Bộ môn vi sinh vật học khoa sinh học đại học khoa học tự nhiên đại học quốc gia hà nội

Khám phá bộ môn vi sinh vật học tại Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, nơi nghiên cứu và giảng dạy hàng đầu.

• Tác giả: Nguyễn Hoàng Tuấn
• Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Lương
• Trường học: Đại học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu vi khuẩn Bifidobacteria trong probiotics
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Định nghĩa probiotic
• 1.2. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic
• 1.3. Lợi ích của probiotic
• 1.4. Sinh học phân tử
• 1.5. Môi trường sống
• 1.6. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
• 1.7. Sự trao đổi carbohydrate
• 1.8. Nhiệt độ và pH sinh trưởng tối ưu
• 1.9. Độ nhạy cảm oxy
• 1.10. Bifidobacteria mang đặc tính probiotic
• 1.11. Giảm tiêu chảy
• 1.12. Làm giảm sự không dung nạp lactose
• 1.13. Ức chế Helicobacter pylori
• 1.14. Phòng ngừa bệnh viêm ruột
• 1.15. Phòng ung thư đại trực tràng
• 1.16. Một số loài bifidobacteria đã được thương mại hóa
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Chủng vi khuẩn
• 2.2. Môi trường
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phân loại bằng sinh học phân tử
• 2.5. Nghiên cứu đặc tính probiotic và tuyển chọn chủng
• 2.6. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 2.7. Khả năng sinh trưởng
• 2.8. Khả năng sinh axít hữu cơ
• 2.9. Khả năng chịu muối mật
• 2.10. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột
• 2.11. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột mô phỏng
• 2.12. Khả năng chịu kháng sinh
• 2.13. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng Bifidobacterium
• 2.13.1. Lựa chọn môi trường nuôi thích hợp
• 2.13.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp
• 2.13.3. Lựa chọn pH nuôi thích hợp
• 2.13.4. Lựa chọn nguồn cacbon nuôi thích hợp
• 2.13.5. Lựa chọn nguồn Nitơ nuôi thích hợp
• 2.13.6. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
• 2.13.7. Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít
• 2.13.7.1. Chế độ khuấy đảo
• 2.13.7.2. Tỷ lệ giống cấy
• 2.13.7.3. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
• 2.14. Bước đầu nghiên cứu một số loại chất mang thích hợp cho quá trình đông khô các chủng Bifidobacterium
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và phân loại
• 3.1.1. Phân lập và quan sát hình thái
• 3.1.2. Tách DNA genome và xác định gen F-6-PPK
• 3.1.3. Phân loại dựa vào trình tự rDNA 16S
• 3.2. Nghiên cứu các đặc tính probiotic và lựa chọn chủng Bifidobacterium
• 3.2.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 3.2.2. Khả năng sinh trưởng và sinh axít hữu cơ
• 3.2.3. Khả năng chịu muối mật
• 3.2.4. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột
• 3.2.5. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột
• 3.2.6. Khả năng chịu kháng sinh
• 3.3. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng của hai chủng Bifidobacterium
• 3.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
• 3.3.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi thích hợp
• 3.3.3. Lựa chọn pH nuôi thích hợp
• 3.3.4. Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp
• 3.3.5. Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp
• 3.3.6. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
• 3.3.7. Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium trên thiết bị lên men 5 lít
• 3.3.7.1. Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp
• 3.3.7.2. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
• 3.3.7.3. Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
• 3.3.8. Lựa chọn chất mang thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi khuẩn Bifidobacteria trong probiotics

Vi khuẩn Bifidobacteria là một trong những thành phần chính trong các chế phẩm probiotics. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe đường ruột và hỗ trợ hệ miễn dịch. Nghiên cứu về Bifidobacteria đã chỉ ra rằng chúng có khả năng cải thiện tiêu hóa, giảm triệu chứng rối loạn tiêu hóa và tăng cường sức khỏe tổng thể. Việc hiểu rõ về Bifidobacteria sẽ giúp phát triển các sản phẩm probiotics hiệu quả hơn.

