Luận văn thạc sĩ nhân dòng biểu hiện và tinh sạch streptonkinase tái tổ hợp từ chủng streptococus pyogenes trong echerichia coli

Luận văn thạc sĩ phân tích nhân dòng biểu hiện và tinh sạch streptonkinase tái tổ hợp từ chủng streptococus pyogenes trong, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Nguyễn Thị Thương
• Người hướng dẫn: PGS. Quyền Đình Thi
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nhân Dòng, Biểu Hiện Và Tinh Sạch Streptokinase Tái Tổ Hợp Từ Chủng Streptococcus Pyogenes Trong Escherichia Coli
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Chứng tắc nghẽn mạch máu
• 1.2. Quá trình đông máu
• 1.3. Cơ chế tan máu đông
• 1.4. Bệnh tắc nghẽn mạch máu
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.1.1. Tế bào và plasmid
• 2.1.2. Dung dịch và đệm
• 2.1.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Các phương pháp vi sinh vật
• 2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.2.3. Các phương pháp hóa sinh
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhân dòng gene mã hóa mSK-nonhis
• 3.2. Thiết kế plasmid biểu hiện mSK
• 3.3. Biểu hiện streptokinase nonhis
• 3.4. Tinh sạch streptokinase nonhis
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tinh sạch streptokinase tái tổ hợp

Nghiên cứu về tinh sạch streptokinase tái tổ hợp từ chủng Streptococcus pyogenes trong Escherichia coli đã mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Streptokinase là một enzyme có khả năng tiêu huyết khối, giúp làm tan các cục máu đông trong lòng mạch. Việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp không chỉ giúp giảm chi phí mà còn nâng cao hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này tập trung vào quy trình nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch enzyme này, nhằm tạo ra sản phẩm có độ tinh khiết cao và hoạt tính tốt.

1.1. Định nghĩa và vai trò của streptokinase trong y học

Streptokinase (SK) là một protein ngoại bào do các chủng Streptococcus sinh ra, có khả năng hoạt hóa plasminogen thành plasmin, enzyme có tác dụng tiêu fibrin. SK được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu như nhồi máu cơ tim và thuyên tắc phổi. Việc hiểu rõ về cơ chế hoạt động của SK là rất quan trọng để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

1.2. Tình hình nghiên cứu streptokinase tái tổ hợp hiện nay

Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp có thể thực hiện thông qua công nghệ sinh học, giúp giảm thiểu chi phí và tăng cường hiệu quả điều trị. Các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch enzyme này, nhằm đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng cao nhất.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu streptokinase tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu và sản xuất tinh sạch streptokinase tái tổ hợp vẫn gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính của enzyme sau khi tinh sạch. Các phương pháp tinh sạch hiện tại thường gặp khó khăn trong việc loại bỏ các tạp chất mà không làm giảm hoạt tính của enzyme. Ngoài ra, việc sản xuất enzyme trong môi trường vi sinh vật cũng có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc protein, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh sạch streptokinase

Quá trình tinh sạch streptokinase chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ, và nồng độ muối trong môi trường. Những yếu tố này có thể tác động đến cấu trúc và hoạt tính của enzyme, do đó cần được tối ưu hóa để đạt được sản phẩm có chất lượng tốt nhất.

2.2. Thách thức trong việc duy trì hoạt tính của streptokinase

Một trong những thách thức lớn trong nghiên cứu là duy trì hoạt tính của streptokinase trong suốt quá trình tinh sạch. Việc sử dụng các phương pháp hóa học hoặc sinh học không phù hợp có thể dẫn đến sự giảm hoạt tính của enzyme, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra phương pháp tối ưu nhất.

III. Phương pháp nghiên cứu tinh sạch streptokinase tái tổ hợp

Để đạt được mục tiêu sản xuất streptokinase tái tổ hợp có độ tinh khiết cao, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm nhân dòng gene, biểu hiện protein trong Escherichia coli, và các kỹ thuật tinh sạch như sắc ký lỏng và điện di. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc kết hợp chúng một cách hợp lý sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất.

