Luận văn: Thử nghiệm vắc xin phòng 3 bệnh viêm phổi lợn - Nguyễn Thị Quỳnh Ánh

Luận văn thạc sĩ đánh giá hiệu quả vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra trên lợn.

• Tác giả: Nguyễn Thị Quỳnh Ánh
• Người hướng dẫn: TS. Trần Đức Hạnh
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu thử nghiệm vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• Tính cấp thiết của đề tài
• Mục tiêu của đề tài
• Ý nghĩa khoa học và thực tế
• 1. Ý nghĩa khoa học
• 2. Ý nghĩa thực tế
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra
• 1.1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae
• 1.1.2. Bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn do A. pleuropneumoniae
• 1.1.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra
• 1.2. Vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi ở lợn do P. multocida gây ra
• 1.2.1. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn P. multocida
• 1.2.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn P. multocida gây ra
• 1.3. Vi khuẩn S. suis và bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra
• 1.3.1. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn S. suis và bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn S. sui gây ra
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.1.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu chế tạo vắc xin đa giá nhũ dầu phòng viêm phổi ở lợn
• 2.4. Động vật thí nghiệm
• 2.5. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
• 2.6.2. Phương pháp chế tạo vắc xin phòng bệnh viêm phổi cho lợn
• 2.6.3. Phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của đàn lợn sau tiêm phòng vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis
• 2.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.7.1. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ
• 2.7.2. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis phân lập được; chọn chủng vi khuẩn chế tạo vắc xin thử nghiệm
• 3.1.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được
• 3.1.2. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
• 3.1.3. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S.suis phân lập được
• 3.2. Kết quả chế tạo vắc xin thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi cho lợn
• 3.2.1. Chọn giống vi khuẩn chế tạo vắc xin thử nghiệm
• 3.2.2. Kết quả chế tạo vắc xin thử nghiệm phòng viêm phổi cho lợn
• 3.3. Kết quả xác định độ dài miễn dịch và hiệu lực của vắc xin thử nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên
• 3.3.1. Kết quả xác định độ dài miễn dịch của vắc xin thử nghiệm
• 3.3.2. Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên
• KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tại sao nghiên cứu vắc xin đa giá viêm phổi lợn là cấp thiết

Ngành chăn nuôi lợn chiếm một tỷ trọng quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp tại Việt Nam. Tuy nhiên, sự phát triển của ngành luôn đối mặt với thách thức từ dịch bệnh, đặc biệt là các bệnh về đường hô hấp. Viêm phổi ở lợn, thường xuất hiện dưới dạng hội chứng hô hấp phức hợp trên lợn (PRDC), là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra thiệt hại kinh tế do bệnh viêm phổi. Bệnh không chỉ gây tỷ lệ chết cao mà còn làm giảm tăng trọng, tăng chi phí thuốc thú y và ảnh hưởng đến chất lượng thịt. Sự phức tạp của PRDC, do nhiều tác nhân vi khuẩn và virus gây ra đồng thời, khiến việc phòng bệnh bằng vắc xin đơn giá trở nên kém hiệu quả. Do đó, việc nghiên cứu vắc xin đa giá phòng viêm phổi ở lợn không chỉ là một giải pháp khoa học tiên tiến mà còn là một yêu cầu cấp bách từ thực tiễn sản xuất. Một loại vắc xin có khả năng bảo hộ chống lại nhiều mầm bệnh cùng lúc sẽ giúp đơn giản hóa phác đồ phòng bệnh cho heo, giảm thiểu sử dụng kháng sinh và nâng cao hiệu quả chăn nuôi một cách bền vững. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Quỳnh Ánh (2019) đã nhấn mạnh tính cấp thiết này khi chỉ ra rằng tại Việt Nam chưa có vắc xin đa giá nào kết hợp cả ba vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis sử dụng chất bổ trợ nhũ dầu, một công nghệ giúp kéo dài thời gian miễn dịch.