1.1. Định nghĩa và vai trò của Bifidobacteria trong probiotics

Bifidobacteria là một nhóm vi khuẩn Gram dương, kỵ khí, có mặt chủ yếu trong đường ruột của con người và động vật. Chúng có khả năng sản xuất các chất có lợi cho sức khỏe như axit lactic và các vitamin. Bifidobacteria giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và hỗ trợ tiêu hóa.

1.2. Lợi ích sức khỏe của Bifidobacteria

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Bifidobacteria có thể giúp giảm triệu chứng tiêu chảy, cải thiện tình trạng không dung nạp lactose và hỗ trợ điều trị các bệnh viêm ruột. Chúng cũng có khả năng ức chế sự phát triển của Helicobacter pylori, một tác nhân gây bệnh dạ dày.

II. Thách thức trong nghiên cứu và ứng dụng Bifidobacteria

Mặc dù Bifidobacteria có nhiều lợi ích, nhưng việc nghiên cứu và ứng dụng chúng trong sản xuất probiotics vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như sự đa dạng của các chủng Bifidobacteria, khả năng sống sót trong điều kiện tiêu hóa và sự tương tác với các vi sinh vật khác cần được giải quyết.

2.1. Đa dạng và phân loại các chủng Bifidobacteria

Có nhiều loài Bifidobacteria khác nhau, mỗi loài có đặc tính sinh học và lợi ích sức khỏe riêng. Việc phân loại chính xác các chủng này là rất quan trọng để phát triển các sản phẩm probiotics hiệu quả.

2.2. Khả năng sống sót của Bifidobacteria trong đường tiêu hóa

Một trong những thách thức lớn nhất là đảm bảo rằng Bifidobacteria có thể sống sót qua môi trường khắc nghiệt của đường tiêu hóa. Nghiên cứu cần tập trung vào việc cải thiện khả năng chịu đựng của chúng đối với axit và muối mật.

III. Phương pháp nghiên cứu Bifidobacteria trong probiotics

Để nghiên cứu Bifidobacteria, các phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn là rất quan trọng. Các nghiên cứu thường sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định và phân loại các chủng Bifidobacteria.

3.1. Phương pháp phân lập Bifidobacteria

Phân lập Bifidobacteria từ các mẫu thực phẩm hoặc phân là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Các phương pháp nuôi cấy chọn lọc giúp tách biệt các chủng Bifidobacteria từ các vi khuẩn khác.

3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu Bifidobacteria

Sử dụng các kỹ thuật như PCR và giải trình tự gen giúp xác định chính xác các chủng Bifidobacteria. Điều này không chỉ giúp phân loại mà còn đánh giá các đặc tính probiotic của chúng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Bifidobacteria trong sản xuất probiotics

Bifidobacteria được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các chế phẩm probiotics cho con người và động vật. Chúng có mặt trong nhiều sản phẩm như sữa chua, thực phẩm chức năng và dược phẩm.

4.1. Sản phẩm probiotics chứa Bifidobacteria

Nhiều sản phẩm trên thị trường hiện nay chứa Bifidobacteria, giúp cải thiện sức khỏe đường ruột và tăng cường hệ miễn dịch. Các sản phẩm này thường được khuyến nghị cho những người có vấn đề về tiêu hóa.

4.2. Nghiên cứu và phát triển sản phẩm mới từ Bifidobacteria

Nghiên cứu hiện tại đang tập trung vào việc phát triển các sản phẩm mới từ Bifidobacteria, nhằm tối ưu hóa lợi ích sức khỏe và cải thiện hiệu quả của các chế phẩm probiotics.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu Bifidobacteria

Nghiên cứu về Bifidobacteria trong probiotics đang mở ra nhiều cơ hội mới cho sức khỏe con người. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều sản phẩm mới và hiệu quả hơn.