3.1. Quy trình nhân dòng gene và biểu hiện streptokinase

Quy trình nhân dòng gene bắt đầu bằng việc tách chiết DNA từ chủng Streptococcus pyogenes, sau đó sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để tạo ra plasmid mang gene mã hóa streptokinase. Plasmid này sẽ được chuyển vào Escherichia coli để biểu hiện protein. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy là rất quan trọng để đạt được năng suất cao.

3.2. Kỹ thuật tinh sạch streptokinase hiệu quả

Các kỹ thuật tinh sạch như sắc ký trao đổi ion, sắc ký gel và sắc ký miễn dịch đã được áp dụng để tách biệt streptokinase khỏi các tạp chất. Mỗi phương pháp có những ưu điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ giúp nâng cao độ tinh khiết và hoạt tính của enzyme.

IV. Ứng dụng thực tiễn của streptokinase tái tổ hợp trong điều trị

Streptokinase tái tổ hợp đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Việc sử dụng enzyme này không chỉ giúp làm tan cục máu đông mà còn giảm thiểu các biến chứng liên quan đến bệnh tim mạch. Nghiên cứu cho thấy streptokinase có thể được sử dụng an toàn và hiệu quả trong điều trị nhồi máu cơ tim và thuyên tắc phổi.

4.1. Hiệu quả điều trị của streptokinase trong nhồi máu cơ tim

Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng streptokinase có thể làm giảm tỷ lệ tử vong và biến chứng ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim. Enzyme này giúp làm tan cục máu đông nhanh chóng, từ đó cải thiện lưu thông máu và giảm thiểu tổn thương cơ tim.

4.2. Ứng dụng streptokinase trong thuyên tắc phổi

Streptokinase cũng được sử dụng trong điều trị thuyên tắc phổi, một tình trạng nguy hiểm có thể gây tử vong. Việc sử dụng enzyme này giúp làm tan cục máu đông trong phổi, cải thiện tình trạng hô hấp và giảm thiểu nguy cơ tử vong.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu streptokinase tái tổ hợp

Nghiên cứu về tinh sạch streptokinase tái tổ hợp đang mở ra nhiều triển vọng trong điều trị các bệnh lý tim mạch. Việc phát triển các phương pháp sản xuất và tinh sạch enzyme này sẽ giúp tạo ra sản phẩm có chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu điều trị ngày càng tăng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học, đặc biệt là trong việc giảm thiểu tỷ lệ tử vong do các bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu.

5.1. Triển vọng nghiên cứu và phát triển streptokinase

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp sẽ ngày càng trở nên khả thi và hiệu quả hơn. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch để đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng cao nhất.

5.2. Tương lai của streptokinase trong điều trị bệnh tim mạch

Streptokinase có tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh lý tim mạch. Việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm mới từ enzyme này sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu chi phí cho bệnh nhân. Tương lai của streptokinase trong y học hứa hẹn sẽ mang lại nhiều cơ hội mới cho ngành y tế.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tim mạch hiện là nguyên nhân tử vong hàng đầu trên thế giới, gây ra khoảng 7 triệu ca tử vong mỗi năm, chiếm 12,2% tổng số ca tử vong toàn cầu. Tình trạng này dự kiến sẽ tiếp tục gia tăng trong hai thập kỷ tới, đặc biệt ảnh hưởng nghiêm trọng đến các nước có thu nhập thấp và trung bình, chiếm tới 75% số ca tử vong do tim mạch. Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến bệnh tim mạch là chứng tắc nghẽn mạch máu, gây ra bởi sự hình thành huyết khối trong lòng mạch. Việc xử lý kịp thời và hiệu quả các huyết khối này là yếu tố quyết định giảm thiểu tỷ lệ tử vong và biến chứng.

