Tổng quan nghiên cứu

Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Staphylococcus aureus là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo WHO/FAO, hàng năm có khoảng 1,5 tỷ người bị ngộ độc thực phẩm, trong đó 30% dân số các nước công nghiệp bị ảnh hưởng. Ở châu Âu, mỗi năm có hơn 380.000 người mắc bệnh do thực phẩm nhiễm vi khuẩn, trong đó S. aureus là tác nhân phổ biến gây ngộ độc và nhiễm trùng bệnh viện với tỷ lệ mắc và tử vong cao. Ở Việt Nam, số vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm 40-45%, trong đó nhiều vụ liên quan đến S. aureus, với hơn 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm mỗi năm, gây thiệt hại kinh tế trên 200 triệu USD.

S. aureus có khả năng sinh độc tố ruột gây viêm ruột cấp, mất nước, sốc và có tính kháng thuốc cao, đặc biệt là các chủng MRSA và VRSA. Việc sử dụng các chất bảo quản hóa học trong thực phẩm bị hạn chế do ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe, do đó các chất bảo quản sinh học như enzyme endolysin đang được quan tâm. Endolysin là enzym thủy phân peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gram dương một cách chọn lọc, an toàn và không làm thay đổi đặc tính cảm quan của thực phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu là thu nhận enzyme endolysin tái tổ hợp LysSa từ chủng E. coli BL21, tối ưu điều kiện nuôi cấy và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của enzyme đối với S. aureus trong bảo quản sữa tươi nguyên liệu và sữa thanh trùng. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Hà Nội, trong năm 2018. Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển giải pháp sinh học thay thế kháng sinh trong bảo quản thực phẩm, nâng cao an toàn vệ sinh thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Lý thuyết về vi khuẩn Staphylococcus aureus: Là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, có khả năng sinh độc tố enterotoxin gây ngộ độc thực phẩm, kháng nhiều loại kháng sinh, phát triển trong khoảng nhiệt độ 7-48°C và pH 4,5-9,3.

  • Mô hình enzyme endolysin: Endolysin là enzym thủy phân peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn do thực khuẩn thể mã hóa, gồm hai domain chính: domain xúc tác (N-đầu) và domain gắn vách tế bào (C-đầu). Endolysin có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gram dương nhanh chóng, ổn định trong điều kiện bảo quản thực phẩm.

  • Khái niệm tái tổ hợp gen và biểu hiện protein trong E. coli BL21: Sử dụng vector pET21b chứa promoter T7 và lac operator, cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, thu nhận protein tái tổ hợp có gắn nhãn His để tinh sạch bằng sắc ký ái lực.

  • Khái niệm và phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Đo mật độ quang OD600 để xác định khả năng ức chế sự phát triển của S. aureus trong môi trường có bổ sung enzyme endolysin.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Chủng vi khuẩn E. coli BL21 mang plasmid pET21b-LysSa tái tổ hợp, chủng S. aureus phân lập từ bệnh viện Bạch Mai và Viện Kiểm nghiệm thuốc, sữa tươi nguyên liệu và sữa tươi thanh trùng.

  • Phương pháp phân tích:

    • Nuôi cấy E. coli BL21 trong môi trường LB bổ sung ampicillin, cảm ứng biểu hiện gen bằng IPTG với các nồng độ và điều kiện khác nhau để tối ưu hóa sản xuất enzyme.

    • Phá tế bào bằng sóng siêu âm, thu dịch enzyme thô, tinh sạch bằng sắc ký ái lực His-Trap.

    • Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp pha loãng tới hạn, đo giảm mật độ quang OD600 của S. aureus trong môi trường LB có bổ sung enzyme.

    • Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trong sữa tươi nguyên liệu và sữa thanh trùng với các nồng độ enzyme và thời gian bổ sung khác nhau.

    • Đánh giá chất lượng sữa sau khi bổ sung enzyme qua các chỉ tiêu: chất béo, chất khô không béo, tỷ trọng, nước thêm vào và protein.

  • Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2018, bao gồm các giai đoạn tối ưu điều kiện nuôi cấy, thu nhận và tinh sạch enzyme, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và chất lượng sữa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và biểu hiện enzyme: Ở 32°C, hoạt tính enzyme LysSa đạt 22,6 U/ml, cao hơn so với 37°C (21,3 U/ml) dù sinh trưởng vi khuẩn tốt hơn ở 37°C. Ở 25°C, hoạt tính thấp nhất (18,5 U/ml).

