Luận văn thạc sĩ về tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2016

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu ứng dụng phương pháp realtime pcr trong điều tra đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại bệnh viện bạch mai, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Tô Đức Linh
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hội
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Dịch tễ học bệnh sốt mò
• 1.2. tsutsugamushi – tác nhân gây bệnh sốt mò
• 1.3. Mò Leptotrobidium - ổ bệnh và trung gian truyền bệnh
• 1.4. tsutsugamushi ở động vật
• 1.5. Tình hình sốt mò trên thế giới
• 1.6. Tình hình sốt mò ở Việt Nam
• 1.7. Sinh bệnh học sốt mò
• 1.7.1. Sự xâm nhập và nhân lên của O. tsutsugamushi trong tế bào vật chủ
• 1.7.2. Tính nhạy cảm của cơ thể vật chủ với nhiễm O.
• 1.7.3. Đáp ứng miễn dịch trong sốt mò
• 1.7.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán bệnh sốt mò
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Chủng vi khuẩn nghiên cứu
• 2.4. Mẫu bệnh phẩm
• 2.5. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC)
• 2.6.2. Tách chiết DNA tổng số
• 2.6.3. Thiết kế cặp mồi và probe
• 2.6.4. Thành phần phản ứng (Master mix)
• 2.6.5. Tối ưu chu kỳ nhiệt của phản ứng Realtime – PCR
• 2.6.6. Nhận định và phân tích kết quả
• 2.6.7. Phương pháp xác định độ đặc hiệu phản ứng
• 2.6.8. Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng
• 2.6.9. Đạo đức nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Quy trình tối ưu phản ứng Realtime – PCR
• 3.2. Thiết kế mồi
• 3.3. Tối ưu nhiệt độ gắn Taqman probe
• 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ magie của phản ứng Realtime-PCR
• 3.5. Xây dựng quy trình chẩn đoán O. tsutsugamushi bằng Realtime – PCR
• 3.6. Tách chiết DNA
• 3.7. Ứng dụng phản ứng Realtime PCR chẩn đoán O.
• 3.8. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR
• 3.9. Đánh giá độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
• 3.10. Một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nghi mắc bệnh sốt mò
• 3.11. Kết quả khảo sát các yếu tố liên quan đến nhiễm O. tsutsugamushi ở các bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Bạch Mai năm 2016
• 3.12. Tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi về tuổi
• 3.13. Tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi theo giới tính
• 3.14. Phân bố nhiễm bệnh theo nhóm nghề nghiệp
• 3.15. Phân bố nhiễm bệnh theo vùng miền, địa phương
• 3.16. Phân bố nhiễm bệnh theo các khoảng thời gian trong năm 2016
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai

Bệnh sốt mò, do vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây ra, là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến tại Việt Nam. Tại Bệnh viện Bạch Mai, nghiên cứu về tỉ lệ bệnh sốt mò đã được thực hiện nhằm đánh giá tình hình dịch tễ học và tìm ra các yếu tố liên quan. Nghiên cứu này không chỉ giúp xác định tỉ lệ nhiễm bệnh mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc điều trị và phòng ngừa bệnh.

1.1. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh sốt mò

Bệnh sốt mò thường xuất hiện ở những khu vực có điều kiện sinh thái thuận lợi cho sự phát triển của mò Leptotrombidium. Tại Việt Nam, bệnh này đã được ghi nhận ở nhiều tỉnh thành, với tỉ lệ mắc bệnh có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây.

1.2. Tình hình bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai

Bệnh viện Bạch Mai là một trong những cơ sở y tế lớn tại Hà Nội, nơi tiếp nhận nhiều bệnh nhân mắc bệnh sốt mò. Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ bệnh nhân nhiễm O. tsutsugamushi tại đây có sự biến động theo mùa và theo nhóm tuổi.

II. Vấn đề và thách thức trong việc chẩn đoán bệnh sốt mò

Chẩn đoán bệnh sốt mò gặp nhiều khó khăn do triệu chứng lâm sàng không điển hình. Nhiều bệnh nhân có triệu chứng giống với các bệnh truyền nhiễm khác, dẫn đến việc chẩn đoán sai. Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như Realtime PCR là cần thiết để nâng cao độ chính xác.