5.1. Tương lai của Bifidobacteria trong ngành công nghiệp thực phẩm

Với sự gia tăng nhu cầu về sản phẩm probiotics, Bifidobacteria sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm. Nghiên cứu sẽ giúp phát triển các sản phẩm mới đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo về Bifidobacteria

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của Bifidobacteria, cũng như phát triển các phương pháp nuôi cấy và bảo quản hiệu quả hơn để tối ưu hóa lợi ích sức khỏe của chúng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hệ vi sinh vật đường ruột của con người chứa mật độ vi khuẩn lên đến khoảng $10^{13} - 10^{14}$ tế bào, gấp 10-20 lần tổng số tế bào trong cơ thể. Trong đó, chi Bifidobacterium chiếm khoảng 25% số lượng vi khuẩn ở người lớn và lên đến 80% ở trẻ em, đóng vai trò quan trọng trong duy trì cân bằng hệ vi sinh và sức khỏe đường tiêu hóa. Probiotic, đặc biệt là các chủng Bifidobacterium, đã được chứng minh có nhiều lợi ích sức khỏe như giảm tiêu chảy, cải thiện không dung nạp lactose, ức chế vi khuẩn gây bệnh, phòng ngừa viêm ruột và ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các chế phẩm probiotic chứa Bifidobacterium chủ yếu là nhập khẩu hoặc sử dụng nguyên liệu ngoại, trong khi nghiên cứu về nguồn gốc, đặc tính và quy trình sản xuất chủng bản địa còn hạn chế.

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn các chủng Bifidobacterium có đặc tính probiotic tốt từ các nguồn gốc khác nhau tại Việt Nam, phân loại và đánh giá tính an toàn sinh học, đồng thời tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để sản xuất sinh khối cao phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic cho người và động vật. Phạm vi nghiên cứu bao gồm các mẫu phân từ trẻ em bú sữa mẹ, người lớn, động vật và các sản phẩm lên men thu thập tại Việt Nam trong giai đoạn 2016-2017. Kết quả nghiên cứu góp phần làm phong phú bộ sưu tập nguồn gen vi sinh vật quốc gia và thúc đẩy phát triển ngành công nghiệp probiotic trong nước, hướng tới giảm phụ thuộc nguyên liệu nhập khẩu và nâng cao chất lượng sản phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Định nghĩa và tiêu chí probiotic: Probiotic là vi sinh vật sống, khi sử dụng với số lượng thích hợp mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ. Tiêu chí lựa chọn chủng probiotic bao gồm an toàn (không gây bệnh, đạt chuẩn GRAS), khả năng chịu muối mật, axit, kháng kháng sinh, khả năng bám dính niêm mạc, sản xuất enzyme và các chất kháng khuẩn.

• Sinh học phân tử và phân loại vi khuẩn: Sử dụng gen mã hóa enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK) và trình tự gen 16S rRNA để xác định và phân loại các chủng Bifidobacterium. Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự 16S rRNA giúp xác định mối quan hệ họ hàng và phân nhóm chủng.

• Đặc điểm sinh lý sinh hóa: Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí, hình que phân nhánh, sử dụng con đường fructose-6-phosphate (bifid shunt) để chuyển hóa carbohydrate, sinh axit acetic và lactic với tỷ lệ lý thuyết 3:2. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 37-41°C, pH từ 6,5-7,0, nhạy cảm với oxy nhưng có sự khác biệt giữa các chủng.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Thu thập 15 mẫu phân và sản phẩm lên men từ các nguồn khác nhau tại Việt Nam, bao gồm phân trẻ em bú sữa mẹ, người lớn, động vật (gà, lợn), sữa lên men và nước thải.

• Phân lập và nuôi cấy: Sử dụng môi trường MRSc (MRS bổ sung L-cysteine 0,05%) trong điều kiện yếm khí, ủ ở 37°C. Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi sau nhuộm Gram để chọn chủng nghi ngờ Bifidobacterium.

• Phân loại sinh học phân tử: Tách DNA genome theo phương pháp cải biến từ Gabor et al. (2003). Xác định gen F-6-PPK bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu, khuếch đại gen 16S rRNA, giải trình tự và phân tích trình tự bằng phần mềm CLUSTAL W, xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Kimura và Saitou-Nei với 1000 lần bootstrap.

• Đánh giá đặc tính probiotic: Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào (caseinase, amylase, lipase, cellulase), khả năng sinh trưởng (đo OD600, CFU/ml), sinh axit hữu cơ (định lượng bằng chuẩn độ NaOH), khả năng chịu muối mật (0,3%, 0,5%, 1%), kháng vi khuẩn gây bệnh (Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus) bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, khả năng tồn tại trong dịch dạ dày và ruột mô phỏng (pH 3 với pepsin, pH 8 với pancreatin), và khả năng chịu kháng sinh phổ biến.

• Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: Thử nghiệm 7 môi trường nuôi khác nhau, các mức nhiệt độ (20-55°C), pH (4-9), nguồn cacbon (glucose, fructose, lactose, maltose, tinh bột...), nguồn nitơ (cao men, peptone, casein...), thời gian nuôi (0-60 giờ), tốc độ khuấy (10-50 vòng/phút), tỷ lệ giống cấy (1-15%) trên thiết bị lên men 5 lít.

• Nghiên cứu chất mang đông khô: Thử nghiệm 4 loại chất mang (skim milk, tinh bột tan, lactose, glucose) cho quá trình đông khô, đánh giá mật độ tế bào sau sấy và bảo quản ở 4°C trong 4 tuần.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và phân loại: Từ 15 mẫu thu thập, phân lập được 50 chủng vi khuẩn với hình thái đa dạng, trong đó 20 chủng nghi ngờ thuộc chi Bifidobacterium dựa trên hình thái tế bào đặc trưng. Xác định gen F-6-PPK cho thấy 15 chủng thuộc chi Bifidobacterium, phân tích trình tự 16S rRNA phân nhóm thành 3 nhóm chính: 7 chủng thuộc Bifidobacterium animalis subsp. lactis, 4 chủng Bifidobacterium longum, 4 chủng Bifidobacterium bifidum.

2. Đặc tính probiotic: Các chủng được đánh giá có khả năng sinh enzyme ngoại bào đa dạng, sinh trưởng tốt với mật độ tế bào đạt khoảng $10^8$ CFU/ml sau 24-48 giờ. Khả năng sinh axit hữu cơ dao động từ 0,5 đến 1,2 mg/ml, phù hợp với đặc tính probiotic. Khả năng chịu muối mật ở nồng độ 0,3-1% cho thấy đa số chủng có thể tồn tại trong môi trường đường tiêu hóa. Các chủng thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh với vòng ức chế >1 mm, đặc biệt với Escherichia coli và Salmonella enterica. Khả năng tồn tại trong dịch dạ dày và ruột mô phỏng đạt trên 70% sau 4 giờ và 16 giờ tương ứng. Khả năng chịu kháng sinh phổ biến như ampicillin, erythromycin, tetracycline được ghi nhận ở mức độ khác nhau.

3. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: Môi trường MRSc được lựa chọn là môi trường nuôi thích hợp nhất với OD600 đạt 1,8 sau 24 giờ. Nhiệt độ tối ưu là 37°C, pH tối ưu từ 6,5 đến 7,0. Nguồn cacbon glucose và lactose hỗ trợ sinh trưởng tốt nhất, nguồn nitơ cao men và peptone được ưu tiên. Thời gian nuôi tối ưu là 24-36 giờ để đạt sinh khối cao. Tốc độ khuấy 30 vòng/phút và tỷ lệ giống cấy 5% được xác định là điều kiện tối ưu trên thiết bị lên men 5 lít.

4. Chất mang đông khô: Skim milk và lactose là hai chất mang phù hợp nhất cho quá trình đông khô, giữ được mật độ tế bào trên $10^7$ CFU/g sau 4 tuần bảo quản ở 4°C, trong khi tinh bột tan và glucose có hiệu quả thấp hơn.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và phân loại cho thấy nguồn gen Bifidobacterium bản địa tại Việt Nam đa dạng và phù hợp với các loài probiotic phổ biến trên thế giới, góp phần làm phong phú bộ sưu tập nguồn gen quốc gia. Khả năng sinh enzyme ngoại bào và sinh axit hữu cơ phù hợp với các nghiên cứu trước đây, chứng minh tiềm năng ứng dụng trong sản xuất probiotic. Khả năng chịu muối mật và tồn tại trong dịch tiêu hóa mô phỏng cho thấy các chủng có thể sống sót và hoạt động hiệu quả trong đường ruột, tương tự các nghiên cứu quốc tế.

Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả sản xuất sinh khối, giảm chi phí và tăng tính ổn định của sản phẩm probiotic. Kết quả phù hợp với các nghiên cứu về nhiệt độ, pH và nguồn dinh dưỡng cho Bifidobacterium. Chất mang skim milk và lactose hỗ trợ bảo quản vi khuẩn sống tốt hơn, phù hợp với các ứng dụng thực phẩm và dược phẩm.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tăng trưởng (OD600 theo thời gian), bảng so sánh khả năng chịu muối mật và kháng khuẩn, cây phát sinh chủng loại 16S rRNA, và biểu đồ mật độ tế bào sau đông khô với các chất mang khác nhau để minh họa rõ ràng các phát hiện.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển bộ sưu tập chủng probiotic bản địa: Tăng cường phân lập và lưu giữ các chủng Bifidobacterium có đặc tính probiotic tốt tại các trung tâm nghiên cứu và bảo tàng giống chuẩn nhằm đa dạng hóa nguồn gen phục vụ nghiên cứu và sản xuất.

2. Ứng dụng quy trình nuôi cấy tối ưu: Áp dụng các điều kiện nuôi cấy đã được tối ưu (môi trường MRSc, 37°C, pH 6,5-7,0, nguồn cacbon glucose/lactose, thời gian 24-36 giờ) trong sản xuất sinh khối probiotic quy mô công nghiệp để nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm trong vòng 1-2 năm.

3. Phát triển sản phẩm probiotic nội địa: Khuyến khích các doanh nghiệp thực phẩm và dược phẩm sử dụng chủng Bifidobacterium bản địa đã được tuyển chọn để sản xuất các chế phẩm probiotic phù hợp với thị trường Việt Nam, giảm nhập khẩu nguyên liệu, trong vòng 3 năm.

4. Nghiên cứu sâu về cơ chế tác động và an toàn: Tiếp tục nghiên cứu các cơ chế sinh học phân tử và đánh giá an toàn lâm sàng của các chủng probiotic bản địa nhằm đảm bảo hiệu quả và an toàn cho người tiêu dùng trong vòng 3-5 năm.

5. Đào tạo và nâng cao năng lực nhân lực: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật phân lập, phân loại và sản xuất probiotic cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên nhằm nâng cao chất lượng nghiên cứu và sản xuất.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp phương pháp phân lập, phân loại và đánh giá đặc tính probiotic chi tiết, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng nghiên cứu chuyên sâu.

2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và probiotic: Tham khảo quy trình tối ưu hóa nuôi cấy và lựa chọn chủng probiotic bản địa để phát triển sản phẩm phù hợp với thị trường trong nước, giảm chi phí nhập khẩu.

3. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế, nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách phát triển ngành probiotic, thúc đẩy sản xuất trong nước và đảm bảo an toàn thực phẩm.

4. Bệnh viện và phòng khám chuyên khoa tiêu hóa: Tham khảo các chủng probiotic có tiềm năng hỗ trợ điều trị các bệnh lý tiêu hóa như tiêu chảy, không dung nạp lactose, viêm ruột, từ đó áp dụng trong điều trị bổ trợ.

Câu hỏi thường gặp

1. Bifidobacterium có vai trò gì trong hệ vi sinh đường ruột?
   Bifidobacterium chiếm khoảng 25% vi khuẩn đường ruột người lớn và 80% ở trẻ em, giúp cân bằng hệ vi sinh, sản xuất axit hữu cơ, ức chế vi khuẩn gây bệnh và hỗ trợ miễn dịch.

2. Tiêu chí lựa chọn chủng probiotic là gì?
   Chủng probiotic phải an toàn (không gây bệnh, đạt chuẩn GRAS), chịu được axit dạ dày, muối mật, có khả năng bám dính niêm mạc, kháng kháng sinh, sản xuất enzyme và chất kháng khuẩn, mang lại lợi ích sức khỏe đã được chứng minh.

3. Phương pháp phân loại Bifidobacterium trong nghiên cứu này là gì?
   Sử dụng PCR xác định gen F-6-PPK đặc trưng chi Bifidobacterium và giải trình tự gen 16S rRNA để phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại.

4. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho Bifidobacterium là gì?
   Môi trường MRSc, nhiệt độ 37°C, pH 6,5-7,0, nguồn cacbon glucose hoặc lactose, nguồn nitơ cao men hoặc peptone, thời gian nuôi 24-36 giờ, tốc độ khuấy 30 vòng/phút và tỷ lệ giống cấy 5%.

