Tài liệu Kỹ thuật: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây

Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây chùm ngây Moringa oleifera L, ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại để phát triển giống cây có giá trị dinh dưỡng cao.

• Tác giả: Vũ Thị Phan
• Người hướng dẫn: ThS. Hà Bích Hồng
• Trường học: Trường Đại học Lâm nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Chùm ngây (Moringa oleifera L.)
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nhân giống in vitro cây Chùm ngây

Nhân giống in vitro là một phương pháp công nghệ sinh học hiện đại được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp. Cây Chùm ngây (Moringa oleifera L.) là một loài cây có giá trị cao về mặt dinh dưỡng và y học. Quy trình xây dựng quy trình nhân giống in vitro giúp tạo ra số lượng lớn cây con giống, đảm bảo chất lượng và tốc độ phát triển nhanh hơn so với phương pháp truyền thống. Phương pháp này không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn giảm chi phí sản xuất, tạo ra những cơ hội mới cho ngành nông nghiệp Việt Nam.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây Chùm ngây

Cây Chùm ngây là loài cây nhiệt đới có khả năng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu khắc nghiệt. Nó có hệ rễ phát triển mạnh, lá nhỏ xốp và thân gỗ chắc chắn. Cây có khả năng tái sinh mạnh mẽ từ các phần mô tế bào, điều kiện lý tưởng cho nuôi cấy mô in vitro. Hàm lượng dinh dưỡng cao trong lá, hạt và rễ của cây Chùm ngây làm cho nó trở thành đối tượng nghiên cứu quan trọng.

1.2. Giá trị sử dụng và thực trạng gieo trồng

Giá trị dinh dưỡng của Chùm ngây được công nhận trên toàn thế giới, có chứa protein, vitamin và khoáng chất cần thiết. Cây được sử dụng trong chế biến thực phẩm chức năng và dược phẩm. Hiện nay, nhu cầu về cây Chùm ngây tăng cao nhưng nguồn cung cấp còn hạn chế. Nhân giống in vitro là giải pháp hiệu quả để đáp ứng nhu cầu thị trường.

II. Cơ sở lý thuyết của nuôi cấy mô tế bào in vitro

Nuôi cấy mô in vitro dựa trên nguyên lý tổng năng của tế bào thực vật - khả năng của một tế bào sinh dưỡng có thể phát triển thành toàn bộ một cây hoàn chỉnh. Quy trình này sử dụng môi trường dinh dưỡng nhân tạo chứa các chất cần thiết như carbohydrate, vitamin, khoáng chất và các hormone thực vật như auxin và cytokinin. Điều kiện vô trùng là yếu tố quan trọng nhất để đảm bảo thành công của quá trình nuôi cấy. Phương pháp này cho phép tạo ra hàng ngàn cây con từ một mô ban đầu trong thời gian ngắn.

2.1. Quy trình nuôi cấy mô tế bào cơ bản

Quy trình nhân giống in vitro bao gồm các bước chính: khử trùng mô ban đầu, tạo mô callus, tích lũy chồi và biệt hóa rễ. Mỗi bước sử dụng các công thức môi trường và nồng độ hormone khác nhau. Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ.

2.2. Các điều kiện cần thiết cho nuôi cấy thành công

Thành công của nuôi cấy in vitro phụ thuộc vào nhiều yếu tố: sạch trùng tuyệt đối, môi trường dinh dưỡng cân bằng, nồng độ hormone phù hợp, điều kiện ánh sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ ổn định 25-27°C. Tỷ lệ BAP/IBA ảnh hưởng trực tiếp đến hình thành chồi hoặc rễ.

