MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn thu hút được sự quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên thế giới. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật mới, hiện đại đã và đang được áp dụng để tạo ra những sản phẩm mới với chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Tuy nhiên để tạo ra nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của người tiêu dùng mà vẫn giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho đến khi sử dụng, trong quá trình chế biến, nhà sản xuất đã sử dụng các nhóm chất bảo quản để tăng giá trị thương phẩm và kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm. Trên thị trường hiện nay, có rất nhiều loại chất bảo quản dùng để kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm, nhưng đa số các chất này được tổng hợp nhân tạo đã gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn do khó bị phân huỷ, để lại dư lượng trong thực phẩm.
Gây ngộ độc cấp tính nếu liều lượng dùng quá giới hạn cho phép, gây ngộ độc mãn tính nếu dùng với thời gian kéo dài, liên tục, nguy cơ gây hình thành khối u, đột biến gen… [21, 22, 62]. Do đó, các nhà nghiên cứu cũng như các nhà sản xuất ngày càng có xu hướng sử dụng các chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, tự nhiên để dần thay thế chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, mà vẫn đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm an toàn, đảm bảo chất lượng, kéo dài được thời gian sử dụng. Việc sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacteriocin, đặc biệt là Nisin A và Nisin Z trong bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm nhiều. Ngoài khắc phục được những nhược điểm của phương pháp sử dụng hoá chất, nhiệt độ, chiếu xạ,.
Nisin còn có nhiều ưu điểm khác như phạm vi ứng dụng rộng, giảm thời gian và nhiệt độ thanh trùng của sản phẩm, đảm bảo chất lượng, giá trị dinh dưỡng, cảm quan vị sản phẩm. Mặc dù nhóm chất bảo quản Nisin được coi là khá an toàn đối với sức khỏe con người và không gây ảnh hưởng đến môi trường, nhưng cần tuân thủ theo các quy định khác nhau của mỗi quốc gia về mức cho phép Nisin trong thực phẩm. Hiện nay trên thế 1 giới và trong nước đã có một số nghiên cứu được công bố về phương pháp xác định riêng rẽ hoặc đồng thời Nisin A và Nisin Z bao gồm: phương pháp sinh học [48] [63], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV-Vis [41], điện di mao quản (CE) [58] [59], sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) [3] [25] [38] [57]. Tuy nhiên, phương pháp HPLC, CE hay sinh học thường khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hưởng của nền mẫu cũng như kích thước lớn của phân tử Nisin.
Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm phân tích nhanh, tiết kiệm thời gian và dung môi, độ nhạy cao và nhận diện được đồng thời các hợp chất có tính chất và cấu trúc tương đồng nhau nên đã được lựa chọn để xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong nghiên cứu này. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong các sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS)” với các mục tiêu như sau: Xây dựng phương pháp xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z bằng sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS). Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng Nisin A và Nisin Z trong một số sản phẩm dinh dưỡng. 2 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.
Giới thiệu chung về chất bảo quản 1. Định nghĩa chất bảo quản Chất bảo quản là các hóa chất tự nhiên hay tổng hợp được thêm vào sản phẩm như thực phẩm, dược phẩm, sơn, các mẫu phẩm sinh học v. để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự thối rữa, hư hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật hay do các thay đổi không mong muốn về mặt hóa học. Chúng có thể được sử dụng như là một hóa chất duy nhất mà cũng có thể trong tổ hợp với nhiều loại hóa chất có các tác dụng khác.
Phân loại chất bảo quản Theo mục đích của quá trình, có thể phân loại chất bảo quản thành hai nhóm: - Nhóm chất bảo quản (preservative) thường được gọi là chất bảo quản: Ngăn ngừa vi sinh vật, nấm nem, nấm mốc phát triển. - Các chất kháng sinh: Steptomixin, các loại penixilin. - Nhóm chất ngăn chặn quá trình oxi hóa các thành phần dinh dưỡng của sản phẩm, thường được gọi là chất chống oxi-hóa (antioxidant): acid scorbic, acid citric, acid tactric, dẫn xuất tocopherol… Có tác dụng làm chậm sự biến chất, ôi khét, biến màu của thực phẩm. Theo nguồn gốc của chất bảo quản có thể chia chúng thành: - Chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên: Là những chất chiết xuất từ tự nhiên, có khả năng kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm.
- Chất bảo quản tổng hợp: Được tổng hợp nhân tạo bằng phương pháp hóa học. Giới thiệu về chất bảo quản nhóm Nisin (E234) 1. Lịch sử phát hiện Nisin được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928 từ hiện tượng Streptococcus lactis gây ức chế Lactobacillus bulgaricus [51]. 3 Năm 1985, theo khoá phân loại của Schleifert và cộng sự, phân loại chủng sinh tổng hợp Nisin thuộc loài Lactococcus lactis [56].
Năm 1947, Mattick và Hirsch đã nghiên cứu thành công đặc tính của phân tử và tên thuật ngữ đầu tiên được đặt là “ chất ức chế Nisaplin” [42]. Năm 1951, Hirsch đã chứng minh việc sử dụng chủng vi khuẩn Lactococcus Lactic sinh Nisin làm giống khởi động có thể ngăn chặn sự hư hỏng phomat gây ra bởi Clostridium butulium [33]. Năm 1957, Apilin và Barrett đã đưa ra chế phẩm thương mại đầu tiên. Dạng chế phẩm Nisin sẵn có nhất hiện nay trên thị trường đó là NisaplinTM, với thành phần 2,5% Nisin.