2.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh sốt mò

Bệnh sốt mò có triệu chứng đa dạng, bao gồm sốt cao, phát ban, và các triệu chứng hô hấp. Tuy nhiên, không phải bệnh nhân nào cũng có biểu hiện điển hình, điều này gây khó khăn trong việc nhận diện bệnh.

2.2. Khó khăn trong việc chẩn đoán bệnh

Việc chẩn đoán bệnh sốt mò thường phụ thuộc vào kinh nghiệm của bác sĩ và sự xuất hiện của vectơ truyền bệnh. Nhiều trường hợp bệnh nhân không có triệu chứng rõ ràng, dẫn đến việc chẩn đoán bị nhầm lẫn.

III. Phương pháp nghiên cứu tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai

Nghiên cứu được thực hiện bằng phương pháp Realtime PCR, một kỹ thuật hiện đại giúp xác định nhanh chóng tình trạng nhiễm O. tsutsugamushi. Phương pháp này không chỉ giúp tiết kiệm thời gian mà còn nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán.

3.1. Quy trình thực hiện Realtime PCR

Quy trình thực hiện Realtime PCR bao gồm các bước như tách chiết DNA, thiết kế mồi và probe, và tối ưu hóa các điều kiện phản ứng. Điều này đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện vi khuẩn.

3.2. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Realtime PCR là rất quan trọng. Nghiên cứu cho thấy phương pháp này có khả năng phát hiện vi khuẩn với độ chính xác cao, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

IV. Kết quả nghiên cứu tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ bệnh nhân nhiễm O. tsutsugamushi tại Bệnh viện Bạch Mai trong năm 2016 là một con số đáng lưu ý. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỉ lệ nhiễm bệnh có sự khác biệt rõ rệt giữa các nhóm tuổi và giới tính.

4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo độ tuổi

Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất ở nhóm tuổi từ 20 đến 40. Điều này có thể liên quan đến thói quen sinh hoạt và môi trường làm việc của nhóm tuổi này.

4.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giới tính

Tỉ lệ nhiễm bệnh giữa nam và nữ cũng có sự khác biệt. Nam giới có tỉ lệ nhiễm bệnh cao hơn, có thể do đặc thù công việc và hoạt động ngoài trời.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về bệnh sốt mò

Nghiên cứu về tỉ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai đã cung cấp những thông tin quý giá về tình hình dịch tễ học. Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như Realtime PCR sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và điều trị bệnh.

5.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu bệnh sốt mò

Nghiên cứu bệnh sốt mò không chỉ giúp nâng cao nhận thức về bệnh mà còn hỗ trợ trong việc xây dựng các chương trình phòng ngừa hiệu quả.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu bệnh sốt mò

Cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế lây truyền và các yếu tố dịch tễ học liên quan đến bệnh sốt mò. Điều này sẽ giúp cải thiện các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh sốt mò (Scrub typhus) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi khuẩn ký sinh nội bào Orientia tsutsugamushi gây ra, lưu hành rộng rãi tại nhiều quốc gia châu Á – Thái Bình Dương, trong đó có Việt Nam. Ước tính có khoảng 1 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh và khoảng 1 triệu ca bệnh mỗi năm trên toàn cầu. Tại Việt Nam, sốt mò được ghi nhận từ những năm đầu thế kỷ XX và vẫn là một vấn đề y tế quan trọng, đặc biệt tại các vùng có điều kiện sinh thái phù hợp với véc tơ truyền bệnh là các loài mò thuộc chi Leptotrombidium. Bệnh có biểu hiện lâm sàng đa dạng, dễ nhầm lẫn với các bệnh sốt cấp tính khác, gây khó khăn trong chẩn đoán và điều trị kịp thời.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng quy trình tối ưu sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để xác định tình trạng nhiễm O. tsutsugamushi và đánh giá tỷ lệ bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai trong năm 2016. Nghiên cứu tập trung vào việc phát triển phương pháp chẩn đoán phân tử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời khảo sát các yếu tố dịch tễ học liên quan đến tỷ lệ nhiễm bệnh. Phạm vi nghiên cứu bao gồm 156 bệnh nhân nghi ngờ mắc sốt mò được điều trị nội trú tại Bệnh viện Bạch Mai trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2016. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả chẩn đoán, hỗ trợ điều trị sớm và kiểm soát dịch bệnh sốt mò tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Sinh học phân tử của Orientia tsutsugamushi: Vi khuẩn O. tsutsugamushi là vi khuẩn Gram âm, ký sinh nội bào bắt buộc, nhân lên trong tế bào vật chủ qua cơ chế thực bào và nẩy chồi. Vi khuẩn có cấu trúc đặc trưng với protein vỏ 47 kDa (HtrA) được sử dụng làm mục tiêu trong kỹ thuật PCR.
• Dịch tễ học bệnh sốt mò: Mối quan hệ giữa véc tơ truyền bệnh (ấu trùng mò Leptotrombidium), vật chủ trung gian (động vật gặm nhấm), và con người trong chu trình truyền bệnh. Tỷ lệ nhiễm bệnh phụ thuộc vào mật độ véc tơ, đặc điểm sinh thái và yếu tố dịch tễ học.
• Kỹ thuật Realtime PCR: Phương pháp sinh học phân tử sử dụng cặp mồi và probe đặc hiệu để khuếch đại và phát hiện DNA vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
• Khái niệm chính: DNA tổng số, tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC), nhiệt độ tối ưu gắn probe, nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR, giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct), độ đặc hiệu và độ nhạy của xét nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu máu của 156 bệnh nhân nghi ngờ sốt mò điều trị nội trú tại Bệnh viện Bạch Mai trong năm 2016, được lấy vào ống chứa EDTA và bảo quản ở 4ºC.
• Phương pháp chọn mẫu: Lựa chọn mẫu theo tiêu chuẩn bệnh nhân nghi ngờ nhiễm O. tsutsugamushi được chỉ định xét nghiệm bởi bác sĩ lâm sàng.
• Quy trình tách chiết DNA: Tách lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC) bằng dung dịch Ficoll, sau đó tách chiết DNA tổng số sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen).
• Thiết kế cặp mồi và probe: Dựa trên gen mã hóa protein vỏ 47 kDa (HtrA) của O. tsutsugamushi, thiết kế theo nguyên tắc nhiệt độ nóng chảy, thành phần GC, tránh cấu trúc thứ cấp, kiểm tra độ đặc hiệu bằng phần mềm BLAST.
• Phản ứng Realtime PCR: Sử dụng Kapa Robust Master Mix, tối ưu nhiệt độ gắn probe (chọn 60ºC), tối ưu nồng độ MgSO4 (5 mM), chạy trên máy ABI 7500 fast với 40 chu kỳ.
• Phân tích kết quả: Giá trị Ct ≤ 35 được xem là dương tính, không có tín hiệu là âm tính. Đánh giá độ đặc hiệu bằng cách thử với DNA của các vi khuẩn khác (Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, E. coli). Đánh giá độ nhạy qua đường chuẩn với nồng độ DNA từ 10^6 đến 10^0 bản sao/ml.
• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu trong năm 2016, thực hiện tách chiết DNA, tối ưu và chạy Realtime PCR trong năm 2017, phân tích và báo cáo kết quả năm 2018.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tỷ lệ nhiễm O. tsutsugamushi tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2016: Trong 156 bệnh nhân nghi ngờ, có 78 mẫu dương tính với gen HtrA, chiếm tỷ lệ 50%. Trong đó, tỷ lệ nam giới dương tính là 52,7%, nữ giới là 47,3%, cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh ở cả hai giới khá tương đồng.

2. Độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR: Phản ứng chỉ cho kết quả dương tính với DNA của O. tsutsugamushi và các mẫu bệnh phẩm dương tính, không xảy ra phản ứng chéo với các vi khuẩn khác như Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, E. coli. Độ đặc hiệu đạt 100%.

