MỞ ĐẦU Ung thư là tình trạng tăng sinh bất thường và mất kiểm soát của các tế bào và lan sang các bộ phận khác của cơ thể [1]. Ung thư được xem là mối lo ngại hàng đầu trên toàn cầu, với hơn 19,3 triệu ca mới và gần 10 triệu ca tử vong do ung thư theo thống kê vào năm 2020 [2]. Đây cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới tại 57/127 quốc gia [3]. Tại Việt Nam, hằng năm ước tính có khoảng 165.000 ca mắc ung thư và 115.000 ca tử vong do ung thư [4].
Hiện nay, có nhiều hướng tiếp cận được áp dụng trong điều trị ung thư, trong đó phổ biến nhất đó là sử dụng thuốc hóa trị. Tuy nhiên, tình trạng kháng thuốc dẫn đến việc điều trị bằng thuốc không hiệu quả là nguyên nhân gây ra tới 90% trường hợp điều trị thất bại và gây tử vong [5]. Kháng thuốc ung thư là tình trạng tế bào ung thư hình thành khả năng kháng lại tác dụng của thuốc hóa trị, qua đó khiến việc điều trị bằng thuốc trở nên kém hiệu quả hoặc hoàn toàn mất đi hiệu quả như mong đợi [6]. Kháng thuốc có thể phát sinh thông qua các cơ chế khác nhau, có thể phân loại thành kháng nội tại và kháng mắc phải [7].
Để khắc phục tình trạng này, các nghiên cứu hiện nay trên thế giới là hướng đến phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu để hướng đến tác động lên các con đường gây ra kháng thuốc và xác định các dấu ấn sinh học dự đoán để cá nhân hóa các phương pháp điều trị. Nuclear factor erythroid-2 p45-related factor 2 (Nrf2) - một yếu tố phiên mã đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa và tình trạng viêm nhiễm, đồng thời giúp duy trì cân bằng nội môi và ức chế quá trình lão hóa tế bào [8, 9]. Nrf2 có thể điều chỉnh sự biểu hiện của nhiều gen liên quan để bảo vệ tế nào chống lại quá trình sản sinh ung thư khi tiếp xúc với các gốc tự do, stress oxi hóa [10]. Nrf2 giữ vai trò điều hòa chính của tế bào, vì vậy nó cũng liên quan đến sự hình thành, tiến triển và di căn của tế bào [11].
Sự biểu hiện quá mức ổn định của Nrf2 ở tế bào ung thư lại làm tăng cường sức đề kháng của chúng đối với các tác nhân hóa trị liệu [12- 14], qua đó làm tăng khả năng kháng thuốc của tế bào [15]. Vì vậy, ức chế biểu hiện của Nrf2 hiện nay được xem là một mục tiêu đầy hứa hẹn trong chiến lược chống lại hiện tượng kháng thuốc ung thư. Việc ức chế trực tiếp hoặc gián tiếp biểu hiện của 1 Nrf2 có thể tăng khả năng nhạy cảm của tế bào ung thư với thuốc hóa trị và đảo ngược tình trạng kháng thuốc [16]. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và chứng minh rằng một số chiết xuất từ dược liệu có khả năng ức chế Nrf2 qua đó làm giảm thiểu tình trạng kháng thuốc.
Acid ascorbic, một chất ức chế Nrf2, đã khôi phục một phần độ nhạy cảm của tế bào với imatinib bằng cách điều chỉnh giảm biểu hiện của Nrf2 [17], đồng thời tăng độ nhạy cảm của tế bào HeLa với cisplatin và adriamycin [18]. Apigenin, một flavonoid được chiết xuất từ nhiều loại rau và trái cây, đã được báo cáo với khả năng làm các tế bào ung thư gan kháng doxorubicin trở nên nhạy cảm với doxorubicin và làm tăng doxorubicin nội bào [19]. Luteolin là một flavone có khả năng ức chế mạnh biểu hiện của Nrf2, với khả năng giảm 34% mức Nrf2 mRNA khi tác dụng đồng thời với actinomycin D sau 30 phút và 43% sau 1,5 giờ đối với tế bào ung thư biểu mô phổi A549 ở người [20]. Nguồn dược liệu phong phú với hơn 4.700 loài thực vật được sử dụng làm thuốc, là ưu thế rất lớn cho Việt Nam trong việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất thiên nhiên từ cây dược liệu.