Streptokinase (SK) là một enzyme có khả năng tan huyết khối, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh tắc nghẽn mạch máu như nhồi máu cơ tim cấp, thuyên tắc phổi và huyết khối tĩnh mạch sâu. Tuy nhiên, các sản phẩm SK hiện có trên thị trường chủ yếu là nhập khẩu với giá thành cao, gây khó khăn cho việc tiếp cận điều trị tại các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Do đó, nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch SK tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli nhằm sản xuất enzyme có độ tinh khiết cao, không mang đuôi 6xhistidine (6xhis) để hạn chế tác dụng phụ, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn.

Luận văn tập trung vào việc nhân dòng gene mã hóa SK từ chủng Streptococcus pyogenes, thiết kế plasmid biểu hiện trong E. coli, biểu hiện protein tái tổ hợp dạng không mang đuôi 6xhis, tinh sạch và hoạt hóa enzyme. Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội, trong giai đoạn 2010-2011. Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp SK phục vụ điều trị tắc nghẽn mạch máu, giảm chi phí và nâng cao hiệu quả điều trị tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Quá trình đông máu và tiêu fibrin: Đông máu là quá trình chuyển máu từ thể lỏng sang thể đặc, hình thành cục máu đông nhờ sự hoạt hóa các yếu tố đông máu và tạo thành fibrin. Tiêu fibrin (fibrinolysis) là quá trình ngược lại, giúp tan cục máu đông nhờ hoạt động của plasmin, được kích hoạt từ plasminogen bởi các enzyme như streptokinase.

• Cơ chế hoạt động của streptokinase: SK liên kết với plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa, xúc tác chuyển plasminogen thành plasmin, từ đó phân hủy fibrin và làm tan huyết khối. SK là protein ngoại bào của Streptococcus pyogenes, có cấu trúc gồm ba vùng α, β, γ với vai trò liên kết và hoạt hóa plasminogen.

• Công nghệ tái tổ hợp protein: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nhân dòng gene mã hóa SK, thiết kế plasmid biểu hiện trong E. coli, biểu hiện protein tái tổ hợp, tinh sạch và hoạt hóa enzyme nhằm tạo ra sản phẩm có hoạt tính cao và độ tinh khiết phù hợp cho ứng dụng y học.

Các khái niệm chính bao gồm: gene mã hóa streptokinase, plasmid biểu hiện pET21a(+), E. coli JM109(DE3), thể vùi protein, tinh sạch bằng siêu âm, hoạt hóa enzyme bằng chất hoạt động bề mặt, định lượng hoạt tính enzyme.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Gene mã hóa streptokinase không mang đuôi 6xhis được khuếch đại từ DNA tổng số của chủng Streptococcus pyogenes DT7. Plasmid pJET1.2/blunt dùng để nhân dòng, plasmid pET21a(+) dùng để biểu hiện protein trong E. coli JM109(DE3).

• Phương pháp phân tích:

  • Kỹ thuật PCR để nhân bản gene msk-nonhis.
  • Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt.
  • Điện di agarose kiểm tra DNA, SDS-PAGE và Western blot để phân tích protein biểu hiện và tinh sạch.
  • Phương pháp siêu âm nhiều lần để tinh sạch protein thể vùi.
  • Hoạt hóa enzyme bằng các chất hoạt động bề mặt (Triton X-100, Tween 20, Tween 80) kết hợp glycerol.
  • Định lượng hoạt tính enzyme bằng phản ứng thủy giải cơ chất N-(p-tosyl) gly-pro-lys-4-nitro anilide acetate salt, đo hấp thụ quang ở bước sóng 405 nm.
  • Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford.

• Timeline nghiên cứu:

  • Nhân dòng và thiết kế plasmid: 2 tháng.
  • Biểu hiện protein và thu nhận tế bào: 1 tháng.
  • Tinh sạch và hoạt hóa enzyme: 2 tháng.
  • Phân tích hoạt tính và báo cáo kết quả: 1 tháng.