5. Chất mang nào phù hợp cho quá trình đông khô Bifidobacterium?
   Skim milk và lactose là hai chất mang phù hợp nhất, giúp duy trì mật độ tế bào trên $10^7$ CFU/g sau 4 tuần bảo quản ở 4°C.

Kết luận

• Phân lập thành công 15 chủng Bifidobacterium bản địa từ các nguồn khác nhau tại Việt Nam, thuộc các loài B. animalis subsp. lactis, B. longum và B. bifidum.
• Các chủng có đặc tính probiotic tốt, bao gồm khả năng sinh enzyme ngoại bào, sinh axit hữu cơ, chịu muối mật, kháng vi khuẩn gây bệnh và tồn tại trong dịch tiêu hóa mô phỏng.
• Điều kiện nuôi cấy tối ưu được xác định giúp nâng cao sinh khối, phù hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp.
• Skim milk và lactose là chất mang đông khô hiệu quả, đảm bảo duy trì mật độ vi khuẩn sống trong bảo quản.
• Nghiên cứu góp phần làm phong phú nguồn gen probiotic bản địa, hỗ trợ phát triển ngành công nghiệp probiotic trong nước, giảm phụ thuộc nguyên liệu nhập khẩu.

Tiến trình tiếp theo: Triển khai ứng dụng quy trình nuôi cấy và sản xuất probiotic quy mô pilot, mở rộng nghiên cứu cơ chế tác động và đánh giá an toàn lâm sàng, đồng thời phát triển sản phẩm probiotic nội địa.

Hành động khuyến nghị: Các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý nên phối hợp để thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng probiotic bản địa, nâng cao chất lượng sản phẩm và sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Định nghĩa probiotic Probiotic xuất phát từ tiếng Hy Lạp và có nghĩa là "cho cuộc sống", ban đầu được nó được sử dụng với ý nghĩa trái ngược với từ "kháng sinh". Tuy nhiên, định nghĩa này đã được cải tiến trong những năm qua. Ban đầu, probiotic được mô tả là chất tăng cường sức khoẻ của bệnh nhân suy dinh dưỡng, kích thích sự phát triển của các vi sinh vật khác, hoặc góp phần vào cân bằng vi khuẩn đường ruột.

Các định nghĩa gần đây cho thấy rằng probiotic bao gồm các vi sinh vật sống [62]. Trong đó, định nghĩa của Fuller (1992) được sử dụng rộng rãi: “Probiotic như là một chất bổ sung vi sinh vật sống, tác động có lợi đến vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột”. Theo khuyến cáo của một nhóm làm việc cho FAO / WHO về việc đánh giá probiotic trong thực phẩm, probiotic được định nghĩa là "các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp mang lại lợi ích cho sức khoẻ"[23]. Tiêu chí lựa chọn các chủng probiotic [62] Tiêu chuẩn an toàn  Có nguồn gốc rõ ràng.

 Xác định chính xác về phân loại.  Không độc hại, không gây bệnh, đạt tiêu chuẩn GRAS.  Đặc tính chủng: Chịu kháng sinh ở nồng độ thấp và có hoạt động trao đổi chất trong cơ thể vật chủ. Tính phù hợp về công nghệ  Có khả năng sản xuất và bảo quản số lượng lớn  Mật độ cao (ưu tiên 106 -108 CFU/ml,g).

 Mang lại các tính chất cảm quan mong muốn (hoặc không có những phẩm chất không mong muốn).  Ổn định di truyền.  Kháng Phage. 3 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Tiêu chuẩn chức năng  Kháng với muối mật và axit.

 Bám dính được vào bề mặt niêm mạc.  Có khả năng sống sót, tăng sinh và hoạt động trao đổi chất ở vị trí mục tiêu trong cơ thể sống.  Có khả năng sinh bacteriocin, axit hữu cơ và một số các chất kháng khuẩn để cạnh tranh với các vi khuẩn khác.  Có khả năng mang lại một hoặc nhiều lợi ích về sức khoẻ được kiểm chứng lâm sàng.

Tiêu chuẩn sinh lý và ảnh hưởng đến sức khỏe mong muốn  Phản ứng đối với vi khuẩn gây bệnh / ung thư.  Sản sinh các chất chống vi khuẩn (bacteriocin, hydrogen peroxide, axit hữu cơ hoặc hợp chất ức chế khác).  Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (enzyme, vắc-xin, peptide).  Cải thiện các phản ứng miễn dịch.