Nhu cầu sử dụng dược liệu ở Việt Nam rất lớn, quy mô của ngành dược Việt Nam năm 2020 ước tính đạt khoảng 6,4 tỷ USD [21]. Tuy nhiên, việc sử dụng dược liệu Việt Nam hiện nay chủ yếu vẫn dựa trên kinh nghiệm dân gian và lưu truyền qua nhiều thế hệ mà chưa có những bằng chứng khoa học cụ thể. Các nghiên cứu tại Việt Nam được thực hiện trên quy mô nhỏ và thiếu tính thống nhất [22]. Ngoài ra, hầu hết các nghiên cứu sàng lọc hiện tại chỉ xác định khả năng gây độc tế bào ung thư mà chưa hướng đến sàng lọc hoạt chất nhắm mục tiêu trong hỗ trợ điều trị ung thư.
Sự đa dạng của dược liệu và hợp chất thiên nhiên đòi hỏi những mô hình sàng lọc thông lượng lớn, từ đó đưa ra định hướng nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất thiên nhiên, hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ dược liệu. Nhiều mô hình khác nhau đã được áp dụng trong sàng lọc các hợp chất ức chế biểu hiện gen, gồm sàng lọc thông lượng cao (High throughput screening), sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc hợp chất (structure-based virtual screening), phương pháp tiếp cận phân mảnh và một số phương pháp khác, trong đó thực nghiệm trên mô hình in vitro trên tế bào 2 để tiến hành sàng lọc các hợp chất tiềm năng là phương pháp phổ biến nhất [23]. Trong khi đó, phát xạ huỳnh quang và huỳnh quang sinh học là kỹ thuật được ứng dụng nhiều trong những năm gần đây với khả năng phát hiện nhanh chóng cho độ nhạy cao đối với mẫu có thể tích nhỏ và phù hợp với số lượng mẫu lớn [24, 25]. Do vậy, đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phát xạ huỳnh quang trong xây dựng mô hình sàng lọc dược liệu có khả năng ức chế Nrf2 ở tế bào ung thư gan Huh7” được thực hiện nhằm góp phần cung cấp những bằng chứng khoa học, làm căn cứ cho các nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của dược liệu Việt Nam trong việc hỗ trợ và điều trị tình trạng kháng thuốc trong ung thư thông qua việc ức chế biểu hiện của gen Nrf2 trên tế bào ung thư.
Sự phát quang 2. Định nghĩa Phát quang là quá trình phát xạ ánh sáng tự phát của một chất (có thể là hữu cơ hoặc vô cơ, hoặc thậm chí là một sinh vật sống), bởi tác động của các nguồn năng lượng khác, có thể diễn ra ở nhiệt độ bình thường và nhiệt độ thấp và không sinh ra do nhiệt [26]. Sự phát quang là sự phát xạ “lạnh” gây ra bởi sự chuyển động của các electron bên trong một chất từ trạng thái năng lượng cao hơn sang trạng thái năng lượng thấp hơn hoặc trạng thái bền [27]. Bước sóng của ánh sáng phát ra là đặc trưng của chất phát quang [28].