III. Các thí nghiệm xây dựng quy trình nhân giống

Để xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Chùm ngây, một loạt thí nghiệm được tiến hành để xác định các điều kiện tối ưu. Thí nghiệm 1 kiểm tra ảnh hưởng của loại hóa chất khử trùng (ethanol, sodium hypochlorite) và thời gian xử lý đến khả năng tạo mẫu sạch. Thí nghiệm 2, 3 đánh giá ảnh hưởng của BAP, Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. Thí nghiệm 4 xác định nồng độ IBA tối ưu cho hình thành rễ. Thí nghiệm 5 kiểm tra các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau (MS, WPM) để tăng khả năng ra rễ của chồi.

3.1. Tối ưu hóa khử trùng mô ban đầu

Khử trùng là bước critical trong quy trình. Thí nghiệm sử dụng ethanol 70% kết hợp với sodium hypochlorite với các nồng độ và thời gian khác nhau. Kết quả cho thấy ethanol 70% trong 1 phút sau đó NaClO 0.5% trong 10-15 phút tạo ra tỷ lệ mẫu sạch cao nhất (85-90%).

3.2. Xác định nồng độ hormone tối ưu

BAP ở nồng độ 2-3 mg/L kết hợp với Kinetin 0.5-1 mg/L tạo ra chồi phát triển tốt nhất. Tỷ lệ BAP/IBA 3:1 cho kết quả ra rễ hiệu quả nhất với tỷ lệ sống cao sau 4 tuần nuôi cấy.

IV. Ứng dụng và hướng phát triển

Nhân giống in vitro cây Chùm ngây mở ra những cơ hội to lớn cho phát triển bền vững nông nghiệp. Phương pháp này cho phép sản xuất hàng loạt cây con với chất lượng đồng nhất và khả năng thích nghi cao. Các cây nhân giống in vitro có thể được chuyển giao cho nông dân để trồng tại ngoài đồng, tạo ra nguồn cung ứng ổn định. Ngoài ra, kỹ thuật này có thể được ứng dụng cho các loài cây khác, mở rộng giá trị kinh tế nông nghiệp. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa chi phí sản xuất và nâng cao hiệu suất.

4.1. Ứng dụng thực tiễn trong sản xuất nông nghiệp

Cây Chùm ngây nhân giống in vitro có thể được trồng tại các vùng khác nhau của Việt Nam, phù hợp với khí hậu nhiệt đới. Sản phẩm từ cây có thể được chế biến thành bột dinh dưỡng, trà thảo dược, dầu hạt. Mô hình trồng Chùm ngây kết hợp với chăn nuôi tạo ra hệ thống nông nghiệp bền vững hiệu quả.

4.2. Kiến nghị và hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu các công thức môi trường mới để giảm chi phí. Chuyển giao công nghệ cho các trung tâm lâm nghiệp và nông dân là ưu tiên. Nghiên cứu kỹ thuật hardening (tích thích) cho cây in vitro trước khi trồng ngoài đồng cần được phát triển thêm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ. 6, xe 1 PHÀN 1 TỎNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU. Giới thiệu về cây Chùm TiBây. Đặc điểm sinh học.

Giá trị sử dụng của cây Chùm ngây. + 525cc vs rrrsesee 4 1. Thực trạng gieo trồng và sử dụng cây Chùm ngấyzz::. Trên thế giới.

Ở Vit Nam oceccceccccsecsssecsssessueessecessecessveesseshanedsssecssuecsseessueesssesssueessucesavee 7 1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Cơ sở của phương pháp nuôi -cấy mô — tế bào. Quy trình nuôi cấy i WifG.

ác St TT 111111 xeerkkrrrkrrrresree 9 1. Các điều kiện cần thiết của nuôi ấy in vitro. Những vấn đề trong nuôi cấy i vifro. Tính bắt định Về mặt di truyén.

Sự nhiễm mmẫu.-:----- ¿5-62 SE E9EEESEEKEEEEEEEEE3 15115151251 cx re 16 1. Sự hóa thủy tỉnh thỂ.----2¿-22©Se+EE+EvEEESEEketrkeerrxerrrrerrrxerrrxee 17 1. Ứng dụng của nuôi cấy mô - tế bào trong công tác giống cây trồng sua 18 1. Aes aise cứu nhân giống iw vi/ro một số loài cây được liệu.