3. Độ nhạy của phản ứng Realtime PCR: Phản ứng có khả năng phát hiện DNA vi khuẩn với giới hạn phát hiện thấp nhất là 10 bản sao/ml. Đường chuẩn có hệ số tương quan R² ≥ 0,98 và hiệu quả PCR đạt khoảng 95%, đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao.

4. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng: Nhiệt độ gắn probe tối ưu là 60ºC, nồng độ MgSO4 tối ưu là 5 mM, giúp tăng cường tín hiệu huỳnh quang và giảm giá trị Ct, nâng cao hiệu quả khuếch đại.

Thảo luận kết quả

Kết quả tỷ lệ nhiễm 50% phản ánh mức độ lưu hành cao của bệnh sốt mò tại khu vực nghiên cứu, phù hợp với các báo cáo dịch tễ học trong khu vực châu Á – Thái Bình Dương. Tỷ lệ nhiễm tương đối đồng đều giữa nam và nữ cho thấy bệnh không phân biệt giới tính, có thể liên quan đến các yếu tố môi trường và nghề nghiệp chung.

Độ đặc hiệu 100% của phản ứng Realtime PCR khẳng định tính chính xác của bộ kit thiết kế dựa trên gen HtrA, phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy gen này là mục tiêu ổn định và đặc hiệu cho O. tsutsugamushi. Độ nhạy cao giúp phát hiện sớm các ca bệnh, kể cả khi tải lượng vi khuẩn thấp, vượt trội hơn so với các phương pháp miễn dịch truyền thống như ELISA hay IFA vốn yêu cầu mẫu huyết thanh giai đoạn cấp và hồi phục.

Việc tối ưu nhiệt độ gắn probe và nồng độ Mg2+ là bước quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR đạt hiệu quả cao, giảm sai số và tăng độ tin cậy. Các biểu đồ đường chuẩn và tín hiệu huỳnh quang minh họa rõ ràng sự khác biệt về hiệu quả khuếch đại ở các điều kiện khác nhau, giúp lựa chọn điều kiện tối ưu cho ứng dụng thực tế.

So sánh với các nghiên cứu trong khu vực, kết quả này góp phần khẳng định vai trò của kỹ thuật Realtime PCR trong chẩn đoán sốt mò, giúp khắc phục hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống về độ nhạy và thời gian trả kết quả. Việc áp dụng kỹ thuật này tại các bệnh viện lớn như Bạch Mai sẽ nâng cao khả năng phát hiện sớm, hỗ trợ điều trị kịp thời và giảm thiểu biến chứng nguy hiểm.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng kỹ thuật Realtime PCR tại các bệnh viện tuyến trung ương và tuyến tỉnh nhằm nâng cao năng lực chẩn đoán sớm bệnh sốt mò, giảm tỷ lệ tử vong và biến chứng. Thời gian thực hiện: trong vòng 1-2 năm. Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế phối hợp với các bệnh viện lớn.

2. Đào tạo chuyên sâu cho cán bộ y tế và kỹ thuật viên xét nghiệm về kỹ thuật tách chiết DNA, thiết kế và vận hành phản ứng Realtime PCR, đảm bảo chất lượng xét nghiệm và kết quả chính xác. Thời gian: 6-12 tháng. Chủ thể: các trường đại học y khoa, viện nghiên cứu.

3. Xây dựng hệ thống giám sát dịch tễ sốt mò dựa trên kết quả xét nghiệm phân tử để theo dõi xu hướng dịch bệnh, phát hiện sớm ổ dịch và có biện pháp phòng chống kịp thời. Thời gian: 1 năm. Chủ thể: Trung tâm Kiểm soát bệnh tật các tỉnh, Bộ Y tế.

4. Nghiên cứu mở rộng về đa dạng chủng O. tsutsugamushi và véc tơ truyền bệnh tại các vùng dịch tễ khác nhau nhằm hiểu rõ hơn về cơ chế lây truyền và đề xuất biện pháp kiểm soát phù hợp. Thời gian: 2-3 năm. Chủ thể: các viện nghiên cứu, trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia truyền nhiễm: Nắm bắt phương pháp chẩn đoán phân tử hiện đại, nâng cao khả năng phát hiện và điều trị sớm bệnh sốt mò, giảm thiểu biến chứng.

