mở đầu này đã chỉ ra rằng mỗi cá thể ngƣời thể hiện sự đa dạng di truyền ở hệ nhóm máu ABO. Kết quả này sau đó đƣợc Hirszfeld và cộng sự (1919), lần đầu tiên ứng dụng để nghiên cứu sai khác di truyền ở các nhóm ngƣời khác nhau (trích dẫn của Cavalli-Sforza và cộng sự 1994) [35]. Tuy nhiên, mãi đến những năm 1960 các nghiên cứu về quá trình tiến hoá dựa vào các kỹ thuật phân tử mới thực sự đƣợc sử dụng. Năm 1966, lần đầu tiên tính chất đa hình tự nhiên của protein đƣợc chứng minh bởi Harris (1966), Lewontin và Hubby (1966) [49], [74].
Các nhà khoa học này đã sử dụng phƣơng pháp điện di protein để xác định enzym hoặc các sản phẩm protein của các gen riêng biệt. Những nghiên cứu ban đầu trên đƣợc tiến hành trên hai loài sinh vật rất khác nhau (ruồi giấm và ngƣời) đã cho thấy rằng hệ gen động vật chứa đựng sự phong phú về đa dạng di truyền. Kết hợp những kết quả thực nghiệm với các nghiên cứu lý thuyết đã dẫn đến hình thành lý thuyết về tiến hoá phân tử (Kimura, 1968a) [66]. Những nghiên cứu về đa hình allozyme với những thay đổi và cải tiến đã trở thành công cụ chuẩn để đánh giá đa dạng di truyền sinh hoá trong vòng 20 năm sau đó.
Sử dụng kỹ thuật phân tử để đánh giá sự khác nhau ở mức độ ADN đƣợc phát triển lần đầu tiên vào những năm 1960, ban đầu kỹ thuật này dùng để nghiên cứu hệ gen của các sinh vật nhân sơ (Britten và Kohne, 1968) [30] sau đó đƣợc ứng dụng cho vấn đề tiến hoá phân tử và hệ thống học. Kỹ thuật này là phép lai giữa hai phân tử ADN (DNA*DNA hybridization). Trong những năm 1980 kỹ thuật lai ADN đƣợc sử dụng để xác định quan hệ nguồn gốc của một số loài, chủ yếu ở các loài chim (avian) và các loài thú giống ngƣời (hominoid) (Sibley và Ahlquist, 1990) [117], [118]. Tuy nhiên, trong những năm gần đây kỹ thuật này ít đƣợc sử dụng do những 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khó khăn trong quá trình tiến hành thí nghiệm, hơn nữa do sự thay thế bởi các phƣơng pháp mới thuận tiện hơn dựa trực tiếp trên trình tự ADN (Avise, 1994) [16].
Sinh học phân tử đã phát triển rất nhanh do việc hiện ra enzym giới hạn ở vi khuẩn, các enzym giới hạn này có thể cắt hai sợi đơn của phân tử ADN tại những trình tự nucleotide đặc thù (Meselson và Yuan, 1968) [94]. Hiện tại, hàng trăm loại enzym giới hạn đã đƣợc xác định và chúng đã chứng tỏ cho thấy là những công cụ hữu ích đối với các nghiên cứu về tiến hoá phân tử và di truyền quần thể. Kết hợp với kỹ thuật lai ADN (southern hybridisation) chúng đã cung cấp một phƣơng pháp rất hiệu quả để nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức độ phân tử. Sự đa hình ở mức độ trình tự ADN có thể đƣợc quan sát bởi sự thay đổi trong các dạng cắt các phân đoạn ADN khi đƣợc xử lý với một enzym giới hạn nào đó.