Nhân giống vitro một số cây dược liệu.2NhâmGiông ¡› đjrg gầy Chùm ngây. ào 20 PHAN 2 BU:- POI TUONG - NOI DUNG - PHUONG PHAP NGHIÊN CỨU. Mục tiêu nghiÊn CỬ sasasssesissxs600564551n01160644685405603804155860151E8S854390389336353 23 2 PG fone weltGn Citta cceamaancucamanamnancomnanemenmensenns se.NGO1 GUAGE DENIED COU scarsesseacissevacssexsavesaisassecsoossaveesoeenonssossveseverszevancensectors 23 2. Phuong phap nghién ctu oo.

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến kha nang tao MAU Sach. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BAP đến kha nang nhan nhanh chdi. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetín đến khả năng nhân nhanh chồÌ. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chỗi Chùm ngây.

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ CUA CHOLceceeseesscsscsssessecsssssecsseeseccevesecesecssecssesssessssereessscss-llsasesessesssessscssecsees 27 2. Các chỉ tiêu theo dõi và thu thập số liệu. Chỉ tiêu thu thập. Phương pháp xử lý số liệu.(---ci©22+©+++vkevcvxerErkeerrkerrreerree 28 PHAN 3 KET QUA - THAO DUAN 3.

Anh hung cia loai héa chatva thời gian khử trùng tới khả năng tạo mẫu SH guuannttrrntiOittitiontOi no A.Ã co CÀ Ghcoogootdttgtringtiotlsyntgraditaat 29 3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chằì. Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và-Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. Ảnh hưởng của TBA đến khả năng ra rễ của chồi.

Ảnh hưởng của môi trường đỉnh dưỡng đến khả năng ra rễ của chôi.39 PHÀN 4 KÉT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ. 42 TÀI LIỆU PHU BIE DANH MUC CAC CHU VIET TAT Ky hiéu Diễn giải BAP Benzil amino purin CNSH Cong nghé sinh h CTMT Công thức môi trường ĐHLN Đại học Lama DANH MUC CAC BANG Bảng 2. Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng Bang 2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chỗi.

Ảnh hưởng té hop cia BAP và Kinetin đến khả nang nhân nhanh ChỒi. Ảnh hướng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Bảng 2.5: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả riăng fa tế của chồi 1. Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng 571810 8A30]T5. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi.3: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh S00.4: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chẳi.

Ảnh hưởng của môi trường dinh dứỡng đến khả năng ra rễ của chồi ¬—.,ÔỎ 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cây, lá và quả Chùm ngÂy. Giá trị dinh dưỡng trong lá cây Chùm ngây. Hạt nảy mầm với hóa chất khử trùng là Javen 60% (A) và HợCl; 0,1% Hình 3.

Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồìi. (E11 755 uất CS n3 E2 EEEAeiEEEkrrrrrkcee 34 Hình 3. Chồi Chùm ngây trên môi trường CT7.sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B) NUGL CY Tố. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của DAT VAN DE Thế giới đang trải qua thời kì khủng hoảng về kinh tế cũng như những bat ôn về khí hậu và một hậu quả không thể tránh khỏi là sự gia tăng tỷ lệ đói nghèo, suy dinh dưỡng và bệnh tật.

Một giải pháp hữu hiệu đang được trên 80 quốc gia trên thế giới áp dụng để xua tan đi nỗi lo về sự nghèo đói, suy dinh dưỡng và bệnh tật đó là gây trồng loài Chùm ngây (trơng chương trình Dự án cây Chùm ngây) [26]. Chim ngay (Moringa oleifera L.) 1a một lơài:cây đa tác đụng và được đặc cách đặt cho cái tên là cây “Độ sinh”. Giá trị sử dụng:của cây Chùm ngây được chia làm hai nhóm chính: sử đụng làm thuốc chữa bệnh và sử dụng làm nguồn dinh dưỡng. Hai tổ chức thế giới (WHO và FAO) khuyến cáo loài cây này là giải pháp ưu việt cho các bà mẹ thiếu sữa; trẻ erfi suy dinh dưỡng và là giải pháp lương thực cho “thế giới thứ ba” nên nó được trồng và nghiên cứu ở rất nhiều quốc gia trên thế giới.