• Cỡ mẫu: Sử dụng các dòng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli JM109(DE3) với nhiều lần nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện để đảm bảo tính lặp lại và độ tin cậy của kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Nhân dòng gene msk-nonhis thành công:

   • Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1,25 kb, phù hợp với kích thước gene tính toán.
   • Plasmid tái tổ hợp pJmSK và pEmSK được xác nhận bằng điện di và giải trình tự, đảm bảo gene msk được chèn đúng vị trí, có bộ ba kết thúc trước đuôi 6xhis, tạo ra protein không mang đuôi histidine.

2. Biểu hiện protein streptokinase nonhis trong E. coli:

   • Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 47 kDa, chiếm khoảng 72% tổng protein tế bào, cao hơn nhiều so với các nghiên cứu trước (25-50%).
   • Protein chủ yếu biểu hiện dưới dạng thể vùi không tan, phù hợp với xu hướng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli.

3. Tinh sạch streptokinase nonhis hiệu quả:

   • Sử dụng phương pháp phá siêu âm nhiều lần để loại bỏ protein hòa tan, thu được protein tinh sạch với độ tinh khiết đạt 97,9% sau 4 lần phá siêu âm.
   • Hiệu suất thu hồi enzyme đạt khoảng 87%, tương đương năng suất biểu hiện 0,78 mg mSK-nonhis/g tế bào.
   • Hoạt tính riêng của enzyme tinh sạch đạt 11.308 U/mg protein, tương đương hoặc cao hơn các kết quả nghiên cứu trước.

4. Hoạt hóa enzyme sau tinh sạch:

   • Các chất hoạt động bề mặt không ion hóa như Tween 20 và Triton X-100 kết hợp với 10% glycerol làm tăng hoạt tính enzyme lên 6-8 lần so với mẫu không hoạt hóa.
   • Hoạt tính enzyme sau hoạt hóa đạt đến 95.279 U/mg, cao hơn 6-8 lần so với trước hoạt hóa.

Thảo luận kết quả

Kết quả nhân dòng và biểu hiện gene msk-nonhis trong E. coli JM109(DE3) cho thấy hiệu suất biểu hiện protein tái tổ hợp cao, vượt trội so với nhiều nghiên cứu trước đây sử dụng các dòng E. coli khác hoặc vector khác. Việc thiết kế bộ ba kết thúc trước đuôi 6xhis thành công giúp loại bỏ hoàn toàn đuôi histidine, giảm nguy cơ tác dụng phụ khi ứng dụng trong y học.

Protein biểu hiện chủ yếu dưới dạng thể vùi là đặc điểm phổ biến của các protein tái tổ hợp trong E. coli, đòi hỏi quy trình tinh sạch và hoạt hóa phù hợp để thu được enzyme hòa tan và hoạt động. Phương pháp phá siêu âm nhiều lần kết hợp hòa tan bằng guanidine và hoạt hóa bằng chất hoạt động bề mặt đã chứng minh hiệu quả cao trong việc thu nhận enzyme tinh khiết với hoạt tính mạnh.

So sánh với các nghiên cứu trước, hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi enzyme trong nghiên cứu này đều đạt mức cao, cho thấy quy trình công nghệ được xây dựng có tính khả thi và hiệu quả. Việc sử dụng enzyme không mang đuôi 6xhis là một bước tiến quan trọng nhằm giảm thiểu tác dụng phụ và tăng tính an toàn cho sản phẩm dược phẩm sinh học.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ thể hiện tỷ lệ protein biểu hiện, độ tinh khiết qua các lần tinh sạch, và hoạt tính enzyme trước và sau hoạt hóa, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của quy trình nghiên cứu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện:

   • Thực hiện bổ sung dưỡng chất và kiểm soát pH, nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy để tăng sinh khối tế bào và năng suất biểu hiện protein.
   • Mục tiêu: tăng năng suất protein tái tổ hợp lên gấp 2 lần trong vòng 6 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học.

2. Phát triển quy trình tinh sạch và hoạt hóa enzyme quy mô lớn:

   • Áp dụng phương pháp phá siêu âm kết hợp hòa tan và hoạt hóa enzyme bằng chất hoạt động bề mặt trong quy mô công nghiệp.
   • Mục tiêu: duy trì độ tinh khiết trên 95% và hoạt tính enzyme cao trong sản xuất.
   • Thời gian: 12 tháng.
   • Chủ thể: phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và đối tác sản xuất dược phẩm.