1.1. Phân tích thiệt hại kinh tế do bệnh viêm phổi phức hợp

Bệnh viêm phổi ở lợn gây ra những tổn thất kinh tế nặng nề trên nhiều phương diện. Chi phí trực tiếp bao gồm tiền thuốc điều trị, chi phí nhân công chăm sóc lợn bệnh và tỷ lệ lợn chết. Chi phí gián tiếp còn lớn hơn, bao gồm việc lợn chậm lớn, giảm hiệu suất chuyển hóa thức ăn (FCR), và giảm chất lượng thân thịt khi xuất chuồng. Lợn mắc bệnh thể mãn tính, dù không chết, vẫn là nguồn lây nhiễm tiềm tàng trong đàn và có sức khỏe yếu, dễ mắc các bệnh kế phát khác. Việc sử dụng kháng sinh kéo dài để điều trị không chỉ tốn kém mà còn làm tăng nguy cơ kháng kháng sinh, một vấn đề nghiêm trọng cho cả thú y và y tế công cộng. Do đó, đầu tư vào việc phát triển vắc xin thú y hiệu quả, đặc biệt là vắc xin tổ hợp cho heo, là một chiến lược kinh tế thông minh, giúp giảm chi phí phòng trị và tối ưu hóa lợi nhuận cho người chăn nuôi.

1.2. Thách thức từ hội chứng hô hấp phức hợp trên lợn PRDC

Hội chứng hô hấp phức hợp trên lợn (PRDC) là một tình trạng bệnh lý phức tạp, thường không do một tác nhân duy nhất gây ra. Nó là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố môi trường (stress, mật độ nuôi, thông thoáng chuồng trại), các tác nhân virus khởi phát như Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS), Circovirus tuýp 2 (PCV2), và các tác nhân vi khuẩn kế phát như Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), Mycoplasma hyopneumoniae (gây bệnh suyễn lợn), Pasteurella multocida và Streptococcus suis. Sự kết hợp này tạo ra một vòng xoáy bệnh lý, khiến triệu chứng lâm sàng trở nên trầm trọng và việc điều trị trở nên khó khăn. Việc phòng bệnh bằng vắc xin đơn giá cho từng mầm bệnh riêng lẻ vừa tốn kém, vừa tăng số lần tiêm gây stress cho vật nuôi. Đây chính là thách thức lớn nhất thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu vắc xin đa giá phòng viêm phổi ở lợn, nhằm tạo ra một lá chắn miễn dịch toàn diện hơn.

II. Phân tích các vi khuẩn mục tiêu trong vắc xin đa giá lợn

Để phát triển một vắc xin kết hợp phòng bệnh hô hấp ở lợn hiệu quả, việc xác định và hiểu rõ các tác nhân gây bệnh mục tiêu là bước đi tiên quyết. Một vắc xin đa giá thành công phải chứa các kháng nguyên đặc hiệu từ những chủng vi khuẩn phổ biến và có độc lực cao nhất tại địa bàn lưu hành dịch. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy ba loại vi khuẩn: Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), Pasteurella multocida, và Streptococcus suis là những tác nhân vi khuẩn kế phát hàng đầu trong hội chứng hô hấp phức hợp trên lợn (PRDC). Mỗi loại vi khuẩn này có những yếu tố độc lực riêng, gây ra các tổn thương đặc trưng trên phổi và các cơ quan khác. Ví dụ, APP nổi tiếng với khả năng sản sinh ngoại độc tố (Apx-Toxins) gây hoại tử và xuất huyết phổi, dẫn đến bệnh viêm phổi dính sườn điển hình. Pasteurella multocida thường gây viêm phổi nhục hóa, trong khi Streptococcus suis không chỉ gây viêm phổi mà còn có thể gây viêm màng não, viêm khớp và nhiễm trùng huyết. Việc kết hợp kháng nguyên của cả ba vi khuẩn này trong một mũi tiêm duy nhất nhằm mục đích kích thích cơ thể lợn tạo ra đáp ứng miễn dịch ở lợn một cách đồng bộ, sẵn sàng chống lại sự xâm nhiễm từ nhiều hướng.

2.1. Độc lực của Actinobacillus pleuropneumoniae APP

Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) là tác nhân chính gây bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm, một bệnh có tỷ lệ tử vong cao. Độc lực của APP chủ yếu đến từ các ngoại độc tố Apx (ApxI, ApxII, ApxIII, ApxIV) và lớp vỏ polysaccharide (CPS). Các độc tố này gây dung giải tế bào, phá hủy đại thực bào phế nang và gây tổn thương mạch máu, dẫn đến các ổ hoại tử xuất huyết đặc trưng trên phổi. Lớp vỏ CPS giúp vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào của hệ miễn dịch vật chủ. Theo tài liệu của Nguyễn Thị Quỳnh Ánh (2019), các serotype khác nhau của APP sản sinh ra các loại độc tố khác nhau, quyết định mức độ độc lực của chúng. Vì vậy, một vắc xin hiệu quả cần chứa các thành phần giải độc tố (toxoid) và kháng nguyên từ các serotype phổ biến để tạo ra sự bảo hộ chéo.

2.2. Vai trò của Pasteurella multocida và Streptococcus suis

Pasteurella multocida thường là tác nhân kế phát sau khi đường hô hấp của lợn đã bị tổn thương bởi các virus hoặc vi khuẩn khác. Các chủng P. multocida thuộc serotype A và D là phổ biến nhất. Chủng serotype D có khả năng sản sinh độc tố hoại tử da (Dermanecrotic toxin - DNT), góp phần gây ra bệnh viêm mũi teo truyền nhiễm. Trong khi đó, Streptococcus suis, đặc biệt là serotype 2, không chỉ gây bệnh trên đường hô hấp mà còn là tác nhân gây bệnh toàn thân nguy hiểm. Nó có thể gây viêm màng não, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, và nhiễm trùng huyết, dẫn đến chết đột ngột. Sự hiện diện của hai vi khuẩn này làm cho bệnh cảnh lâm sàng của PRDC trở nên phức tạp và khó điều trị, nhấn mạnh sự cần thiết phải đưa chúng vào thành phần của vắc xin đa giá.

III. Hướng dẫn quy trình nghiên cứu vắc xin đa giá viêm phổi lợn

Quy trình nghiên cứu vắc xin đa giá phòng viêm phổi ở lợn là một quá trình khoa học phức tạp, đòi hỏi sự chính xác và tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn. Quá trình này bắt đầu từ việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ thực địa. Các mẫu bệnh phẩm từ lợn mắc bệnh được thu thập, sau đó tiến hành nuôi cấy để phân lập các chủng vi khuẩn mục tiêu. Các chủng này sau đó phải trải qua quá trình giám định đặc tính sinh hóa, xác định serotype và quan trọng nhất là đánh giá độc lực. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Quỳnh Ánh (2019), độc lực được xác định bằng phương pháp tiêm truyền trên động vật thí nghiệm (chuột bạch) để tính liều gây chết 50% (LD50). Chỉ những chủng có độc lực cao, tính kháng nguyên ổn định mới được lựa chọn làm giống sản xuất vắc xin. Bước tiếp theo là sản xuất sinh khối vi khuẩn bằng hệ thống lên men công nghiệp, sau đó vi khuẩn được vô hoạt bằng hóa chất (ví dụ: formalin) để tiêu diệt mầm bệnh nhưng vẫn giữ nguyên cấu trúc kháng nguyên. Cuối cùng, kháng nguyên vô hoạt được phối trộn với chất bổ trợ vắc xin để tạo thành sản phẩm hoàn chỉnh.

3.1. Phương pháp chế tạo vắc xin vô hoạt nhũ dầu

Phương pháp chế tạo vắc xin vô hoạt nhũ dầu là một kỹ thuật tiên tiến được áp dụng trong nghiên cứu này. Sau khi các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được nuôi cấy trong môi trường lên men sục khí để đạt mật độ cao, chúng được thu hoạch và vô hoạt. Canh trùng vi khuẩn vô hoạt của từng loại sau đó được phối hợp với nhau theo một tỷ lệ đã được tính toán. Hỗn hợp kháng nguyên này được nhũ hóa với một chất bổ trợ vắc xin dạng nhũ dầu (ví dụ Montanide™ của Seppic). Chất bổ trợ nhũ dầu có vai trò quan trọng trong việc tạo ra một 'kho' kháng nguyên tại vị trí tiêm. Kháng nguyên sẽ được giải phóng từ từ, giúp kích thích hệ miễn dịch của lợn một cách kéo dài và mạnh mẽ hơn so với các chất bổ trợ truyền thống như keo phèn. Điều này giúp tạo ra đáp ứng miễn dịch ở lợn bền vững và kéo dài thời gian bảo hộ, giảm số lần phải tái chủng.

3.2. Công nghệ sản xuất vắc xin và tiêu chuẩn kiểm nghiệm

Việc sản xuất vắc xin phải được thực hiện trên dây chuyền công nghệ hiện đại, đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối. Từ khâu chuẩn bị môi trường, nhân giống, lên men, vô hoạt, phối trộn đến đóng chai đều phải tuân thủ các quy trình thực hành sản xuất tốt (GMP). Sau khi sản xuất, mỗi lô vắc xin phải trải qua một quy trình kiểm nghiệm chất lượng nghiêm ngặt. Các chỉ tiêu kiểm tra bao gồm: kiểm tra vô trùng (để đảm bảo không có vi sinh vật ngoại lai tạp nhiễm), kiểm tra an toàn (tiêm trên động vật thí nghiệm như chuột bạch để đảm bảo vắc xin không gây phản ứng sốc hoặc gây chết) và kiểm tra hiệu lực ban đầu. Việc ứng dụng công nghệ sản xuất vắc xin tái tổ hợp cũng là một hướng đi tiềm năng trong tương lai, cho phép tạo ra các vắc xin an toàn và tinh khiết hơn bằng cách chỉ sử dụng các protein kháng nguyên đặc hiệu thay vì toàn bộ tế bào vi khuẩn.