Năm 1959, Nisin được chấp thuận để sử dụng làm chất bảo quản ở Anh [65]. Năm 1969, tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm thế giới (FAO/WHO) đã chính thức công nhận Nisin là an toàn và cho phép sử dụng như chất bảo quản thực phẩm với liều lượng 400IU/g [6] [16] [36] [37] [50] [54]. Năm 1971, Gross và Morell đưa ra cấu trúc hoàn chỉnh của phân tử Nisin [27]. Năm 1988, Nisin chính thức được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) công nhận là an toàn và coi là chất bảo quản có nguồn gốc sinh học [36] [46] [50] [54].
Năm 1995, Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã phê duyệt cho một số sản phẩm thực phẩm với việc sử dụng Nisin (E234) làm chất bảo quản cho ngành công nghiệp theo Chỉ thị 95/2/EC [5]. Hiện nay, Nisin được sử dụng ở trên hơn 50 quốc gia bao gồm các nước trong liên minh Châu Âu và một số nước ở Châu Á, Châu Phi [4] [6] [16] [17] [35] [50]. Giới thiệu Nisin Nisin là một bacteriocin, có bản chất là một peptid đa vòng có tính kháng khuẩn mạnh, chứa 34 acid amin, được sản xuất bằng cách lên men sử dụng nhóm vi khuẩn Gram (+) thuộc loài Lactococcus, Streptococcus [19] [39]. Nó là bacteriocin duy nhất 4 đã được Tổ chức Y tế Thế giới cho phép sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm và nó được thương mại hóa dưới dạng bột cô đặc khô.
Hoạt chất này chứa các acid amin không thông dụng như Lanthionin (Lan), Methyllanthionin (Melan), Didehydroalanin (Dha) và Didehydroalaninbutyric (Dhb). Cho tới nay, các nhà khoa học đã phát hiện được 6 biến thể Nisin khác nhau từ A đến Z và U. Trong khuôn khổ luận văn này chỉ nghiên cứu hai biến thể tự nhiên là Nisin A và Nisin Z. Công thức phân tử Nisin A: C143H230N42O37S7, khối lượng phân tử: 3358,53 (Da), pI 8,52 Công thức phân tử Nisin Z: C141H245N41O46S7, khối lượng phân tử: 3335,91 (Da), pI 8,51 Công thức cấu tạo chung của Nisin trong hình 1.
Cấu tạo chung Nisin 5 Cấu trúc phân tử của Nisin A và Nisin Z được thể hiện trong hình 1. Cấu trúc phân tử Nisin A Hình 1. Cấu trúc phân tử Nisin Z Cấu trúc của Nisin được Gross và Morell làm sáng tỏ năm 1971 [27]. Hợp chất Nisin là một bacteriocin thuộc nhóm I- còn gọi là nhóm Lantibiotic trong hệ thống phân loại 4 nhóm.
Nisin được cấu tạo bởi 34 acid amin, trong đó có một số acid amin dị thường như: sự khử nước ở acid amin serine và threonine tạo acid amin Dehydroalanine (Dha) và Dehydrobutyrine (Dhb). Các acid amin liên kết nhau qua cầu nối lưu huỳnh tạo 5 vòng 6 cấu trúc đặc trưng A, B, C, D, E, (hình 1.3) [27] và được tổng hợp bởi một số chủng thuộc dưới loài L. lactis, thường được viết là L. Nisin có cấu trúc xoắn α tương tự colixin, khoảng cách của cầu nối C – S là 1,83 A0 và góc C – S – C là 103 A0.
Phân tử Nisin có gốc amin và cacboxyl ở cuối nhóm, năm vòng bên trong được tạo bởi liên kết thioether. Vòng đầu tiên Ala-S-Ala là Lanthionine, 4 vòng còn lại Abu-S-Ala là các β-methyllanthionine. Ngoài cầu nối disulfide giữa dạng Lanthionine với methyllanthionine, mạch peptide còn nối với nhau bằng –NH− tạo ra dạng polymer hay nhiều monomer [34]. Nisin không hấp phụ ở bước sóng 260 nm hay 280 nm do trong cấu trúc phân tử của nó không chứa các acid amin thơm.
Các acid amin dị thường đóng vai trò như một nhóm ái nhân (nucleophile), được xác định thông qua khả năng phản ứng với các mercaptan. Có thể vì các nhóm này rất quan trọng để đảm bảo Nisin có khả năng xâm nhập vào màng tế bào đích. Cấu trúc gồm 5 vòng của Nisin giúp cho nó có độ vững chắc, đồng thời góp phần đề kháng lại các tác dụng của enzym proteinase và sự biến tính do nhiệt. Nisin có thể tồn tại ở dạng monomer với khối lượng phân tử 3500 Da (3.
Do các phân tử Nisin có thể tương tác liên kết với nhau thông qua các nhóm acid Dehydroamin và các nhóm amin nên Nisin có thể tồn tại ở dạng dimer ổn định hơn hay tetramer với khối lượng phân tử tương ứng là 7000Da và 14000 Da [7]. Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây chứng minh Nisin bao gồm một số peptide có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen, bao gồm 11 gen như sau: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E và Nis Z. Trong tự nhiên, một số loại Nisin đã được xác định.