3. Nghiên cứu đánh giá tính an toàn và hiệu quả của enzyme tái tổ hợp không mang đuôi 6xhis trên mô hình động vật:

   • Thực hiện thử nghiệm tiền lâm sàng để đánh giá độc tính, miễn dịch và hiệu quả điều trị.
   • Mục tiêu: hoàn thành thử nghiệm trong 18 tháng, chuẩn bị cho các bước thử nghiệm lâm sàng.
   • Chủ thể: nhóm nghiên cứu sinh học phân tử và dược lý.

4. Xây dựng đề án sản xuất và thương mại hóa enzyme streptokinase tái tổ hợp:

   • Phối hợp với các cơ quan quản lý và doanh nghiệp để phát triển sản phẩm dược phẩm sinh học trong nước.
   • Mục tiêu: đưa sản phẩm ra thị trường trong vòng 3 năm, giảm giá thành và tăng khả năng tiếp cận điều trị.
   • Chủ thể: viện nghiên cứu, doanh nghiệp dược phẩm, cơ quan quản lý y tế.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học:

   • Lợi ích: hiểu rõ quy trình nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp, áp dụng cho các nghiên cứu enzyme và protein khác.
   • Use case: phát triển các sản phẩm enzyme tái tổ hợp phục vụ y học và công nghiệp.

2. Chuyên gia phát triển dược phẩm sinh học:

   • Lợi ích: tham khảo quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp không mang đuôi histidine, giảm tác dụng phụ và chi phí sản xuất.
   • Use case: thiết kế quy trình sản xuất thuốc tan huyết khối trong nước.

3. Bác sĩ và nhà quản lý y tế:

   • Lợi ích: cập nhật kiến thức về enzyme streptokinase tái tổ hợp, đánh giá tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh tim mạch.
   • Use case: xây dựng phác đồ điều trị và chính sách y tế phù hợp.

4. Doanh nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học:

   • Lợi ích: tìm hiểu công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp, cơ hội hợp tác nghiên cứu và phát triển sản phẩm mới.
   • Use case: đầu tư và phát triển sản phẩm enzyme tan huyết khối giá thành thấp, chất lượng cao.

Câu hỏi thường gặp

1. Streptokinase tái tổ hợp là gì và có ưu điểm gì so với streptokinase tự nhiên?
   Streptokinase tái tổ hợp là enzyme được sản xuất bằng công nghệ sinh học tái tổ hợp gene trong vi khuẩn E. coli, cho phép sản xuất với số lượng lớn, độ tinh khiết cao và kiểm soát chất lượng tốt hơn so với enzyme chiết xuất tự nhiên. Điều này giúp giảm nguy cơ nhiễm khuẩn và tác dụng phụ.

2. Tại sao cần loại bỏ đuôi 6xhistidine trong protein tái tổ hợp?
   Đuôi 6xhistidine thường được gắn vào protein để thuận tiện cho quá trình tinh sạch bằng cột Ni2+, nhưng có thể gây tác dụng phụ khi sử dụng trong điều trị do khả năng kích thích miễn dịch hoặc độc tính. Loại bỏ đuôi này giúp tăng tính an toàn cho sản phẩm dược phẩm.

3. Protein tái tổ hợp thường biểu hiện dưới dạng thể vùi, điều này có ảnh hưởng gì đến quá trình tinh sạch?
   Protein thể vùi không tan trong môi trường nuôi cấy, đòi hỏi phải phá thể vùi và hòa tan protein trước khi tinh sạch. Quá trình này phức tạp hơn nhưng giúp thu được protein tinh khiết và hoạt động nếu được xử lý đúng cách.

4. Các chất hoạt động bề mặt nào được sử dụng để hoạt hóa streptokinase sau tinh sạch?
   Các chất như Tween 20, Tween 80 và Triton X-100 kết hợp với glycerol được sử dụng để tái cuộn xoắn và hoạt hóa enzyme, giúp tăng hoạt tính lên nhiều lần so với enzyme chưa hoạt hóa.

5. Năng suất biểu hiện và hoạt tính enzyme trong nghiên cứu này so với các nghiên cứu trước như thế nào?
   Năng suất biểu hiện protein chiếm khoảng 72% tổng protein tế bào, cao hơn nhiều so với các nghiên cứu trước (25-50%). Hoạt tính riêng của enzyme tinh sạch đạt trên 11.000 U/mg, và sau hoạt hóa lên đến gần 95.000 U/mg, cho thấy hiệu quả quy trình nghiên cứu vượt trội.

Kết luận

• Thành công nhân dòng và thiết kế plasmid biểu hiện gene streptokinase không mang đuôi 6xhis trong E. coli JM109(DE3).
• Protein streptokinase tái tổ hợp biểu hiện với hiệu suất cao, chủ yếu dưới dạng thể vùi.
• Phương pháp tinh sạch bằng phá siêu âm nhiều lần kết hợp hòa tan bằng guanidine đạt độ tinh khiết gần 98% với hiệu suất thu hồi 87%.
• Hoạt hóa enzyme bằng chất hoạt động bề mặt và glycerol làm tăng hoạt tính enzyme lên 6-8 lần.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển sản phẩm enzyme tan huyết khối an toàn, hiệu quả và giá thành hợp lý cho thị trường trong nước.

Next steps: Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, mở rộng quy mô tinh sạch, thử nghiệm tiền lâm sàng và phát triển sản phẩm dược phẩm sinh học.

Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học và dược phẩm được khuyến khích hợp tác để phát triển và ứng dụng enzyme streptokinase tái tổ hợp trong điều trị bệnh tim mạch.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong xã hội hiện đại, khi nền kinh tế ngày một phát triển cộng với áp lực về công việc và thời gian khiến cho chế độ ăn của con người trở nên mất cân đối là một trong những nguyên nhân lớn dẫn đến bệnh tim mạch. Bệnh tim mạch đang là nguyên nhân gây tử vong số một trên thế giới (www. Bệnh tim mạch làm chết 7 triệu người mỗi năm và chiếm 12,2% các ca tử vong trên toàn thế giới [41]. Xu hướng này sẽ tiếp tục gia tăng trong hai thập kỷ tiếp theo và gây ra những tác động lớn hơn ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, nơi chiếm tới 3/4 số ca tử vong do tim mạch vào năm 2001 [13, 55].

Bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước Mỹ Latinh, Caribe, các nước Trung Đông và cả Châu Phi. Tử vong do tim mạch dự kiến sẽ tăng gấp 3 lần trong 20 năm tới [55]. Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh tim mạch là do chứng tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch gây ra, các nhà khoa học đi theo hướng phòng ngừa và xử lý các huyết khối hình thành trong mạch.

Trên thị trường hiện nay có một số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu như Durakinase, Streptase, Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên, đây hầu hết là các sản phẩm của nước ngoài với giá thành rất đắt. Nghiên cứu so sánh không thấy sự khác biệt về ưu thế của các loại thuốc trên [21]. Sự khác biệt lớn nhất là giá cả, thuốc có bản chất r-tPA có giá gấp gần 10 lần streptokinase. Do đó, streptokinase thường được sử dụng hơn ở các nước đang phát triển.

Ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về các thuốc tan huyết. Đề tài KC10 (2009-2010) có thể coi là công trình nghiên cứu cấp nhà nước đầu tiên về lĩnh vực này. Trong đề tài này các nhà nghiên cứu đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch thành công streptokinase. Streptokinase được biểu hiện cả ở dạng có tín hiệu và không có tín hiệu (mSK), trong đó mSK với hoạt tính cao hơn.