2. Kỹ thuật viên xét nghiệm và nhân viên phòng thí nghiệm: Áp dụng quy trình tách chiết DNA và kỹ thuật Realtime PCR chuẩn xác, đảm bảo kết quả xét nghiệm tin cậy.

3. Nhà quản lý y tế và cơ quan y tế công cộng: Sử dụng dữ liệu dịch tễ học và kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách giám sát, phòng chống dịch bệnh hiệu quả.

4. Nhà nghiên cứu và sinh viên chuyên ngành di truyền học, vi sinh y học: Tham khảo phương pháp thiết kế mồi, probe và tối ưu hóa kỹ thuật PCR trong nghiên cứu vi khuẩn ký sinh nội bào, mở rộng ứng dụng trong các nghiên cứu tương tự.

Câu hỏi thường gặp

1. Realtime PCR có ưu điểm gì so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống?
   Realtime PCR cho kết quả nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phát hiện được vi khuẩn ngay trong giai đoạn sớm của bệnh, không phụ thuộc vào mẫu huyết thanh giai đoạn hồi phục như các phương pháp miễn dịch.

2. Tại sao chọn gen mã hóa protein vỏ 47 kDa (HtrA) làm mục tiêu trong PCR?
   Gen HtrA có vùng trình tự bảo tồn đặc trưng cho O. tsutsugamushi, giúp thiết kế mồi và probe đặc hiệu, giảm thiểu phản ứng chéo với các vi khuẩn khác, đảm bảo độ chính xác của xét nghiệm.

3. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật Realtime PCR trong nghiên cứu này là bao nhiêu?
   Kỹ thuật có thể phát hiện được DNA vi khuẩn với nồng độ thấp nhất khoảng 10 bản sao/ml, cho phép phát hiện sớm các ca bệnh với tải lượng vi khuẩn thấp.

4. Có thể áp dụng kỹ thuật này ở các cơ sở y tế tuyến dưới không?
   Kỹ thuật yêu cầu trang thiết bị chuyên dụng và nhân lực được đào tạo bài bản, do đó hiện phù hợp với các bệnh viện tuyến trung ương và các phòng xét nghiệm chuyên sâu. Tuy nhiên, có thể mở rộng dần khi có đầu tư và đào tạo.

5. Tỷ lệ nhiễm bệnh 50% có ý nghĩa gì trong thực tế?
   Tỷ lệ này cho thấy bệnh sốt mò có mức độ lưu hành cao tại khu vực nghiên cứu, cần tăng cường giám sát và phòng chống để giảm thiểu nguy cơ lây lan và biến chứng nghiêm trọng.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình tối ưu sử dụng kỹ thuật Realtime PCR dựa trên gen HtrA để chẩn đoán O. tsutsugamushi với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
• Tỷ lệ nhiễm bệnh sốt mò tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2016 là khoảng 50%, phản ánh mức độ lưu hành đáng kể của bệnh.
• Kỹ thuật Realtime PCR cho phép phát hiện sớm, chính xác, hỗ trợ hiệu quả cho công tác chẩn đoán và điều trị.
• Cần triển khai áp dụng rộng rãi kỹ thuật này tại các cơ sở y tế để nâng cao năng lực chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh.
• Các bước tiếp theo bao gồm đào tạo nhân lực, xây dựng hệ thống giám sát dịch tễ và nghiên cứu đa dạng chủng vi khuẩn để hoàn thiện chiến lược phòng chống sốt mò.

Hành động ngay hôm nay để áp dụng kỹ thuật Realtime PCR trong chẩn đoán sốt mò sẽ góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu tác động của bệnh truyền nhiễm nguy hiểm này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt mò (Scrub typhus) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính,bệnh truyền qua côn trùng, tiết túc do vi khuẩn ký sinh nội bào Orientia tsutsugamushi (trƣớc kia gọi là Ricketsia orientalis hoặc Ricketsia tsutsugamushi) gây nên. Đây là bệnh sốt cấp tính lƣu hành và gây dịch ở nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Ƣớc tính có khoảng 1 tỷ ngƣời có nguy cơ bị mắc bệnh và khoảng 1 triệu ca bệnh mỗi năm [32,44]. Trong những năm gần đây, sốt mò đƣợc phát hiện và tái phát hiện ở nhiều nƣớc trong vùng dịch tễ nhƣ: Lào, Ấn Độ, Sri Lanka, Maldives.

Sốt mò là bệnh của động vật, chủ yếu là các động vật gặm nhấm và các động vật có xƣơng sống nhỏ khác thuộc lớp thú. Ổ bệnh và trung gian truyền bệnh là mò Leptotrumbidium, một loài chân đốt thuộc họ ve bét. tsutsugamushi truyền vi khuẩn cho đời sau qua trứng và qua các giai đoạn phát triển. Ấu trùng mò nhiễm O.

tsutsugamushitruyền mầm bệnh cho động vật và ngƣời khi đốt[36,37,49]. Sốt mò ở ngƣời có các biểu hiện lâm sàng đa dạng, rất giống với nhiều bệnh truyền nhiễm cấp tính khác. Các ca bệnh điển hình có vết đố t đặc hiệu ngoài da có giá trị chẩn đoán nhƣng chỉ có ở một số bệnh nhân, không đại diện đầy đủ cho phổ bệnh thực sự của sốt mò và đôi khi không đƣợc phát hiện. Bệnh có thể tiến triển nặng và gây tử vong nếu không đƣợc chẩn đoán sớm, đúng và điều trị đặc hiệu [52].

Các xét nghiệm chẩn đoán xác định bệnh sốt mò có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định ca bệnh trên lâm sàng, định hƣớng điều trị sớm và điều trị đặc hiệu nhằm giảm thiểu biến chứng và nguy cơ tử vong cho ngƣời bệnh.Tuy nhiên, viê ̣c phát hiê ̣n ra bệnh sốt mò rất khó nếu không có phƣơng pháp chẩn đoán phù hợp. Trƣớc khi có phƣơng pháp chẩn đoán hiện đại, việc chẩn đoán phụ thuộc rất nhiều vào trình độ của bác sĩ cũng nhƣ sự xuất hiện của vectơ truyền bệnh hay vết đốt. Nhiều ngƣời bệnh có triệu chứng không điển hình, sốt kéo dài làm cho chẩn đoán bị nhầm lẫn. Nếu đƣợc chẩn đoán đúng thì việc điều trị rất đơn giản.

Do đó, chẩn đoán bệnh bằng các xét nghiệm chính xác và kịp thời sẽ hỗ trợ rất nhiều cho các bác sĩ trong việc điều trị bệnh ricketssia. Ngày nay trên thế giới, có ba phƣơng 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 pháp chính đƣợc sử dụng để chẩn đoán bệnh sốt mò, đó là: phƣơng pháp nuôi cấy, phƣơng pháp miễn dịch và phƣơng pháp sinh học phân tử. Tuy nhiên, phƣơng pháp nuôi cấy không thể thực hiện đƣợc ở các cơ sở khám chữa bệnh do yêu cầu về phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp ba, do tínhphức tạp và tốn nhiều thời gian. Phƣơng pháp miễn dịch đòi hỏi phải có hai mẫu huyết thanh của ngƣời bệnh ở hai thời điểm khác nhau, một mẫu trong giai đoạn cấp tính, một mẫu trong giai đoạn hồi phục.Điề u này gây khó khăn cho việc lấy mẫu, phát hiện và chữa trị bệnh kịp thời.

Do đó, áp dụng phƣơng pháp PCR trong chẩn đoán bệnh sốt mò là công cụ hữu ích nhất hiện nay trong các bệnh viện và cơ sở y tế tại Việt Nam. Đây cũng là phƣơng pháp giúp cải thiện đƣợc các hạn chế của hai phƣơng pháp trƣớc, tiết kiệm thời gian và trả kết quả nhanh nhất, kịp thời cho công tác chẩn đoán và chữa bệnh. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP REALTIME PCR TRONG ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TỈ LỆ BỆNH SỐT MÒ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2016” với các mục tiêu nghiên cứu nhƣ sau: 1. Xây dựng đƣợc quy trình tối ƣu để xác định tình trạng nhiễm O.