Kỹ thuật đa hình này đƣợc gọi là đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLPs) (Bostein và cộng sự, 1980) [25]. Mặc dù kỹ thuật RFLP đã đƣợc sử dụng thành công trong một số các nghiên cứu tiến hoá phân tử ở hệ gen trong nhân, tuy vậy, hầu hết các nghiên cứu về di truyền quần thể sử dụng kỹ thuật RFLP thƣờng tập trung vào hệ gen ty thể ở tế bào chất. Một sự đột phá quan trọng khác của sinh học phân tử xảy ra trong những năm 1970 là sự phát triển phƣơng pháp xác định trực tiếp trình tự của một phân đoạn ADN sau khi tinh sạch (Maxam và Gilbert, 1977; Sanger và cộng sự, 1977) [90], [114]. Phân tích trình tự ADN sau đó trở thành một thành phần quan trọng của lĩnh vực di truyền tiến hóa phân tử.
Tuy nhiên, những quy trình thực hiện của phƣơng pháp này tƣơng đối phức tạp và mất nhiều thời gian do phải nhân dòng và đọc trình tự trong các vector của vi khuẩn, do vậy phƣơng pháp này đã hạn chế đối với một số các nghiên cứu cần đánh giá phân loại ở mức độ cao, đặc biệt đối với các loài càng có quan hệ gần nhau do cần phải thu đƣợc một số lƣợng nhiều dữ liệu. Sự phát minh ra kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) bởi Mullis và cộng sự năm 1986 đã thực sự làm thay đổi và đƣa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực sinh học phân tử [8], [100]. Kỹ thuật này đã làm cho dễ dàng xác định trực tiếp trình tự ADN từ một số lƣợng lớn các tổ chức cá thể. Đặc biệt, sự ra đời của kỹ thuật 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PCR đã tác động sâu sắc tới những nghiên cứu về đa dạng trình tự ADN ty thể, cho phép nghiên cứu trình tự ADN ty thể ở mức độ lớn trong bản thân và giữa các loài có quan hệ gần gũi.
Ngoài ra, sự ra đời của kỹ thuật PCR còn giúp khắc phục những khó khăn khi tiến hành nghiên cứu di truyền của các quần thể động vật hoang dã do số lƣợng và chất lƣợng ADN rất thấp đƣợc tách chiết từ các mẫu sinh học thu thập bằng cách không gây hại cho sinh vật (non-invasive sampling) nhƣ phân, lông. Trong những năm 1980, các nhà khoa học nghiên cứu về hệ gen đã tập trung vào một dạng vùng trình tự ADN siêu biến đổi (supervariable), chúng đƣợc xác định lần đầu tiên bằng phƣơng pháp phân tích lai ADN (southern blot) với các yếu tố có tính lặp lại ở hệ gen ngƣời và đƣợc gọi là minisatellites (Jeffreys và cộng sự, 1985) [58]. Mỗi đơn vị lặp lại của minisatellite có chiều dài khoảng 16-64 bp. Phƣơng pháp sử dụng xung quanh kỹ thuật này thƣờng đƣợc gọi là xác định dấu vân ADN (DNA fingerprinting).
Mặc dù chỉ thị minisatellite có tính đa hình cao, đƣợc phát hiện ở nhiều thực vật và động vật (bao gồm cả ở bò), tuy nhiên, chƣa có nghiên cứu nào thực sự thành công khi áp dụng kỹ thuật này vào nghiên cứu về di truyền quần thể. Do tính chất phức tạp của quá trình đọc kết quả từ các bản điện di do chúng có thể có tới hơn 20 băng khác nhau và khó thu đƣợc kết quả một cách thống nhất giữa các lần phân tích vì vậy đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu di truyền tiến hóa. Một phƣơng pháp nữa dựa trên kỹ thuật PCR đã đƣợc phát triển cho phép nhân bản các vùng VNTR (Variable Number Tanderm Repeats) trong hệ gen (Jeffreys và cộng sự, 1988) [57]. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đã đƣợc thay thế do sự phát hiện một loại chị thị (marker) mới có thể đƣợc phân tích bằng cách dùng kỹ thuật PCR và tiện lợi hơn.
