Luận văn thạc sĩ hus tạo bào tử bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa chống virus đốm trắng ở tôm.

• Tác giả: Bùi Thu Thủy
• Người hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Vân Anh
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
• 1.1.1. Nội bào tử vi khuẩn
• 1.1.2. Bào tử Bacillus subtilis
• 1.1.3. Giới thiệu chung về streptavidin
• 1.1.4. Cấu trúc của streptavidin
• 1.1.5. Cấu tạo của biotin. Tương tác streptavidin-biotin
• 1.1.6. Thiết kế trạng thái đơn hóa trị của streptavidin với một vị trí gắn biotin duy nhất
• 1.2. VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM
• 1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh đốm trắng ở tôm và virus gây bệnh đốm trắng
• 1.2.2. Protein vỏ VP28 của virus WSSV
• 1.2.3. Các phương pháp phát hiện virus gây bệnh đốm trắng ở tôm
• 1.2.4. subtilis biểu hiện streptavidin trên bề mặt (bào tử-strep) và ứng dụng
• 1.3. PHẢN ỨNG NGỪNG KẾT MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG
• 2. CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Chủng vi khuẩn
• 2.2. Mẫu tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng
• 2.3. Các nguyên liệu khác
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP
• 2.4.1. Tách chiết ADN hệ gen từ vi khuẩn Gram dương
• 2.4.2. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn
• 2.4.3. Tách chiết ADN hệ gen của virus từ mẫu tôm nhiễm WSSV
• 2.4.4. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR
• 2.4.5. Nhân dòng các đoạn gen đích vào vector pCR
• 2.4.6. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α
• 2.4.7. Xử lý plasmid bằng các cặp enzyme giới hạn. Phản ứng gắn đoạn gen đích (insert) vào vector bằng T4 ADN ligase. Dung hợp đoạn gen đích vào ADN hệ gen của Bacillus subtilis chủng PY79. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích trong ADN hệ gen của B.
• 2.4.8. Nuôi cấy tạo bào tử
• 2.4.9. Kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp bằng phương pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting)
• 2.4.10. Biotinyl hóa kháng thể kháng VP28
• 2.4.11. Gắn kháng thể kháng VP28 đã được biotinyl hóa lên trên bào tử-strep
• 2.4.12. Nhuộm màu bào tử-strep đã gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl
• 2.4.13. Thu dịch nghiền có chứa virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm sú nhiễm bệnh
• 2.4.14. Phản ứng ngưng kết thụ động ngược (Reverse passive latex agglutination)
• 2.4.15. Định lượng số bản copies của WSSV bằng kỹ thuật PCR đúng thời điểm (Realtime PCR)
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN STREPTAVIDIN VÀO VECTOR PDG364 COTB VÀ DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B.
• 3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa cotB và streptavidin bằng phương pháp PCR
• 3.1.2. Để thu được lượng lớn đoạn gen mã hóa cho streptavidin từ nguồn ADN hệ gen của Streptomyces avidinii và cotB từ ADN hệ gen của B. subtilis chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt cho từng đoạn gen như sau:
• 3.1.3. Nhân dòng đoạn gen cotB vào vector pDG364
• 3.1.4. Nhân dòng đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB
• 3.1.5. Đưa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin trên vector vào hệ gen B.
• 3.2. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP COTB- STREPTAVIDIN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ B.
• 3.2.1. Kiểm tra khả năng tạo bào tử của tế bào B. subtilis tái tổ hợp
• 3.2.2. Kiểm tra biểu hiện của cotB-streptavidin trên bào tử bằng phương pháp thẩm tách miễn dịch
• 3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ LIÊN KẾT CỦA BÀO TỬ-STREP VỚI KHÁNG THỂ KHÁNG VP28-BIOTINYL
• 3.3.1. Đánh giá mức độ liên kết của bào tử-strep với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl
• 3.3.2. Đánh giá hằng số phân ly của phức hệ bào tử-strep- kháng thể kháng VP28-biotinyl
• 3.4. PHẢN ỨNG NGỪNG KẾT MIỄN DỊCH THỤ ĐỘNG KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM WSSV
• 3.4.1. Xác định nồng độ virus trong dịch nghiền bằng Realtime PCR
• 3.4.2. Đánh giá khả năng hình thành ngưng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl với dịch nghiền tôm nhiễm WSSV
• 3.4.3. Đánh giá khả năng hình thành phản ứng ngưng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl với các nồng độ virus pha loãng
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu bào tử Bacillus subtilis và streptavidin

Nghiên cứu về bào tử Bacillus subtilis và khả năng biểu hiện streptavidin trên bề mặt bào tử đã thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học. Bào tử Bacillus subtilis được biết đến với khả năng chịu nhiệt và tính an toàn cao, làm cho chúng trở thành một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu sinh học. Việc biểu hiện streptavidin trên bề mặt bào tử mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học.