  2. Ảnh hưởng thành phần môi trường: Nồng độ cao nấm men 8 g/l và trypton 8 g/l là điều kiện tối ưu cho sinh trưởng E. coli BL21 và biểu hiện enzyme LysSa với hoạt tính lần lượt đạt 22,8 U/ml và 23,1 U/ml. Mật độ tế bào OD600nm đạt 1,29 và 1,26 tương ứng.

  3. Ảnh hưởng nồng độ IPTG: Hoạt tính LysSa tăng theo nồng độ IPTG từ 0,2 đến 1,0 mM, đạt cực đại 22,7 U/ml ở 1,0 mM, sau đó giảm ở 1,2 mM do độc tính IPTG với tế bào.

  4. Thời gian cảm ứng tối ưu: Sau 6 giờ nuôi cấy, bổ sung IPTG và cảm ứng trong 4 giờ, hoạt tính enzyme đạt cực đại 22,8 U/ml. Sinh trưởng tế bào đạt OD600nm 1,3.

  5. Phương pháp phá tế bào hiệu quả: Siêu âm phá tế bào cho hoạt tính enzyme thu được cao nhất 223,6 U/ml, vượt trội so với nghiền bi (138,4 U/ml) và dung môi hóa học (9,7 U/ml).

  6. Tinh sạch enzyme: Sau sắc ký ái lực, hoạt độ riêng enzyme tăng 4,1 lần, đạt 156,68 U/mg protein, hiệu suất thu hồi 65,7%.

  7. Hoạt tính kháng khuẩn trong môi trường nuôi cấy: Enzyme LysSa thể hiện khả năng ức chế S. aureus rõ rệt ở nồng độ từ 20 đến 60 µg/ml, với hiệu quả tăng theo thời gian, ức chế hoàn toàn sau 22 giờ.

  8. Hoạt tính kháng khuẩn trong sữa: Enzyme LysSa ở nồng độ 200 µg/lít có khả năng ức chế vi khuẩn S. aureus trong sữa tươi nguyên liệu và sữa thanh trùng, kéo dài thời gian bảo quản mà không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu chất lượng sữa như chất béo, protein, tỷ trọng.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy nhiệt độ 32°C và môi trường nuôi cấy giàu cao nấm men, trypton là điều kiện tối ưu để biểu hiện enzyme endolysin LysSa trong E. coli BL21, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về biểu hiện protein tái tổ hợp. Việc sử dụng IPTG ở nồng độ vừa phải (1,0 mM) giúp tăng hiệu quả biểu hiện mà không gây độc tế bào.

Phương pháp siêu âm phá tế bào được chứng minh là hiệu quả nhất trong thu nhận enzyme hoạt tính cao, phù hợp với đặc tính protein tái tổ hợp có gắn nhãn His, thuận lợi cho quá trình tinh sạch bằng sắc ký ái lực. Hoạt tính enzyme sau tinh sạch tăng rõ rệt, cho thấy quy trình thu nhận enzyme đạt hiệu quả cao.

Hoạt tính kháng khuẩn của enzyme LysSa đối với S. aureus được xác nhận qua các thử nghiệm in vitro và trong môi trường sữa, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, đặc biệt là sữa tươi. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu về endolysin LysH5 và các chế phẩm endolysin được FDA công nhận trong kiểm soát vi khuẩn gây bệnh thực phẩm.

Việc enzyme không làm thay đổi các chỉ tiêu chất lượng sữa chứng tỏ tính an toàn và khả năng ứng dụng thực tiễn trong ngành công nghiệp chế biến sữa. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính enzyme theo nhiệt độ, nồng độ IPTG, thời gian cảm ứng và bảng so sánh hoạt tính trước và sau tinh sạch.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Ứng dụng enzyme endolysin LysSa trong bảo quản sữa tươi: Khuyến nghị sử dụng enzyme ở nồng độ 200 µg/lít trong sữa tươi nguyên liệu và sữa thanh trùng để kéo dài thời gian bảo quản, giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn S. aureus. Thời gian bổ sung enzyme nên từ 3 đến 8 giờ trước khi tiêu thụ hoặc chế biến tiếp theo.

  2. Tối ưu quy trình sản xuất enzyme quy mô công nghiệp: Áp dụng điều kiện nuôi cấy E. coli BL21 ở 32°C, môi trường chứa 8 g/l cao nấm men và 8 g/l trypton, cảm ứng IPTG 1,0 mM trong 4 giờ để thu nhận enzyme với hiệu suất cao. Sử dụng phương pháp siêu âm phá tế bào và tinh sạch bằng sắc ký ái lực để đảm bảo chất lượng enzyme.