IV. Phương pháp đánh giá hiệu quả vắc xin phòng viêm phổi lợn

Việc đánh giá hiệu quả vắc xin là giai đoạn quan trọng nhất, quyết định sự thành công của một công trình nghiên cứu. Quá trình này bao gồm cả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và thử nghiệm thực địa. Trong phòng thí nghiệm, hiệu lực vắc xin thường được đánh giá bằng phương pháp thay thế trên chuột bạch. Chuột được tiêm vắc xin, sau đó được công cường độc bằng các chủng vi khuẩn gây bệnh. Tỷ lệ sống sót của lô chuột tiêm vắc xin so với lô đối chứng không tiêm sẽ phản ánh hiệu lực bảo hộ ban đầu của vắc xin. Tuy nhiên, kết quả quan trọng nhất phải đến từ thử nghiệm lâm sàng vắc xin cho lợn. Thí nghiệm này được thiết kế với hai lô: lô thí nghiệm được tiêm vắc xin theo phác đồ và lô đối chứng không tiêm, cả hai được nuôi trong cùng điều kiện. Hiệu quả của vắc xin được đánh giá thông qua nhiều chỉ số, bao gồm khả năng tạo kháng thể, khả năng bảo hộ khi công cường độc (nếu có) và hiệu quả bảo hộ trong điều kiện thực địa.

4.1. Giám sát đáp ứng miễn dịch của lợn qua hiệu giá kháng thể

Để đánh giá đáp ứng miễn dịch ở lợn, các mẫu máu được thu thập định kỳ từ cả hai lô thí nghiệm và đối chứng tại các thời điểm khác nhau sau tiêm (ví dụ: 30, 60, 90, 120, 150 ngày). Huyết thanh được tách chiết và sử dụng để đo lường hiệu giá kháng thể bằng các phản ứng huyết thanh học, chẳng hạn như phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA). Kết quả từ nghiên cứu của Nguyễn Thị Quỳnh Ánh (2019) cho thấy, lô lợn được tiêm vắc xin đa giá có hiệu giá kháng thể tăng cao rõ rệt và duy trì ở mức bảo hộ (≥ 1/16) trong suốt 5 tháng theo dõi. Trong khi đó, lô đối chứng có hiệu giá kháng thể rất thấp hoặc âm tính. Dữ liệu này là bằng chứng khoa học trực tiếp, chứng minh vắc xin có khả năng kích thích hệ miễn dịch của lợn sản sinh ra kháng thể đặc hiệu một cách mạnh mẽ và bền vững.

4.2. Đánh giá hiệu lực bảo hộ của vắc xin trong điều kiện thực địa

Hiệu quả cuối cùng của vắc xin được khẳng định qua khả năng bảo vệ đàn lợn trong điều kiện chăn nuôi thực tế. Các nhà nghiên cứu theo dõi và so sánh tỷ lệ mắc bệnh viêm phổi, tỷ lệ sử dụng kháng sinh, tỷ lệ chết và các chỉ số năng suất (tăng trọng, FCR) giữa đàn lợn được tiêm phòng và đàn không được tiêm phòng. Dữ liệu từ luận văn cho thấy, tại các vùng thử nghiệm, tỷ lệ lợn mắc viêm phổi ở nhóm được tiêm vắc xin thấp hơn đáng kể so với nhóm không tiêm. Việc tính toán nguy cơ tương đối (RR) cũng cho thấy những con lợn không được tiêm phòng có nguy cơ mắc bệnh cao hơn nhiều lần. Kết quả này không chỉ chứng minh hiệu lực bảo hộ của vắc xin mà còn khẳng định ý nghĩa thực tiễn của nó trong việc cải thiện an toàn sinh học trong chăn nuôi lợn và mang lại lợi ích kinh tế cho người sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước đây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae. pleuropneumoniae đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn, là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu gram âm, kích thước khoảng 0,3 - 0,5 x 0,6 - 1,4 µm.

Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô ( một số chủng không có giáp mô cũng đã được quan sát thấy). Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5 - 2 x 60 - 450 nm. Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide được tìm thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn A. Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn A.

pleuropneumoniae có khả năng lên men đường glucose, xylose, mannitol, mannose, sucrose và không lên men đường arabinose, lactose, raffinose, sorbitol. Nghiên cứu đặc tính sinh hóa cho thấy vi khuẩn A. pleuropneumoniae có phản ứng urease và oxidase dương tính; phản ứng cAMP dương tính hoặc âm tính (tùy thuộc vào serotype của vi khuẩn); phản ứng âm tính với sinh Indol; phản ứng catalase âm tính, một số chủng cho phản ứng dương tính nhẹ (tùy thuộc vào serotype của vi khuẩn); không mọc trên thạch MacConkey (Moller và cs, 1996). Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn A.

pleuropneumoniae được chia thành 2 biotype chính dựa trên nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Biotype 1 cần có NAD, còn biotype 2 thì không đòi hỏi NAD trong quá trình nuôi cấy, song vẫn cần 4 có các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotid cho quá trình tổng hợp NAD. Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2. Biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào.

Ở biotype 2 có serotype 2; 4; 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên như biotype 1. Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 được phát hiện và được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 (Nielsen và cs, 1997). Các yếu tố độc lực Nhiều nghiên cứu đã cho thấy độc lực ở các serotype khác nhau của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn được quyết định bởi các ngoại độc tố mà chúng sản sinh ra (Devenish và cs, 1990; (Frey và Bosse , 1993) Polysaccharide vỏ, lipopolysaccharide, protein màng, protein thu nhận sắt, yếu tố bám dính, ngoại độc tố và một vài loại enzym có liên quan cũng đóng vai trò quan trọng đối với độc lực của vi khuẩn A.

Hiểu biết về thành phần và cấu trúc kháng nguyên chủ yếu liên quan đến độc tính, độc lực của vi khuẩn sẽ cung cấp các thông tin quan trọng, là cơ sở khoa học cho việc phát triển kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh đặc hiệu cũng như chế tạo vắc xin. - Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin): Mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn do ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn. Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn A.

pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố. Các độc tố này được xếp vào nhóm RTX- toxin và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII, ApxIII (Frey và Bosse, 1993); Cho và Chae, 2001). Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các serotype khác nhau của vi khuẩn A. + ApxII là độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung bình và có trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa (Frey và Nicolet, 1988).

Trước đây ApxII được gọi là HlyII, ClyII hay CytII (Frey và Nicolet, 1990). Tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae đều tiết ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 (Kamp và cs, 1994; Rayamajhi và cs, 2005). 5 Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các gen apxIICA và thiếu các gen bài tiết tương ứng.

Sự tiết ApxII phụ thuộc vào gen apxIBD và gen này được tìm thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae, ngoại trừ serotype 3. + ApxIII là độc tố không làm tan huyết, nhưng lại là độc tố dung giải tế bào mạnh với trọng lượng phân tử 120 kDa. Trước kia ApxIII được đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) (Rycroft và cs, 1991a; Macdonald và Rycroft, 1992; Jansen và cs, 1993).

ApxIII được phân biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII do không gây dung huyết, nhưng lại gây dung giải mạnh các tế bào khác. ApxIII giống 50% với ApxI và HlyI của vi khuẩn E. Vùng gen điều hòa (operon) mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng gen điều hòa (operon) cho apxI (Chang và cs, 1993). Theo (Rayamajhi và cs, 2005) protein độc tố ApxIII được tiết ra bởi serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của A.

+ ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A. pleuropneumoniae đã được phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA. Gen ApxIVA được phát hiện thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae và điều đó chứng tỏ nó có tính chất đặc trưng cho loài.

Vai trò của độc tố ApxIV với vật chủ trong quá trình gây bệnh hiện chưa được nghiên cứu kỹ, song đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và được tạo ra từ gen độc tố của vi khuẩn A. Không có serotype nào của A. pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra cả ba loại độc tố Apx, chủ yếu là có khả năng tạo ra 2 độc tố. Các serotype 1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra ApxI và ApxII; serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII.

