CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1. Chất kháng sinh (Antibiotic) Chất kháng sinh, theo khái niệm cũ là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở nồng độ thấp (g/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác (vi khuẩn, nấm nem, nấm mốc…) một cách chọn lọc [124].
Thuật ngữ antibiotic bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” là kháng lại, còn “bios” là sự sống. Thuật ngữ này được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân biệt penixillin với sulfonamit đã được phát hiện từ những năm 1930. Thuật ngữ này đã được thay đổi sau khi penixillin và các chất kháng khuẩn khác đã được cải tiến và tổng hợp mới trong phòng thí nghiệm. Ngày nay, thuật ngữ này được sử dụng rộng rãi hơn để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặc tổng hợp hoàn toàn có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp.
Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như là một chất hoá trị liệu có khả năng kháng virut, động vật nguyên sinh, tế bào ung thư…Tất cả các CKS đều có tính độc chọn lọc. Mỗi chất kháng sinh thường chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định. Một số CKS sử dụng ngoài mục địch y học có tầm quan trọng trong sinh thái như agroxin, bacterioxin, yếu tố gây chết (killer factor), microxin… 1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh Alexander Fleming, người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS – nhà sinh vật học người Anh làm việc tại viện St.
Mary, London, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10 năm 1928. Trong khi tiến hành thí nghiệm, ông đã quan sát thấy một hiện tượng lạ: trên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus bị nhiễm một loại nấm mốc xanh và xung quanh vùng nấm mọc thì vi khuẩn không thể phát triển được. Điều đó chứng tỏ rằng loại nấm này đã sinh ra một chất ức chế sự phát triển và tiêu diệt S. Fleming đã phân lập và định tên loại vi nấm này là Penicillium notatum và đặt tên cho chất kháng khuẩn Êy là penixillin.
16 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Một thập kỷ sau, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh vật häc vµ sinh ho¸ häc Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành một “loại thuốc thần kỳ”. Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã sự khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh. Năm 1939, Rene’ Jules Dubos nuôi cấy Bacillus brevis phân lập từ vùng New Jersey và tách được một hỗn hợp gồm hai chất khác nhau là gramixidin và tiroxidin. Sau đó ít lâu Abraham, Waksman, Schatz và Bugie [82, 135, 172] đã phát hiện ra streptomixin, chất này có tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn G(-), đặc biệt là trực khuẩn lao.
Tốc độ tìm kiếm chất kháng sinh ngày càng được đẩy mạnh. Những năm 1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS. Hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện trong gia đoạn này có ứng dụng trong y học như: actinomixin (Waksman,1940), chloramphenicol (Erhlich,1947), chlotetraxyclin (Dugar, 1948), [172]. Trong suốt những năm 1960 và 1970, ngành công nghiệp về kháng sinh đã bùng nổ khắp thế giới.
Vào đầu năm 1970, hơn 270 CKS đã được sản xuất. Vào những năm 1990, nhiều công ty dược phẩm đã đầu tư để nghiên cứu và phát triển, tìm ra các chất kháng sinh mới do tình trạng kháng thuốc lan tràn của các vi sinh vật gây bệnh. Vào khoảng những năm 1993 đến 2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn đã tăng lên từ 90 đến 120 (Công bố tại Hội nghị Khoa học về tác nhân kháng khuẩn và hoá trị liệu). Tại hội nghị này 21 công ty dược phẩm lớn đã trình bày các phương pháp để khám phá ra các CKS mới [45,129].
Như vậy, sau hơn 70 năm kể từ khi khám phá ra CKS, đến nay, số lượng CKS được phát hiện lên tới trên 17. Tuy nhiên chỉ có 1-2 % CKS đủ tiêu chuẩn để sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học. Thị trường CKS trên thế giới, theo thống kê năm 2002 đã đạt doanh số 26 tỷ đôla [174], và sẽ vẫn còn tăng khoảng 0,6% từ năm 2002-2008. Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân.
Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đang phải đối mặt với “thời kỳ hậu kháng sinh” (post antibiotic era). Chính vì thế nhiệm vụ 17 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com đặt ra của ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các CKS cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển (R&D) để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn. Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới.
Có thể nói ngành công nghiệp sản xuất CKS vẫn đang là một trong những hướng phát triển mạnh mẽ nhất trong công nghệ sinh học. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinh vật học, Hoá sinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao. Dưới đây là các mốc thời gian phát hiện ra các CKS trong những năm vừa qua. Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau 1.
CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật. Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất kháng sinh và cấu trúc hiển vi của tế bào. Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì thường có cơ chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần giống nhau thì có hoạt phổ tương tự như nhau. Đồng thời nó còn phụ thuộc vào nồng độ.
Một số chất 18 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com kháng sinh khi ở nồng độ thấp không những không tác dụng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật mà còn kích thích vi sinh vật phát triển. Ngoài ra, cùng một chất kháng sinh như nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế tác động cũng có thể không hoàn toàn giống nhau. Nhìn chung, cơ chế tác dụng của CKS được thể hiện theo năm phương thức sau .Ức chế tổng hợp thành tế bào Thành tế bào của vi khuẩn là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp suất thẩm thấu. Thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào là peptidoglycan (PG).
PG là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polisaccarit bao gồm đơn phân là các dẫn xuất của đường glucoza nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách liên tục (NAG- NAM). Để tạo thành mạng lưới thực sự vững chắc, các chuỗi polisaccarit của PG phải liên kết chéo với nhau thông qua một đoạn peptit ngắn giữa các tetrapeptit của tiểu phần NAM. Để có thể sinh trưởng và phân chia, tế bào phải tổng hợp các đơn vị PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí sinh trưởng của thành tế bào [135]. Phần lớn các tác nhân kháng khuẩn thông thường đều hoạt động dựa trên sự ức chế quá trình hình thành liên kết chéo giữa các tetrapeptit của tiểu phần NAM.
Nổi bật nhất giữa các chất này là các kháng sinh -lactam mà đại diện là penixillin và cephalosporin. Đây là các chất kháng khuẩn có vùng chức năng là các vòng - lactam. Các kháng sinh -lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn với transpeptidaza là enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuỗi PG, kìm hãm hoạt tính của enzym này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn [135]. Tuy nhiên, cần chú ý rằng các chất kháng sinh này chỉ hoạt động ở giai đoạn tế bào đang sinh trưởng vì các tế bào già hay ở trạng thái nghỉ không sinh tổng hợp PG.
Các penixillin không thấm qua được màng ngoài của vi khuẩn Gram (-) nên hiệu quả chống các vi khuẩn này rất thấp, tuy nhiên các penixillin và cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài vi khuẩn Gram (-). Tế bào của người không có PG nên các kháng sinh -lactam rất ít độc đối với tế bào người [135, 172]. 19 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Các chất kháng sinh khác như vancomyxin do Streptomyces orientalis sinh ra và CKS bán tổng hợp xycloserin ức chế sự hình thành thành tế bào theo một cách khác. Chúng cản trở trực tiếp đến sự hình thành cầu D-alanin-D-alanin liên kết các tiểu phần NAM của các vi khuẩn Gram (+).
Tuy nhiên, các vi khuẩn không có cầu D-alanin-D-alanin có khả năng đề kháng tự nhiên đối với những chất kháng sinh này. Một chất kháng sinh ức chế tổng hợp thành tế bào khác là bacitracin ngăn cản sự vận chuyển các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vị trí tổng hợp của thành tế bào. Cũng như các CKS -lactam, vancomyxin, xycloserin và bacitraxin làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào và làm tế bào bị phá vỡ do áp suất thẩm thấu [135]. Liên kết với protein thụ thể Người ta cho rằng, một số protein liên kết với penixillin–(Peniciline Binding Protein (PBP) nằm trên màng tế bào vi khuẩn) là các đích cho các penixillin và các cephalosporin liên kết.
Tất cả các vi khuẩn đều có loại protein này, ví dụ Staphylococcus aureus có 4 PBP còn E.coli thì có ít nhất là 7 PBP. Các PBP này hoạt động như các enzym và biểu hiện hoạt tính của cacbocylpeptidaza, transpeptidaza, enđopeptidaza và transglycozylaza. Song vai trò chính xác của các PBP, bất kể thuộc hoạt tính enzym nào, trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào, vẫn chưa được biết rõ, và vì vậy cơ chế phân tử của hoạt động gây chết của các chất kháng sinh nhóm β-lactam vẫn chưa được giải thích. Ức chế sự tổng hợp protein Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S của riboxom gồm các aminoglycozit và các tetraxyclin.
Aminoglycozit bao gồm streptomyxin, gentamyxin, neomyxin, kanamyxin, amykaxin, tobramyxin…Chúng gắn vào tiểu phần 30S của riboxom, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra sự bắt cặp không chính xác giữa các codon của ARNt và các anticodon của ARNvc tương ứng.