Hoạt tính được học của cây Chùm ngây đã được khoa học chứng minh là có khả năng chống viêm, khối u, đặc biệt là những bệnh ung thư ở vùng Đụng và kháng nấm gây bệnh, kích thích hoạt động của tim và hệ tuần hoàn, trị tiểu đường, bảo vệ gan, làm giảm lượng cholesterol trong máu. Cây Chùm ngây cung cấp hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp và các chất khoáng đa dạng không Kếm các sản phẩm từ động vật. Trong lá rất giàu dinh dưỡng, hàm lượng vitamin C nhiều hơn trái cam 7 lần, vitamin A nhiều hơn cà-rốt 4 lần, canxi nhiều hơn sữa 4 lần, chất sắt nhiều hơn cải bó xôi 3 lần, còn chất đạm nhiều hơn Ya-ua 2 lần và kali nhiều hơn trái chuối 3 lần [20, 24, 27]. Ngoai ra, cây này còn được các nước Châu Âu và Mỹ sử dụng làm mỹ phẩm, Mỹ đang là nước nhập khẩu nguyên liệu Chùm ngây thô lớn nhất thế giới để sử dụng trong công nghệ mỹ phẩm cao cấp, nước uống dinh dưỡng và quan trọng hơn là chiết xuất thành nguyên liệu tinh cung ứñgếcho công nghiệp thực phẩm, được phẩm, hóa chất [29, 32].

Hiện ngây chủ yếu được nhân giống bằng hạt hoặc giâm iền:Bắc chưa phổ biến trồng loài cây này, mà chỉ có một rồng với mục đích kinh doanh lá nên nguồn hạt giống không đảm bao. Trước thực tế đó, việc nhân giống in vitro dé san xuất hàng loạt cây giống Chùm ngây chất lượng tốt phục vụ gây trồng trên diện tích lớn là rất cần thiết. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Wghiên cứu xây dựng quy trình nhân giỗng in vitro cây Chùm ngây (Moringa oleifera L. 1 PHAN 1 TONG QUAN VAN DE NGHIEN CUU 1.

Giới thiệu về cây Chùm ngây 1. Đặc điểm sinh học Chùm ngây có tên khoa học là Ä⁄ori»ga oleiera, thuộc chỉ Chùm ngây (Moringa), họ Chùm ngây (Moringaceae), bộ Chùm ngây (Moringales), phân lớp Số (Dilleniidae), lớp hai 14 mam (Dicotyledons). Chùm ngây thuộc nhóm cây gỗ, có thể mọc cao 5 đến 10m, phân nhánh nhiều, thân có tiết diện tròn, thân non màu xanh có lông; thân già màu xám nốt sần. Lá kép hình lông chim 3 lần lẻ (triple hay:pinnated) dài 30 - 60cm, màu xanh mốc, mọc cách, có từ 5 - 7 cặp lá phụ bậc 1; 4 - 6 cặp lá phụ bậc 2, 6 - 9 cặp lá phụ bậc 3.

Lá chét dài 12 — 20 mm hình trứng, mọc đối, mặt trên xanh hơn mặt dưới, lá non kích thước lớn hơn lá già, gai nhỏ có lông ở chỗ phân nhánh lá kép lông chim. Gân lá hình lông chim, nổi rõ mặt dưới. Cuống lá dài 18 - 25 cm. Cụm hoa dạng chùm sim mọc ở nách lá hay ngọn cành.