1.1. Bào tử Bacillus subtilis Đặc điểm và ứng dụng

Bào tử Bacillus subtilis có khả năng chịu đựng môi trường khắc nghiệt, giúp chúng tồn tại lâu dài. Chúng được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm nhờ vào tính an toàn và hiệu quả của chúng trong việc cải thiện sức khỏe cây trồng và động vật.

1.2. Streptavidin Tính chất và vai trò trong nghiên cứu

Streptavidin là một protein có khả năng liên kết mạnh mẽ với biotin, tạo điều kiện cho việc phát hiện và phân tích các phân tử sinh học. Sự kết hợp giữa streptavidin và bào tử Bacillus subtilis mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp phát hiện virus hiệu quả.

II. Thách thức trong việc phát hiện virus đốm trắng ở tôm

Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) là một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với ngành nuôi tôm. Việc phát hiện sớm virus này là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan và thiệt hại kinh tế. Tuy nhiên, các phương pháp hiện tại như PCR và hóa mô miễn dịch thường yêu cầu điều kiện phòng thí nghiệm, không thuận tiện cho việc sử dụng thực địa.

2.1. Tác động của virus đốm trắng đến ngành nuôi tôm

Virus WSSV gây ra thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm, ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng tôm nuôi. Việc phát hiện sớm virus là cần thiết để có biện pháp phòng ngừa kịp thời.

2.2. Hạn chế của các phương pháp phát hiện hiện tại

Các phương pháp phát hiện virus hiện tại thường tốn kém và yêu cầu thiết bị phức tạp, không phù hợp cho việc sử dụng tại các trang trại nuôi tôm. Do đó, cần phát triển các phương pháp đơn giản và hiệu quả hơn.

III. Phương pháp tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin

Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo ra bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn với kháng thể biotinyl hóa. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện virus mà còn có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y học và công nghệ sinh học.

3.1. Quy trình tạo bào tử và biểu hiện protein

Quy trình tạo bào tử bao gồm các bước như nuôi cấy vi khuẩn, tách chiết ADN và biến nạp gen vào bào tử. Việc biểu hiện streptavidin trên bề mặt bào tử được thực hiện thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến.

3.2. Gắn kháng thể biotinyl hóa lên bào tử strep

Kháng thể biotinyl hóa được gắn lên bề mặt bào tử-strep, tạo thành một phức hợp có khả năng phát hiện virus WSSV. Phương pháp này hứa hẹn mang lại hiệu quả cao trong việc phát hiện virus trong mẫu tôm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin có khả năng gắn kết với kháng thể biotinyl hóa, từ đó phát hiện virus WSSV trong mẫu tôm. Phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản.

4.1. Đánh giá hiệu quả của bào tử strep trong phát hiện virus

Các thí nghiệm cho thấy bào tử-strep có khả năng phát hiện virus WSSV với độ nhạy và độ chính xác cao. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các bộ kit phát hiện virus đơn giản và hiệu quả.

4.2. Ứng dụng trong ngành nuôi trồng thủy sản

Phương pháp phát hiện virus mới này có thể được áp dụng trực tiếp tại các trang trại nuôi tôm, giúp nông dân phát hiện sớm và có biện pháp phòng ngừa kịp thời, từ đó giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

V. Kết luận và hướng nghiên cứu tương lai

Nghiên cứu về bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus đốm trắng ở tôm đã mở ra nhiều triển vọng mới trong việc phát hiện virus. Hướng nghiên cứu tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng của phương pháp này.

5.1. Tương lai của nghiên cứu bào tử Bacillus subtilis

Nghiên cứu có thể mở rộng sang việc phát triển các loại bào tử khác có khả năng biểu hiện các protein khác nhau, từ đó tạo ra các sản phẩm sinh học đa dạng hơn.