  3. Phát triển sản phẩm enzyme endolysin dạng bột hoặc dung dịch ổn định: Nghiên cứu thêm về bảo quản enzyme ở nhiệt độ thấp và pH phù hợp để duy trì hoạt tính lâu dài, phục vụ cho việc lưu trữ và vận chuyển trong ngành công nghiệp thực phẩm.

  4. Đào tạo và hướng dẫn kỹ thuật cho các cơ sở chế biến sữa: Tổ chức các khóa đào tạo về ứng dụng enzyme endolysin trong bảo quản sữa, đảm bảo quy trình sử dụng đúng cách, an toàn và hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính enzyme endolysin tái tổ hợp, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về enzyme kháng khuẩn.

  2. Doanh nghiệp chế biến sữa và thực phẩm: Tham khảo để ứng dụng enzyme endolysin như một chất bảo quản sinh học thay thế kháng sinh và chất bảo quản hóa học, nâng cao chất lượng và an toàn sản phẩm.

  3. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và y tế công cộng: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách, hướng dẫn sử dụng các sản phẩm enzyme sinh học trong bảo quản thực phẩm, góp phần giảm thiểu ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn S. aureus.

  4. Các tổ chức đào tạo và phát triển công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo cho việc thiết kế chương trình đào tạo, phát triển công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

  1. Endolysin là gì và có tác dụng như thế nào trong bảo quản thực phẩm?
    Endolysin là enzym thủy phân peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gram dương nhanh chóng và chọn lọc. Trong bảo quản thực phẩm, endolysin giúp ức chế vi khuẩn gây bệnh như S. aureus mà không làm thay đổi đặc tính cảm quan của sản phẩm.

  2. Tại sao sử dụng E. coli BL21 để biểu hiện enzyme endolysin?
    E. coli BL21 là chủng vi khuẩn nhân sơ phổ biến, dễ nuôi cấy, sinh trưởng nhanh và có hệ thống biểu hiện gen hiệu quả với vector pET, giúp thu nhận lượng lớn protein tái tổ hợp với chi phí thấp.

  3. Nồng độ IPTG ảnh hưởng thế nào đến biểu hiện enzyme?
    IPTG là chất cảm ứng biểu hiện gen. Nồng độ IPTG tăng từ 0,2 đến 1,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme, nhưng vượt quá 1,0 mM có thể gây độc tế bào, làm giảm hiệu quả biểu hiện.

  4. Phương pháp phá tế bào nào hiệu quả nhất để thu enzyme?
    Phương pháp siêu âm phá tế bào cho hiệu quả cao nhất với hoạt tính enzyme thu được đạt 223,6 U/ml, vượt trội so với các phương pháp khác như nghiền bi hay sử dụng dung môi hóa học.

  5. Enzyme endolysin có ảnh hưởng đến chất lượng sữa không?
    Nghiên cứu cho thấy bổ sung enzyme endolysin LysSa ở nồng độ 200 µg/lít không làm thay đổi các chỉ tiêu chất lượng sữa như chất béo, protein, tỷ trọng, đảm bảo an toàn và giữ nguyên đặc tính cảm quan của sản phẩm.

Kết luận

  • Đã tối ưu thành công điều kiện nuôi cấy E. coli BL21 biểu hiện enzyme endolysin LysSa với nhiệt độ 32°C, môi trường chứa 8 g/l cao nấm men và 8 g/l trypton, cảm ứng IPTG 1,0 mM trong 4 giờ.
  • Phương pháp siêu âm phá tế bào và sắc ký ái lực His-Trap hiệu quả trong thu nhận và tinh sạch enzyme với hoạt độ riêng tăng 4,1 lần.
  • Enzyme LysSa thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ đối với S. aureus trong môi trường nuôi cấy và sữa tươi nguyên liệu, sữa thanh trùng.
  • Bổ sung enzyme không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu chất lượng sữa, đảm bảo an toàn và giữ nguyên đặc tính sản phẩm.
  • Đề xuất ứng dụng enzyme endolysin LysSa trong bảo quản sữa tươi để nâng cao an toàn thực phẩm và giảm thiểu ngộ độc do S. aureus.

Next steps: Nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất enzyme, đánh giá hiệu quả trong các sản phẩm thực phẩm khác và phát triển sản phẩm thương mại.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp chế biến thực phẩm nên hợp tác để ứng dụng enzyme endolysin trong bảo quản, góp phần nâng cao chất lượng và an toàn thực phẩm.