Chỉ thị này đƣợc phát triển vào cuối những năm 1980 và đƣợc gọi là microsatellite (Litt và Lutty, 1989; Tautz, 1989; Weber và May, 1989) [77], [129], [138]. Một loại phân tích di truyền khác cũng đƣợc sử dụng để nghiên cứu di truyền quần thể trong những năm gần đây là phƣơng pháp phân tích đa hình các đoạn ADN 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đƣợc nhân bản ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA - RAPD). Phƣơng pháp này đƣợc miêu tả lần đầu tiên bởi Williams và cộng sự (1990) [141], dựa trên cơ sở của phản ứng PCR với các mồi ngắn (10 bp) có trình tự ngẫu nhiên để nhân bản ngẫu nhiên các đoạn trình tự chƣa biết trong hệ gen. Phƣơng pháp này chủ yếu đƣợc sử dụng để nghiên về di truyền quần thể ở thực vật.
Ngoài ra, còn có một số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR đƣợc phát triển trong những năm 1990 để phân tích sự đa hình ADN của hệ gen bao gồm nhƣ SSCPs (single strand conformation polymorphisms), AFLPs (amplified fragment length polymorphisms), SNP (single nucleotide polymorphisms). Tuy nhiên, các phƣơng pháp này ít đƣợc áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về tiến hoá và di truyền quần thể. Trong số những kỹ thuật phân tử kể trên thì kỹ thuật microsatellite và phân tích trình tự ADN ty thể là những kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay để nghiên cứu đa dạng di truyền của các quần thể vật nuôi và động vật hoang dã.1: Đặc điểm của một số kỹ thuật phân tử đƣợc sử dụng đánh giá dạng di truyền Áp dụng cho Nguồn Kiểu di Phƣơng pháp các quần thể Chi phí phân tích truyền hoang dã Electrophoresis Máu, thận, Không Thấp Đồng trội (điện di) gan, lá cây Microsatellite ADN Có Trung bình Đồng trội ADN fingerprints ADN Không Trung bình Trội RAPD ADN Có Trung bình thấp Trội AFLP ADN Có Trung bình cao Trội RFLP ADN Không Trung bình Đồng trội SSCP ADN Có Trung bình Đồng trội Giải trình tự ADN ADN Có Trung bình Đồng trội SNP ADN Có Trung bình cao Đồng trội 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. KỸ THUẬT MICROSATELLITE 1.
Giới thiệu Thuật ngữ microsatellite đƣợc Litt và Luty giới thiệu vào năm 1989 nhằm chỉ các trình tự ADN lặp lại một cách liên tiếp (Tandemly repeated DNA sequence), có độ dài chỉ vài cặp bazơ (2-6 bp), có tính đa hình cao và có thể đƣợc nhân lên bằng phản ứng PCR. Các microsatellite phân bố trên toàn bộ hệ gen, tập trung thành những đám nhỏ (clusters) khoảng < 200bp và đƣợc tìm thấy trong tất cả cơ thể sống đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn. Bản chất đa hình của microsatellite có thể đƣợc sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Microsatellite đƣợc gọi bằng một số thuật ngữ nhƣ: các trình tự đơn giản lặp lại (SSRs), các chuỗi lặp lại có trình tự ngắn (STRs), các dạng chuỗi đơn giản (SSMs), hoặc các chuỗi lặp lại 2 nucleotide (di-nucleotide repeat), 3 nucleotide (tri- nucleotide repeat), 4 nucleotide (tetre-nucleotide repeat) phụ thuộc vào độ dài các đơn vị lặp lại của chúng.
Tuy nhiên, ngƣời ta thƣờng sử dụng thuật ngữ microsatellite để thay thế cho tất cả những thuật ngữ trên và đã đƣợc hầu hết mọi ngƣời chấp nhận. Microsatellite có tính đa hình rất cao (cao nhất trong tất cả những dạng trình tự ADN lặp lại có trật tự đã nêu ở trên) và dạng microsatellite có tính đa hình cao nhất (dạng không bị ngắt quãng) đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau. Nhƣng trong thực tế thì các microsatellite thƣờng bị ngắt quãng, hoặc kết hợp giữa các loại trình tự lặp lại. Những chức năng rõ rệt của các trình tự nhƣ vậy vẫn còn chƣa rõ ràng mặc dù ngƣời ta có tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền.