Đặt vấn đề Trong thế kỷ XXI, Các lĩnh vực sản xuất công nghiệp vẫn là xương sống của hầu hết quốc gia trên Thế giới. Hiện nay ở Việt Nam, sự gia tăng dân số vượt ngưỡng 90 triệu người là cơ hội và cũng là thách thức không nhỏ. Được thiên nhiên ưu đãi với nguồn tài nguyên, thiên nhiên phong phú, sự phát triển nhanh chóng của công nghiệp đang đem lại lợi ích không thể phủ nhận. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển đó thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm nghiêm trọng do những chất thải công nghiệp gây ra.
Môi trường đất và nước ở nhiều đô thị, khu công nghiệp và làng nghề bị ô nhiễm do thiếu các công trình, thiết bị và biện pháp xử lý chất thải hiệu quả. Mỗi ngành công nghiệp khác nhau lại tạo ra nguồn ô nhiễm và gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí ở những mức độ khác nhau. Tùy vào loại và mức độ ô nhiễm mà có những biện pháp xử lý riêng biệt. Tuy nhiên, có một số phương pháp xử lý ô nhiễm chính là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và sự kết hợp của các phương pháp này.
So với phương pháp vật lý và phương pháp hóa học thì phương pháp xứ lý ô nhiễm môi trường bằng sinh học sử dụng vi sinh vật đã và đang được đặc biệt quan tâm do lợi ích về mặt kinh tế và thân thiện với môi trường mà phương pháp này đem lại. Vi sinh vật được sử dụng trong xử lý bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào có khả năng chuyển hóa và phân hủy các hợp chất hữu cơ khó phân hủy. Trong số các enzyme ngoại bào laccase, chitinase, cellulase, protease đã và đang được quan tâm nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam do khả năng những ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực. Đặc biệt, laccase có phổ cơ chất rộng và được ứng dụng trong công nghệ sinh học môi trường (phân hủy các chất vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm v.), công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
Vi khuẩn Bacillus được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi do chúng có khả năng sinh bào tử, sinh trưởng trong những điều kiện khắc nghiệt và khả năng sinh một số enzyme ngoại bào đề cập ở trên. Một số đại diện của vi khuẩn này như Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis… n 2 Do đó đề tài “Sàng lọc và nghiên cứu một số chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào được phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì và vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà của Việt Nam” đã được tiến hành, với nội dung sau: • Sàng lọc các chủng vi khuẩn được phân lập từ lá mục và đất mùn rừng Quốc Gia Ba Vì và vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà có khả năng sinh một hoặc một số enzyme ngoại bào. • Phân loại và định tên chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào với hoạt tính cao theo phương pháp truyền thống và xác định trình tự gene mã hóa 16S rRNA. • Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như môi trường, pH, nồng độ chất cảm ứng, nhiệt độ lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn.
• Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng được tuyển chọn. Mục tiêu nghiên cứu Sàng lọc được chủng Bacillus có khả năng sinh một số enzyme ngoại bào (laccase, proteinase, chitinase, cellulase). Xác định một số điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủng Bacillus lựa chọn sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có hoạt tính cao và ổn định. Mục đích nghiên cứu Tăng cường, nâng cao kĩ năng thực hành, kiến thức chuyên môn và đóng góp một phần khả năng nghiên cứu khoa học của sinh viên.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài Tuyển chọn được các chủng có họat tính enzyme tốt và ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường n 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Enzyme ngoại bào 2. Laccase Giới thiệu về laccase Laccase (p-benzenediol: oxygen oxyreductase, E.2) là một polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxy hóa. Trong phân tử có 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm và sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử.
Khác với phần lớn các enzyme, laccase có phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenthiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin và cả hợp chất vô cơ như iot. Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và côn trùng. Laccase lần đầu tiên được phát hiện ở cây Rhus vernicifera. Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tử, tính chất glycosyl hóa và các tính chất động học [46].
Nguồn laccase từ vi sinh vật Laccase được phân bố rộng rãi ở nấm, thực vật bậc cao, vi khuẩn, xạ khuẩn và côn trùng. Hơn 60 chủng nấm thuộc nhiều lớp khác nhau như: Ascomycete, Basidiomycetes và Deuteromycetes, được chứng minh là có khả năng sinh laccase [22]. Martins và cộng sự, cùng các tác giả khác đã đưa ra 1 số loài vi khuẩn và nấm quan trọng sinh laccase với hoạt tính cao được trình bày ở bảng 1.1 Các vi sinh vật sinh laccase Tài liệu tham Nguồn Tài liệu tham Nguồn sinh vật khảo sinh vật khảo Azospirillium Faure et al. (1994) Bacillus Martins et al.
lipoferum subtillis (2002) Vi khuẩn S. maltophilia Galai et al. (2009) Streptomyces Dube et al. AAP56 coelicolor (2008) Cerrena D’Souza – Ticlo et Pleurotus Abo-State et al.