tsutsugamushi gây bệnh sốt mò bằng kĩ thuật Realtime PCR. Xác định đƣợc tỉ lệ bệnh nhân nhiễm O. tsutsugamushi tại bệnh viện Bạch Mai trong năm 2016 và một số yếu tố dịch tễ học có liên quan. Đề tài nghiên cứu này đƣợc thực hiện với các nội dung sau: Xây dựng quy trình tối ƣu để xác định tình trạng nhiễm O.

tsutsugamushi gây bệnh sốt mò bằng kĩ thuật Realtime PCR bao gồm các bƣớc: Thiết kế mồi, tối ƣu nhiệt độ gắn Taqman probe, Tối ƣu nồng độ Mg2+ của phản ứng Realtime PCR, tách chiết DNA, tiến hành phản ứng Realtime PCR, đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 Ứng dụng phƣơng pháp Realtime PCR để xác định tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi tại bệnh viện Bạch Mai năm 2016 và điều tra một số yếu tố dịch tễ học có liên quan. 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sốt mò đƣợc biết đến từ rất sớm. Những mô tả đầu tiên về một bệnh nhân có triệu chứng tƣơng tự sốt mò đƣợc tìm thấy tại Trung Quốc vào thế kỉ thứ IV sau công nguyên; bệnh đƣợc cho là có liên quan đến một loại côn trùng màu đỏ. Tại Nhật Bản, bệnh đƣợc Hashimoto mô tả lần đầu tiên vào năm 1810 nhƣng đến năm 1878 mới đƣợc biết đến rộng rãi qua thông báo của bác sỹ Theodor Palm với tên địa phƣơng là “shima mushi”. Vai trò lây truyền bệnh của ấu trùng mò Leptotrobidium đƣợc Brumpt đề cập đến lần đầu tiên vào năm 1910.

Bản chất của vi khuẩn gây sốt mò đƣợc xác định vào cuối những năm 1920. Dịch tễ học bệnh sốt mò 1. tsutsugamushi – tác nhân gây bệnh sốt mò 1. Đặc điểm của vi khuẩn O.

tsutsugamushi Vi khuẩn gây bệnh sốt mò – O. tsutsugamushi có kích thƣớc 0,5 – 0,8µm x 1,2 – 3,0µm, là vi khuẩn Gram âm, kí sinh nội bào. Mỗi tế bào vi khuẩn đƣợc bao bọc bởi một lớp thành tế bào rất mềm và một lớp màng tế bào. Vỏ vi khuẩn không chứa các peptidoglycan và lipopolysaccaride, lá ngoài của thành tế bào dày hơn đáng kể so với lá trong.

tsutsugamushi bắt màu Giemsa, mọc trong túi thể vàng của phôi gà hoặc một loạt các dòng tế bào nuôi cấy. tsutsugamushi xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua cơ chế thực bào, đi vào nguyên sinh chất và phát triển chủ yếu ở vùng cận nhân tế bào. Vi khuẩn đƣợc giải phóng ra khỏi tế bào vật chủ bằng phƣơng pháp nẩy chồi và đƣợc bao bọc bởi một lớp màng của tế bào vật chủ tƣơng tự nhƣ những virus có vỏ. tsutsugamushi nhân lên bằng phƣơng pháp chia đôi, chu kì nhân bản kéo dài khoảng 9 – 18 giờ [47].

Trƣớc năm 1995, Ricketsia tsutsugamushi(nay gọi là O. tsutsugamushi) đƣợc xếp ở trong giống Ricketsia, là loài duy nhất trong giống sốt mò. Tuy nhiên, những nghiên cứu về cấu trúc và di truyền học cho thấy sự khác biệt lớn giữa Ricketsia 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 tsutsugamushi và các Ricketsia khác. Cấu trúc thành tế bào của O.

tsutsugamushi có lá ngoài dày hơn lá trong, không chứa peptidoglycan và lipopolysaccaride; O. tsutsugamushi đề kháng cao tự nhiên với Penicillin. Khi phân tích trình tự gen 16S rARN, khoảng khác biệt giữa R.tsutsugamushi và các vi khuẩn khác trong giống Ricketsia gần bằng với khoảng khác biệt tiến hóa giữa các giống trong họ Ricketsiale. Vì những lí do này, R.tsutsugamushi đƣợc tách ra thành một giống riêng, mang tên O.