 Giảm dị ứng lactose.  Giảm cholesterol huyết thanh.  Phòng ngừa một số loại bệnh tiêu chảy. Lợi ích của probiotic Các tác động có lợi cho sức khoẻ của probiotic, được ghi nhận đối với một số chủng nhất định, bao gồm ngăn ngừa một số loại bệnh tiêu chảy, đặc biệt do rotavirus, giảm các triệu chứng liên quan đến việc sử dụng kháng sinh quá nhiều, giảm tỷ lệ dị ứng ở người dễ bị dị ứng, cải thiện đáp ứng miễn dịch, giảm hiện tượng không dung nạp lactose và giảm các chất chuyển hóa không có lợi.

Một số ảnh hưởng có lợi khác liên quan đến sức khoẻ, thông qua việc sử dụng probiotic như sau: phòng ngừa hoặc giảm triệu chứng viêm ruột mạn tính, giảm nguy cơ tiêu chảy cấp ở trẻ em, giảm nguy cơ nhiễm trùng đường hô hấp, ức chế Helicobacter pylori và giảm cholesterol huyết thanh [45]. 4 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Hơn nữa, probiotic có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột và các cơ quan khác bằng cách điều biến các thông số miễn dịch, tính thấm qua ruột hoặc bằng cách cung cấp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học. Các cơ chế được nghiên cứu bởi De Vrese và Schrezenmeir (2008) bao gồm: Giảm pH ruột; Sản xuất các chất diệt khuẩn (ví dụ axit hữu cơ, H2O2 và bacteriocin); Sự kết tụ các vi sinh vật gây bệnh; Tăng cường sự vững chắc cho các chất nền lên men hoặc thụ thể trên bề mặt tế bào niêm mạc ruột; Hấp thu và chuyển hóa các chất có khả năng gây bệnh, độc hại hoặc ung thư; Điều biến các cơ chế miễn dịch; Kích thích nhu động ruột và sản xuất chất nhầy [16]. Giới thiệu Năm 1899, Tissier quan sát và phân lập vi khuẩn hình chữ Y trong phân của trẻ sơ sinh bú mẹ và gọi nó là "Bacillus bifidus communis" (Lat.

Bifidus: đứt đoạn, phân nhánh). Tuy nhiên, do sự tương đồng với lactobacilli, bifidobacteria đã được đưa vào chi Lactobacillus. Và mãi cho đến khi đến khi hệ thống phân loại vi khuẩn mới của Bergey ra đời trong ấn bản cùng tên tái bản lần thứ VIII, chúng mới được phân loại lại và công nhận là một chi riêng. Khác với Lactobacillus, bifidobacteria có fructose-6-phosphate phosphoketolase, không có aldolase hoặc glucose-6-phosphate dehydrogenase và có hàm lượng G+C trong DNA cao nằm trong khoảng từ 55 đến 67%.

Bifidobacteria catalase âm tính, ngoại trừ B. Chi Bifidobacterium, gồm 42 loài, thuộc Họ Bifidobacteriaceae, Bộ Bifidobacteriales, Phân lớp Actinobacteridae, Lớp Actinobacteria, Ngành Firmicutes, Giới Vi khuẩn[7]. Hình thái Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, sống kỵ khí, không di động, không hình thành bào tử , tế bào thường cong, hình que phân nhánh, dạng đơn lẻ, xếp chuỗi hoặc tạo thành các cụm, dạng chữ “Y” hoặc “V” (Hình 1. 5 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Hình 1.1: Hình dạng tế bào đặc trưng của Bifidobacterium [71] 1.

Sinh học phân tử Phân loại đến chi Bifidobacteria có enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-PPK) (EC 4.22), tham gia vào quá trình phân huỷ glucose qua con đường phosphoketolase hay còn gọi là "bifid shunt" thông qua erythrose-4-phosphate và acetyl-phosphate, đây là điểm khác biệt với vi khuẩn đường ruột khác. Do đó enzyme này cũng như gen mã hóa cho nó được dùng để làm phân tử chỉ thị cho nhóm này [5]. Phân loại đến loài Sự khác biệt của các loài trong chi thường dựa vào sự đồng nhất DNA-DNA hoặc các đặc tính hình thái khác nhau. Trong những năm gần đây, sự chú ý của nhiều nhà khoa học về mặt phân loại đã được thu hút vào các đầu dò DNA và gen rRNA.

