cộng sự (2002) chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc.

Các enzyme nhóm I và II thường là các enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và Basidiomyceta. Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị pI ở phía axit. Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí. Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C.

Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương. Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [73]. Cấu trúc 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các enzyme [81], từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans có nét đặc trưng của họ 11 [41].

Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạo thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [73]. Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β. Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran [39] Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β cái mà làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác.

Vũng lõm này được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay phải. 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [Jeffries1996] Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác. Meagher và cộng sự (1998) nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei có thể liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác [59]. Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [21, 80].

Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác 1. Đặc điểm cơ chất Xylanase chủ yếu thủy phân xylan và một phần nhỏ cellulose. Xylan là thành phần chính cấu tạo hemicellulose tập trung chủ yếu ở cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật, và là một trong số polysaccharid quan trọng trong tự nhiên [48]. Ở cây gỗ cứng, xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.4), còn ở cây gỗ mềm là arabino-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.

Ở các loài ngũ cốc, thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete 4-Omethylvà arabinose. 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng [48] Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm [48] 1. Phức hệ enzyme phân cắt xylan Có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân hoàn toàn xylan. Sử dụng kiềm mạnh hoặc axit mạnh là những biện pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay bởi hiệu quả thủy phân và giá trị kinh tế.

Nhưng vấn đề ô nhiễm môi trường đang ngày càng gia tăng, đòi hòi các nhà khoa học phải tìm tòi, nghiên cứu ra phương pháp thủy phân polysaccharide nói chung và xylan nói riêng bằng enzyme sinh học. Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme [68], trong đó endo- β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.8) thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β- 1,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer. Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase.

7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [68] Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylo- oligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử. Sự thủy phân liên kết α- 1,2 -glycosidic bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan. Tương tự như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp α-glucuronidase [39].

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết của các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.6), các gốc chuỗi bên arabinose với axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p- coumaroyl esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose.

Nếu sử dụng cùng với xylanase và các enzym 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [19]. Enzyme quan trọng nhất trong hệ thống enzyme thủy phân cơ chất xylan là enzyme xylanase [67]. Vì nó là enzyme khởi đầu cho hệ thống phản ứng phân cắt các liên kết của xylan. Cơ chế xúc tác Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase [23, 41, 50, 53].

Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa qua Hình 1.