Điều này có thể được gây ra bởi sự hấp thụ các photon, phản ứng hóa học hoặc sinh hóa, hoạt động của các hạt hạ nguyên tử, bức xạ hoặc ứng suất lên tinh thể. Hiện tượng này có thể được quan sát trong tự nhiên như ở giun phát sáng, đom đóm và ở một số loài nhất định như một số vi khuẩn biển và động vật ở vùng biển sâu [29]. Hiện tượng này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau bởi các nhà khoa học khác nhau trên khắp thế giới, ví dụ như Khảo cổ học, Địa chất, Kỹ thuật y sinh, Hóa học, Vật lý và các ứng dụng công nghiệp khác nhau để kiểm soát chất lượng, nghiên cứu và phát triển [30]. Cơ chế phát quang Ánh sáng là một dạng bức xạ điện từ, gồm một điện trường dao động có từ trường dao động vuông góc với nó.
Ánh sáng được đặc trưng bởi bước sóng λ và tần số ν, và liên hệ với nhau bởi phương trình ν = c / λ, trong đó c = 3 x 10⁸ m/s là vận tốc ánh sáng. Khi ánh sáng chiếu vào vật chất, nó có thể đi qua vật chất mà không xảy ra sự hấp thụ, bị hấp thụ hoàn toàn hoặc bị hấp thụ một phần. Trong trường hợp bị hấp thụ bởi vật chất, năng lượng ánh sáng được truyền cho các phân tử trong quá trình hấp thụ. Sự hấp thụ năng lượng phải xảy ra theo đơn vị tích phân gọi là lượng tử.
Mối quan hệ lượng tử-năng lượng có thể được biểu thị bằng phương trình E = hν = hc / λ trong đó E là năng lượng, h là hằng số Planck (6,626 x 10⁻³⁴ J/s). 4 Theo cơ học lượng tử, các phân tử chỉ có thể tồn tại ở một số trạng thái xác định nhất định với các giá trị nội năng xác định. Phân tử có thể thay đổi trạng thái của nó từ trạng thái này sang trạng thái khác chỉ khi được cung cấp một phần năng lượng bằng sự chênh lệch năng lượng giữa hai trạng thái từ bên ngoài hoặc nếu nó được giải phóng hoặc mất đi ra bên ngoài. Đối với quá trình quang phát quang, sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng có thể được giải thích bằng sự chuyển tiếp của các electron giữa các trạng thái xác định nhất định.
Sự chuyển đổi giữa hai trạng thái của phân tử có thể được coi là sự chuyển đổi của một electron từ một quỹ đạo phân tử này đến quỹ đạo phân tử khác. Giản đồ Jablonski minh họa quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử [31]. Quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử được minh họa bằng giản đổ Jablonski (Hình 2. Trên sơ đồ, các đường in đậm biểu thị năng lượng cơ bản của từng trạng thái υ₀.
Các trạng thái năng lượng rung động bổ sung (υ₁, υ₂, υ₃, v.) được thể hiện bằng các đường mỏng hơn. Sự chuyển đổi đầu tiên trong hầu hết các sơ đồ Jablonski là sự hấp thụ một photon có năng lượng cụ thể của phân tử quan tâm, được biểu thị bằng một mũi tên thẳng hướng lên, màu xanh lam. Hấp thụ là phương pháp mà một electron bị kích thích từ mức năng lượng thấp hơn đến mức năng lượng cao hơn. Chỉ có những 5 bước sóng ánh sáng có năng lượng tương ứng với sự chênh lệch năng lượng giữa hai trạng thái riêng khác nhau của phân tử mới có thể được hấp thụ.
Năng lượng của photon được truyền cho electron. Electron đó sau đó chuyển sang trạng thái kích thích ở mức tương ứng với mức lượng năng lượng đã nhận. Khi một electron đi vào trạng thái kích thích, nó có thể có bội số spin khác nhau, tùy thuộc vào việc tổng xung lượng góc spin có được bảo toàn hay không. Nếu spin được bảo toàn thì electron được gọi là ở trạng thái kích thích đơn (S₁).
Nếu xung lượng góc không được bảo toàn thì electron chuyển sang trạng thái năng lượng bậc ba (T₁).