Một số lượng nhỏ các serotype chỉ sản sinh một độc tố Apx như serotype 10 sản sinh ApxI, serotype 7 và serotype 12 sản sinh ApxII (Frey và Nicolet, 1990; Frey và cs, 1993, 1994). Độc lực của các serotype A. pleuropneumoniae thay đổi từ mức độ mạnh đến yếu tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra. Theo (Frey và Nicolet, 1990) những serotype sản sinh ra một hoặc hai độc tố thường có độc lực mạnh hơn những serotype không sản sinh ra độc tố.

pleuropneumoniae serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm. Điều 6 này cho thấy độc tố là yếu tố quan trọng xác định độc lực của vi khuẩn A. Đồng thời tác giả đã làm thí nghiệm gây đột biến các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5 để không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII và sau đó dùng các chủng đã đột biến làm giống gốc sản xuất vắc xin cũng cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên.

Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A. Thành phần heptose và glucose trong LPS của A. pleuropneumoniae cao hơn so với ở một vài loài vi khuẩn Gram âm khác như E. Jensen và Bertram (1986) đã tìm thấy LPS từ vi khuẩn A.

pleuropneumoniae có độc lực cao thuộc serotype 5 có nhiều galactose hơn thể phân lập không độc cùng serotype 5. LPS thành tế bào có ý nghĩa quan trọng trong việc gây ra đáp ứng miễn dịch của vật chủ sau khi A. pleuropneumoniae xâm nhiễm. - Polysaccharide vỏ vi khuẩn (Capsule polysaccharide - CPS): Vi khuẩn A.

pleuropneumoniae được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có bản chất là các polysaccharide. Lớp vỏ polysaccharide này tích điện âm và được cấu tạo bởi các đơn vị Oligosaccharide, các polymer của axit teichoic gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate diester, hoặc các polymer Oligosaccharide gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate. Polysaccharide vỏ vi khuẩn là một trong những thành phần quyết định độc lực của vi khuẩn và cũng là một nhân tố quyết định tính đặc hiệu serotype của vi khuẩn (Ward và Inzawa, 1997). Polysaccharide vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định đặc trưng của hiện tượng phát ánh ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi trường nuôi cấy.

Lớp vỏ của A. pleuropneumoniae có độ dầy từ 80 - 230 nm tùy thuộc vào các serotype khác nhau. Đã có những ý kiến cho rằng sự khác biệt về độ dầy lớp vỏ dẫn đến sự khác nhau về độc lực. pleuropneumoniae độc lực cao có lớp vỏ dầy, trong khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng hoặc dễ dàng bị phá vỡ.

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy những chủng có độc lực có kích thước lớn hơn và có lớp vỏ bám dính dầy hơn so với những chủng ít độc; lớp vỏ của vi khuẩn A. pleuropneumoniae không chỉ có ý nghĩa trong quá trình gây bệnh mà còn có vai trò quan trọng trong chẩn đoán và dịch tễ. 7 - Các protein màng ngoài (Outer membrane proteins - OMPs): Protein màng ngoài của A. pleuropneumoniae có trọng lượng phân tử 43 kDa và có thể thay đổi tùy theo hàm lượng NAD cung cấp trong môi trường nuôi cấy.

Các protein mang sắt nằm trên màng ngoài, sau đó các đặc tính cùng chuỗi gen của chúng cũng được Gonzalez và cs (1995); Chung và cs (2007) nghiên cứu xác định. pleuropneumoniae sản sinh một vài loại protein màng ngoài (OMPs) và các protein này được cho là có vai trò trong đáp ứng miễn dịch. Hơn nữa, các kháng thể kháng OMPs của A. pleuropneumoniae được chứng minh tác động như một chất opsonin quan trọng chống đại thực bào và bạch cầu đơn nhân.

pleuropneumoniae có khả năng tổng hợp hai protein mới khi được nuôi trong môi trường thiếu sắt và có các kháng thể chống lại chúng. Hiện tượng xuất hiện các polypeptid này chỉ có được ở trong cơ thể sống. Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy có một số receptor transferrin đặc hiệu ở lợn và khả năng phát triển của A. pleuropneumoniae với transferrin vận chuyển sắt.

Các phân tích về mặt di truyền các yếu tố mã hóa cho receptor các protein transferrin được nhận dạng bởi hai gen nằm trên một operon. Theo quy định gen tbpB (mã hóa cho protein Tbp2 có khối lượng phân tử dao động từ 59,8 đến 65,5 kDa) và gen tbpA (mã hóa cho protein Tbp1 với trọng lượng chính xác 102,2 kDa). Theo các chứng minh ngược dòng trên operon tbp gợi ý rằng các ion sắt ở môi trường điều khiển gen tbp qua protein Fur (Gerlach và cs, 1992).