Tính đa dạng của các chủng O. tsutsugamushi Tất cả các chủng vi khuẩn sốt mò có cấu trúc kháng nguyên rất khác nhau và độc tính với chuột cũng rất khác nhau [47]. Sự khác biệt về mặt kháng nguyên đƣợc xác định chủ yếu qua cấu trúc của các protein vỏ, và có thể đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp huyết thanh học và kĩ thuật sinh học phân tử [26]. tsutsugamushi cổ điển là: Karp, Kato và Gilliam; ngoài ba chủng này còn có hơn ba mƣơi chủng huyết thanh khác đƣợc xác định tại các nƣớc khác nhau và các địa phƣơng khác nhau tại vùng dịch tễ.

Một vùng địa lý có thể có nhiều chủng O. tsutsugamushi cùng tồn tại. Tính đa dạng này có vai trò quan trọng trong dịch tễ học của sốt mò tại địa phƣơng. Mò Leptotrobidium - ổ bệnh và trung gian truyền bệnh 1.

Một số đặc điểm sinh học của mò Leptotrobidium Mò Leptotrobidiumlà một chi động vật trong họ ve mò(Trombiculidae), lớp Nhện (arachnida), ngành chân đốt (arthropoda). Mò có kích thƣớc bé, không quá 1mm, màu sắc từ vàng đến da cam nên còn gọi là mò đỏ[3]. Vòng đời của mò bao gồm bốn giai đoạn phát triển: trứng, ấu trùng, nymph và giai đoạn trƣởng thành[37]. Mò trƣởng thành sống trong đất xốp và ẩm.

Mò cái đẻ trứng trên các lớp đất bề mặt. Âú trùng nở ra từ trứng bò lên cây cỏ hoặc tàn cây, một số nấp trong các khe nứt hoặc trần hang chuột để chờ bám vào động vật và đốt. Sau khi đốt động vật, ấu trùng quay trở lại mặt đất trải qua các giai đoạn phát triển tiếp theo và phát triển đến giai đoạn trƣởng thành, sẵn sàng sản sinh ra thế hệ mò sau. Thời gian sống của mò 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 trƣởng thành có thể kéo dài 15 tháng hoặc lâu hơn.

Chu kì sinh trƣởng của mò kéo dài 2 – 3 tháng ở những vùng có khí hậu ấm và có thể kéo dài hơn 8 tháng ở những vùng có khí hậu lạnh[37,39]. Ấu trùng là giai đoạn phát triển duy nhất của mò ký sinh ở các động vật có xƣơng sống, chủ yếu là chuột và các thú nhỏ khác trong lớp gặm nhấm, có thể đốt ngƣời. Thời gian đốt động vật của ấu trùng mò kéo dài 48 – 72 giờ (có thể kéo dài đến 12 ngày ở một số loài). Ấu trùng mò chƣa đốt động vật có thể sống đến 30 ngày và có tầm di chuyển rất hạn chế.

Khi đốt động vật chúng thƣờng tập trung thành từng đám vài trăm cá thể ở những nơi rất hẹp nhƣ tai và vùng hậu môn – sinh dục của động vật, có thể bị gãi văng ra hoặc rời vật chủ gần nhƣ cùng một lúc. Những yếu tố này góp phần hình thành các “đảo mò” hay các “điểm nóng” lây truyền sốt mò đƣợc mô tả trong các nghiên cứu dịch tễ học của bệnh [37, 39]. Phân bố của mò Leptotrombidium Những loài mò đƣợc xác định là ổ bệnh và trung gian truyền bệnh sốt mò bao gồm: L.arenicula và 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 một số loài khác.akamushi là vector lây truyền sốt mò mùa hè ở các vùng dịch truyền thống của Nhật Bản nhƣ: Niigata, Yamagata và Akita [30].