Streptokinase tái tổ hợp bước đầu được thử nghiệm trên đối tượng thỏ thí nghiệm cho kết quả tốt. 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng của chứng tắc nghẽn mạch máu thì thời gian xử lý huyết khối trong mạch là một yếu tố vô cùng quan trọng. Thuốc tan huyết khối dạng tiêm được sử dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, thuốc dạng tiêm đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, trong khi các enzyme tái tổ hợp thông thường thường dung hợp đuôi 6xhistidine (6xhis) để thuận tiện cho quá trình tinh sạch và việc dung hợp đuôi 6xhis được xem là có thể gây tác dụng phụ cho con người.

Trên cơ sở đó, trong khuôn khổ đề tài KC10 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị” chúng tôi thực hiện đề tài luận văn “Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp trong E. coli” với dạng streptokinase tái tổ hợp không dung hợp đuôi 6xhistidine để tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu 1.1 Quá trình đông máu Đông máu là quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc. Bình thường đây là một cơ chế quan trọng giúp cơ thể sửa chữa những mạch máu bị tổn thương và chống mất máu do bị tổn thương thành mạch.

Quá trình đông máu phụ thuộc vào các yếu tố đông máu (bảng 1.1) và gồm ba giai đoạn. Giai đoạn tạo thành prothrombinase Quá trình này xảy ra khi có chấn thương thành mạch, khi có sự tiếp xúc với collagen của thành mạch, với các mô khác ngoài nội mạc hoặc bất cứ vật lạ nào. Sự tạo thành prothrombinase được thực hiện theo hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh (hình 1. Hai cơ chế này chỉ khác nhau ở giai đoạn hình thành yếu tố X hoạt hóa (Xa).

2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Cơ chế ngoại sinh: Khi máu tiếp xúc với mạch máu bị tổn thương, mô ở vị trí tổn thương giải phóng ra yếu tố III (thromboplastin mô) và phospholipid. Yếu tố III hoạt hóa yếu tố X thành yếu tố Xa. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia của yếu tố Va, ion Ca2+ và phospholipid. Yếu tố Va làm tăng hoạt tính của yếu tố Xa.

Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố. Thrombin trong trường hợp này có tác dụng điều hòa. Cơ chế nội sinh: Khi máu tiếp xúc với collagen của thành mạch bị tổn thương hoặc bề mặt vật lạ sẽ làm hoạt hóa yếu tố XII thành yếu tố XIIa và giải phóng phospholipid tiểu cầu. Yếu tố XIIa chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIa (có sự tham gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald).

Yếu tố XIa chuyển yếu tố IX thành yếu tố IXa (có sự tham gia của yếu tố tiểu cầu). Yếu tố X được hoạt hóa có sự tham gia của yếu tố VIIIa (yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXa, ion Ca2+ và phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia của phospholipid, yếu tố Va (yếu tố V được hoạt hóa nhờ thrombin) và ion Ca 2+. Prothrombinase được hình thành từ cơ chế nội sinh hoặc ngoại sinh hoặc đồng thời cả hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh.

Điều này chứng tỏ hoạt tính của prothrombinase là phụ thuộc vào sự hoạt hóa của các yếu tố tham gia vào quá trình này. Các yếu tố đông máu. Các yếu tố Tên gọi và vai trò I Fibrinogen, là một loại globulin, do gan tổng hợp đưa vào máu. Prothrombin, là một protein huyết tương do gan sinh ra.

Sự tổng hợp II prothrombin liên quan chặt chẽ đến sự hấp thụ vitamin K. Nếu rối loạn hấp thụ vitamin K ở đường tiêu hóa sẽ dẫn đến giảm prothrombin. Thromboplastin, enzyme tạo ra khi tiểu cầu bị vỡ, hoặc mô bị tổn III thương. IV Ion Ca2+ có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hóa prothrombin.

Proaccelerin, một loại globulin, do gan sinh ra, làm tăng tốc độ đông V máu. VI Dạng hoạt hoá của yếu tố V. VII Proconvectin, yếu tố xúc tiến tạo Thrombin. 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Yếu tố chống chảy máu A, có trong huyết tương, có vai trò quan trọng VIII trong sự tạo thành thromboplastin nội sinh.