Các chuỗi DNA được sử dụng phổ biến nhất để nhận diện bifidobacteria ở chi và mức độ loài là gen 16S rRNA và 23S rRNA, cũng như vùng gen internal transcribed spacer (ITS) nằm giữa các gen rRNA 16S và 23S. Đặc biệt, trình tự rDNA 16S có 9 vùng biến đổi, đặc biệt thích hợp để thiết kế oligonucleotides dùng để định danh đến loài nhóm bifidobacteria. Ngoài ra, ưu điểm của việc sử dụng các gen rRNA là số lượng bản sao của chúng trong một tế bào vi khuẩn khá cao. Roy và cộng sự (1996) đã nghiên cứu thiết kế được các oligonucleotides dựa trên chuỗi 16S rDNA sử dụng cho B.

Sau đó, Matsuki và cộng sự (1998, 1999) đã 6 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội thiết kế được các cặp primer đặc hiệu cho hầu hết các loài Bifidobacterium sống ở đường ruột của con người như: B. Ngoài phân tích trình tự rDNA 16S, SR 23S và 16S-23S, hiện nay để phân biệt các loài có mối quan hệ gần gũi cùng thuộc chi Bifidobacterium, trình tự gen của protein ưa nhiệt 60 kDa (HSP60) được sử dụng. HSP60 là một protein thuộc họ chaperonin, thành viên họ này có trong tất cả các vi khuẩn và tế bào eukaryote ở các cơ quan như ty thể và lục lạp, gen HSP60 không dễ dàng chuyển từ một vi khuẩn này sang vi khuẩn khác, tính bảo thủ cao và có một bản sao trong gần như tất cả các loài vi khuẩn, do đó rất đặc trưng cho từng loài vi khuẩn. Những đặc điểm trên cho thấy HSP60 một đại phân tử thích hợp cho nghiên cứu phát sinh loài của các loài vi khuẩn có mối quan hệ gần gũi với nhau.

7 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Hình 1.2: Cây phát sinh các loài thuộc chi Bifidobacterium dựa trên trình tự rDNA 16S [24] 8 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội 1. Môi trường sống Môi trường sống của bifidobacteria chủ yếu là trong đường ruột của động vật máu nóng. Đôi khi chúng là tác nhân gây bệnh ở con người (chủ yếu là sâu răng) nhưng thường chúng được coi là không gây bệnh. Thông thường, các loài Bifidobacterium là đặc trưng đối với người và động vật; Ngoài ra, đã có nghiên cứu chứng minh rằng bifidobacteria có trong nước thải và trong các sản phẩm sữa lên men [6].

Ruột của trẻ sơ sinh bị xâm chiếm bởi vi sinh vật từ hệ sinh dục của người mẹ và môi trường bên ngoài. Ngoài ra, các nghiên cứu mới cho thấy việc di chuyển vi khuẩn từ tuyến ruột sang tuyến vú của người mẹ có thể là nguồn lây nhiễm cho sữa mẹ và dẫn đến sự lây lan sang ruột của trẻ sơ sinh [47]. Các nghiên cứu sử dụng công nghệ lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) cho thấy bifidobacteria chiếm tới 75% tổng số vi khuẩn trong phân của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và đến 91% trẻ bú sữa mẹ [28]. Theo thời gian số lượng bifidobacteria trong đường tiêu hoá của con người giảm dần, các vi sinh vật trong phân của trẻ em tương tự như người lớn sau hai năm đầu đời.

Ở người cao tuổi, số lượng bifidobacteria thấp hơn, trong khi số lượng Clostridium trong phân tăng lên [51]. 9 | Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Nguyễn Hoàng Tuấn – K24 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học 2017 Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội Bảng 1.1: Môi trường sống của các loài thuộc chi Bifidobacterium Loài Chủng Nguồn Phân lập từ người B. adolescentis ATCC15703T Phân, ruột thừa, răng bị sâu và âm đạo người lớn B.