Hoa không đều lưỡng tính, màu trắng hơi vàng, mùi thơm, hình dạng giống hoa đậu, có cuống đài 1 -2 cm, có lông tơ. Trục phát hoa màu xanh, có lông dai 10 - 15 cm. Lá bắc hình vảy nhỏ; có lông. Lá đài hoa 5, rời, đều, hơi cong hình lòng muỗng, màu trắng, đài 1cm, rộng 0,4 cm.

Cánh hoa Š, rời, không đều, cánh hoa dạng thìa, màu trắng hơi vàng, phấn nằm ngoài, dài hơn nhị bất thụ và đối diện với cánh hoa, nhị bất thụ nằm xen kẽ cánh hoa. Chỉ nhị có kích thướế to ¿ oi màu vàng, dài 0,6 - l cm, có vere Bao phan 2 6, hinh treo, dai 25- 30 oft ngang 2 cm, có 3 cạnh, chỗ có hạt hơi gỗ lên, dọc theo quả có khía rãnh, quả khô màu vàng xám. Hạt màu đen, tròn có 3 cạnh, lớn cỡ hạt đầu Hà Lan. Cây cho nhiều lá vào cuối mùa khô và trổ hoa vào các tháng 1-2.

Cây Chùm ngây rất dễ trồng, có thể trồng từ hạt, hom cành, hom củ và trồng được quanh năm. Vùng thiếu nước nên trồng vào mừa mưa, tức khoảng tháng 4, tháng 5. Cây chuộng đất ráo nước, nhiều cát, dù là đất xấu Cũng dễ mọc, chịu được hạn hán, ưa nắng, hầu như không bị sâu bệnh hại do đó chăm sóc cây không cần điều kiện gì đặc biệt về phân bón và nước tưới: Tuy nhiên, cây không chịu được úng ngập và dé chết nếu không được thoát nước tốt [18, 24, 25, 27].Cay, la va quả Chùm ngây Phân bố: Chùm ngây là cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp trồng ở những đất đá khô cần và trong điều kiện khí hậu khắc nghiệt, chịu được hạn hán, SIM vỹ ên thế giới chùm ngây được trồng làm hàng rào xanh che chắn .cho› các ý sản xuất nông nghiệp, che bóng cho các cây công nghiệp đài n Ấn gió, chắn cát. Cây cũng có khả năng cải tạo đất tốt, lá SS 2 ⁄ H già làm phân hữu cớ và thức ăn bổ sung cho gia súc rất tốt.

Ngoài ra, cây còn được làm cảnh (dáng cây thon, thân óng, tán đẹp, lá xanh mướt). Chùm ngây được trồng phổ biến ở Châu Á và Châu Phi. Ở Việt Nam, Chùm ngây mọc tự nhiên ở Ninh Thuận, Bình Thuận. Tuy nhiên, trong những năm gần đây do nhiễu nghiên cứu đã chứng minh công dụng tuyệt vời của loài cây này mà diện tích gây trồng được mở rộng nhiều; chủ yếu ở các tỉnh phía Nam.

Giá trị sử dụng của cây Chùm ngây Chùm ngay (Moringa oleifera L.) 1a loai eây được trồng phổ biến nhất trong họ Chùm ngây, có lịch sử hơn 4 nghìn năm và xuất xứ từ vùng Nam Á (An Độ). Đây là một loài cây phổ biến ở Án Độ, các nhà-dược học, các nhà khoa học nghiên cứu thực vật, dựa vào hàm lượng dinh đưỡng và nguồn dược liệu quý hiếm đã được kiểm nghiệm, đã không ngần ngại đặt tên cho nó là cây Thần Diệu (Miracle Tree) hay cây Độ Sinh (Tree of Life). Vậy cây Chùm ngây có những giá trị gì và tại sao người ta lại đặt tên cho nó như vậy? Cây Chùm ngdy (Moringa oleifera L.