(2009 ostreatus (2011) Lentinus Ferraroni et al Trametes sp. Li et al. (2008), tigrinus (2007) Guo et al. Nấm (2012) Pestalotigis Verma et al.
troggi Ciullini et al. Theo Hullo và cộng sự (2001), protein CotA từ áo bào tử của Bacillus subtilis biểu hiện tương đồng với khả năng của các enzyme oxy hóa đa nhân đồng, tuy nhiên không phải CotA từ các protein thuộc bào tử khác cũng có khả năng này. Từ đó chứng minh được CotA là 1 loại laccase [33]. Một nghiên cứu khác của Meyer và cộng sự cho thấy khả năng sinh CotA-type laccase từ chủng Bacillus pumilis [44].
Theo Kaushik và Thakur (2014), chủng Bacillussp. được phân lập từ nhà máy sản xuất rượu có khả năng sinh tổng hợp laccase ngoại bào với hoạt tính cao nhất là 107,32 U/ml [20]. n 5 Held và cộng sự (2005) đã tìm được bào tử sinh tổng hợp laccase từ chủng Bacillus sp. SF và những bào tử tự do này có khả năng loại hoàn toàn các loại thuốc nhuộm phổ biến như: Mordant Black 9, Mordant Brown 96/Mordant Brown 15 và Acid Blue 74 sau 90 phút [10].
Một nghiên cứu khác của Olukanni và cộng sự (2013) cho thấy, chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis RUN1 được phân lập từ mẫu đất trồng bắp cải có khả năng sinh laccase với hoạt tính cao nhất đạt 0,1043 ± U/min/mg protein, được xác định sau 24 giờ nuôi và sử dụng ABTS là cơ chất. Cũng trong nghiên cứu này, chủng B. thuringiensis RUN1 có khả năng loại 84,67 ± 1,19% màu malachite green (MG) nồng độ 40mg/l trong 6 giờ [38]. Cấu trúc phân tử laccase Phân tử laccase thường ở dạng monomeric protein, chỉ một số ở dạng oligomeric protein có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 - 90 kDa.
Tuy vậy, tất cả các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng thuộc 3 loại khác nhau nằm ở các vị trí khác nhau của enzyme. Bốn nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp đồng nguyên tử T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh [40].1 Cấu trúc không gian của phân tử laccase n 6 Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B ,C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đếu có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [32].
Ứng dụng của laccase Loại màu: công nghiệp dệt sử dụng một lượng lớn nước và hóa chất để phục vụ cho xử lý ướt. Những hóa chất này bao gồm các thành phần vô cơ và các thành phần hữu cơ. Laccase có khả năng phân hủy và loại màu thuốc nhuộm và các màu tổng hợp, điều đó giải thích vì sao những nghiên cứu về enzyme này được phát triển và sử dụng hiệu quả trong nhiều ngành công nghiệp [16]. Cũng theo Blanquez và cộng sự (2004), nấm Trametes versicolour loại được hoàn toàn màu Reactive Blue 15, Congo Red và Reactive Black 5, trong khi chỉ loại được một phần màu Brilliant Red 3G-P, Brilliant Yellow 3B-A và RBBR Trong công nghiệp giấy: các chất oxy hóa dựa vào clo và oxy được sử dụng để phân tách và phân hủy lignin – yêu cầu cần thiết để chuẩn bị cho giấy thành phẩm ở mức độ công nghiệp.
Khả năng phân hủy lignin bằng vi sinh vật đã được nghiên cứu sâu ở nấm, nhưng chưa được thực hiện nhiều ở vi khuẩn. Bugg và cộng sự (2011) đã đưa ra gợi ý về một số vi khuẩn đất, thường là vi khuẩn có khả năng phân hủy các hợp chất thơm để phân giải lignin [9]. Hiện tại, Bacillus sinh laccase kiềm tính,chịu nhiệt đã được nghiên cứu trong xử lý bột gỗ [51]. Một vài ứng dụng của laccase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau được trình bày ở bảng 1.1 Một số vi sinh vật sinh laccase và ứng dụng Ứng dụng Nguồn laccase Tài liệu tham khảo Aspergillus (chuyển gen) Soares et al., (2001) Aspergillus niger Soares et al., (2002) Cerrena unicolor Michniewicz et al., (2003) Loại màu thuốc Coriolopsis gallica Reyes et al., (1999) nhuộm Coriolopsis rigida Gómez et al., (2005) Trametes hirsute Campos et al., (2001) Trametes versicolor Claus et al., (2002) Cladosporium sphaerospermum Potin et al., (2004) Phân hủy Coprinus cinereus Kulys et al.
(2003) xenobiotics Myceliophtora thermophyla Nicotra et al. (2004) Panus tigrinus Zavarzina et al. (2004) Pyricularia oryzae Lante et al. (2000) Agaricus bisporus Timur et al.
versicolor Vianello et al. (2004) Cảm biến sinh học P. ostreatus Leite et al. (2003) Rhus vernicifera Gardiol et al.
(1996) Gliocladium virens Murugesan (2003) Lentinula edodes D'Annibale et al. (1999) Xử lý nước thải Pleurotus spp. Tsioulpas et al. (2002) Pycnoporus coccineus Jaouani et al.
strain AH28-2 Xiao et al. Laccase cũng được dùng vào các quá trình tăng cường hoặc thay đổi màu sắc xuất hiện trong thực phẩm và đồ uống.