Nếu thiếu yếu tố này, máu vẫn đông nhưng cục máu mềm, dễ di động. Yếu tố chống chảy máu B, cũng là một protein huyết tương, cần cho sự IX tạo thành thromboplastin. Yếu tố stuart, có trong huyết tương, do gan sinh ra tương đối bền vững X có tác dụng trong sự tạo thành thromboplastin và chuyển prothrombin thành thrombin. Prothromboplastin - có sẵn trong huyết tương, có vai trò tập trung tiểu XI cầu.

Yếu tố hageman, có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hoá sự đông XII máu. Yếu tố ổn định fibrin, có sẵn trong huyết tương, có tác dụng củng cố sợi XIII fibrin thêm vững chắc. Con đƣờng ngoại sinh Con đƣờng nội sinh Mô tổn thương Thành mạch tổn thương Yếu tố XII Yếu tố XIIa Yếu tố mô Ca2+ Yếu tố XI Yếu tố XIa Yếu tố VII Yếu tố VIIa Ca2+ Ca2+, Yếu tố IXa Yếu tố IX phospholipid Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố X 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Yếu tố X Yếu tố Xa Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố VII Yếu tố Va, VIIIa Prothrombin (yếu tố II ) Thrombin Ca2+ Sợi fibrin Yếu tố XIII Yếu tố XIIIa Cục máu đông Hình 1. Giai đoạn tạo thành thrombin Prothrombinase tạo ra theo cơ chế nội sinh và (hoặc) ngoại sinh cùng với Ca2+ xúc tác cho phản ứng chuyển prothrombin thành thrombin.

Sự hình thành thrombin từ prothrombin là rất nhanh, được tính bằng vài giây. Giai đoạn tạo thành fibrin và cục máu đông Fibrinogen là một protein do gan sản xuất, nồng độ trong máu bình thường là 100-700 mg/100 ml máu. Bình thường fibrinogen rất khó vào dịch kẽ. Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ.

Dưới tác dụng của thrombin, fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin đơn phân dạng không hòa tan. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi nhờ yếu tố XIII. Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+. Các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương đông.

Như vậy bản chất của quá trình đông máu là hình thành lưới fibrin từ fibrinogen nhờ thrombin.2 Cơ chế tan máu đông Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tiêu fibrin (fibrinolysis). Đây là một quá trình ngược với đông máu (hình 1. Tiêu fibrin là một quá trình sinh lý, nhằm làm tan cục máu đông được tạo thành ở giai đoạn trước đó, tái lưu thông tuần hoàn máu. Các yếu tố tham gia gồm có plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa.

Plasminogen: Là tiền tố của plasmin, ở dạng bất hoạt. Hàm lượng trong huyết tương là 0,2 µg/ml. Plasminogen là một chuỗi polypeptide 791 amino acid, bình thường tồn tại ở dạng Glu-plasminogen (dạng nguyên vẹn), khi có tác động của plasmin, Glu-plasminogen tách ra một số peptide nhỏ, phần còn lại là Lys-plasminogen. Plasmin: Các chất hoạt hóa sẽ chuyển plasminogen thành plasmin.

Plasmin gồm hai chuỗi polypeptide, nối với nhau bằng một cầu nối disulfide: chuỗi nhẹ gắn với serine-protease, chuỗi nặng có vị trí gắn với fibrin. Khi fibrin xuất hiện, lập tức xảy ra hiện tượng hoạt hóa plasminogen thành plasmin. Plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm bị phân hủy và do đó làm tan cục máu đông. Plasminogen Các chất hoạt hóa Plasmin Fibrin PDF (các sản phẩm bị phân hủy) Hình 1.

Sơ đồ tiêu sợi huyết. 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương 1.3 Bệnh tắc nghẽn mạch máu Đông máu là một trong những cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể khi chấn thương xảy ra. Tuy nhiên, khi thành mạch bị xơ vữa, bị tổn thương làm xuất hiện huyết khối làm tắc nghẽn động mạch, tĩnh mạch gây nên bệnh tắc nghẽn mạch máu.