5.2. Hướng đi mới trong phát hiện virus

Phát triển các bộ kit phát hiện virus dựa trên bào tử-strep có thể giúp cải thiện khả năng phát hiện virus trong thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả quản lý dịch bệnh trong ngành nuôi trồng thủy sản.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng đốm trắng ở tôm do virus White Spot Syndrome Virus (WSSV) gây ra là một trong những thảm họa dịch bệnh nghiêm trọng nhất đối với ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu, gây tỷ lệ tử vong lên tới 90% đến 100% đàn tôm chỉ sau 45 đến 60 ngày thả nuôi. Tại Việt Nam và nhiều quốc gia Đông Nam Á, dịch bệnh này gây thiệt hại hàng trăm triệu USD mỗi năm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Biện pháp phòng ngừa then chốt hiện nay là kiểm soát con giống sạch mầm bệnh và giám sát nguồn nước ao nuôi. Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán tiêu chuẩn như PCR hoặc hóa mô miễn dịch đòi hỏi thiết bị phòng thí nghiệm phức tạp và thời gian xử lý từ 24 đến 72 giờ, trong khi các bộ que thử nhanh thương mại nhập khẩu có giá thành cao, dao động khoảng 10 USD cho mỗi xét nghiệm và vẫn ghi nhận tỷ lệ dương tính giả nhất định.

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm đã thực hiện đề tài nghiên cứu nhằm tạo lập hệ thống biểu hiện bề mặt protein ngoại lai trên bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. Mục tiêu cụ thể là gắn kết thành công protein Streptavidin lên vỏ bào tử vi khuẩn (Bacillus subtilis biểu hiện Streptavidin - gọi tắt là bào tử-strep) thông qua protein dung hợp CotB, sau đó liên kết với kháng thể kháng protein vỏ VP28 của virus WSSV đã được biotinyl hóa. Nghiên cứu được triển khai trong giai đoạn 2009-2011 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, kết hợp thu thập và kiểm chứng trên các mẫu tôm sú nhiễm bệnh thực tế từ các vùng nuôi trọng điểm tại tỉnh Bình Định và tỉnh Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi phát triển thành công phản ứng ngưng kết miễn dịch thụ động ngược sử dụng 30x10^8 bào tử mang kháng thể, cho phép phát hiện trực quan virus đốm trắng trong vòng 4 giờ với chi phí ước tính giảm hơn 70% so với các bộ kit thương mại nhập ngoại.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên sự tích hợp của ba nền tảng lý thuyết sinh học phân tử và miễn dịch học hiện đại:

Thứ nhất là hệ thống biểu hiện protein trên bề mặt bào tử vi khuẩn (Spore Surface Display). Bào tử Bacillus subtilis có cấu trúc nhiều lớp bền vững, trong đó lớp áo ngoài chứa hơn 20 loại polypeptide chuyên biệt. Nghiên cứu khai thác protein CotB (khối lượng phân tử 59 kDa) có đầu tận cùng C ưa nước chứa trình tự lặp lại 27 axit amin với hàm lượng serine chiếm hơn 50% làm chất mang neo giữ protein ngoại lai mà không cần qua quá trình chuyển dịch qua màng tế bào.

Thứ hai là nguyên lý tương tác phi hóa trị ái lực cao giữa Streptavidin và Biotin. Streptavidin là protein tetramer khối lượng 60 kDa tiết ra từ Streptomyces avidinii, có khả năng liên kết với phân tử Biotin (Vitamin H, khối lượng 244 Da) với hằng số phân ly siêu nhỏ đạt mức xấp xỉ 4x10^-14 mol/L. Đây là một trong những liên kết phi hóa trị bền vững nhất từng được ghi nhận, cho phép cố định bền vững các phân tử sinh học đã biotinyl hóa lên bề mặt bào tử.

Thứ ba là đặc tính sinh học của virus WSSV và nguyên lý ngưng kết miễn dịch thụ động ngược (RPLA). Virus WSSV thuộc chi Whispovirus, sở hữu bộ gen ADN mạch đôi kích thước 305 kb mã hóa 181 khung đọc mở (ORF). Trong đó, protein vỏ ngoài VP28 (khối lượng 27,5 kDa mã hóa bởi gen WSV421) đóng vai trò thụ thể gắn kết giúp virus xâm nhập tế bào ký chủ. Kháng thể đặc hiệu kháng VP28 khi được cố định trên hạt mang sinh học (bào tử-strep) sẽ liên kết chéo với các hạt virus trong dịch nghiền tôm, tạo thành mạng lưới ngưng kết có thể quan sát rõ bằng mắt thường.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu sinh học trong nghiên cứu bao gồm chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α dùng để nhân dòng, chủng Bacillus subtilis PY79 làm tế bào chủ biểu hiện, nguồn gen Streptavidin từ Streptomyces avidinii, vector tích hợp pDG364 và các mẫu tôm sú tự nhiên nhiễm bệnh đốm trắng.

Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu: Nghiên cứu thực hiện chọn mẫu có chủ đích trên 20 cá thể tôm sú có triệu chứng lâm sàng điển hình (xuất hiện đốm trắng đường kính 0,5 đến 2,0 mm ở giáp đầu ngực, thân chuyển màu đỏ) thu thập tại các đầm nuôi thuộc Chi cục Thú y tỉnh Bình Định và Chi cục Thú y tỉnh Sóc Trăng. Phương pháp chọn mẫu này bảo đảm thu thập được nguồn kháng nguyên virus thực địa có tải lượng cao phục vụ việc kiểm chứng độ nhạy.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích:

• Kỹ thuật điện di và Western Blot: Sử dụng màng nitrocellulose cùng kháng thể liên kết enzyme Horseradish Peroxidase (HRP) phát tín hiệu quang hóa ECL để kiểm tra chính xác sự biểu hiện đặc hiệu của protein dung hợp CotB-Streptavidin trên lớp áo bào tử.
• Kỹ thuật Real-time PCR: Ứng dụng chất phát huỳnh quang SYBR Green I trên hệ thống IQ5 Optical System để định lượng chuẩn xác số bản copy của virus WSSV (trong dải nồng độ từ 10^3 đến 10^7 copies/µl), đóng vai trò tiêu chuẩn vàng đối chứng để xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng ngưng kết.
• Phản ứng ngưng kết thụ động ngược: Thực hiện trên đĩa vi lượng 96 giếng kết hợp nhuộm màu bào tử bằng chất nhuộm huỳnh quang IC5-PE-Maleimide nhằm tăng độ tương phản quang học, tạo tiền đề xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh tại chỗ. Toàn bộ lộ trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ trong thời gian 24 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 kết quả thực nghiệm quan trọng mang tính đột phá:

Thứ nhất, nhân dòng và dung hợp thành công cấu trúc gen tái tổ hợp vào hệ gen vi khuẩn. Đoạn gen mã hóa cotB (kích thước 1,1 kb) và streptavidin (kích thước 0,55 kb) được khuếch đại thành công bằng PCR và ghép nối tuần tự vào vector chuyển gen pDG364 (kích thước 6,2 kb) để tạo vector hoàn chỉnh pDG364-cotB-streptavidin (kích thước 7,3 kb). Quá trình biến nạp vào tế bào Bacillus subtilis PY79 thông qua cơ chế trao đổi chéo kép tại locus amyE đạt hiệu quả cao, 100% khuẩn lạc tái tổ hợp được chọn lọc đều mất hoàn toàn hoạt tính phân giải tinh bột khi thử nghiệm với dung dịch iot 1%.

Thứ hai, biểu hiện đặc hiệu và ổn định của protein dung hợp CotB-Streptavidin trên vỏ bào tử. Kết quả thẩm tách miễn dịch Western Blot với kháng thể thỏ kháng Streptavidin đã xác nhận sự hiện diện của băng protein dung hợp CotB-Streptavidin ở vị trí khối lượng phân tử dự đoán khoảng 75 kDa. Bào tử tái tổ hợp duy trì khả năng liên kết ổn định với kháng thể sau hơn 60 ngày bảo quản ở nhiệt độ 4°C mà không suy giảm hoạt tính sinh học.

Thứ ba, tối ưu hóa hiệu suất gắn kháng thể kháng VP28 biotinyl hóa lên bề mặt bào tử-strep. Khảo sát gắn trên 30x10^8 bào tử-strep với các lượng kháng thể 10 µg, 50 µg và 100 µg cho thấy lượng kháng thể 50 µg mang lại hiệu suất hấp phụ bão hòa tối ưu, bảo đảm mật độ thụ thể đồng đều trên bề mặt bào tử để bắt giữ virus.

Thứ tư, xác lập giới hạn phát hiện nhạy bén của phản ứng ngưng kết. Phức hệ bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28 sau khi nhuộm màu IC5-PE-Maleimide đã hình thành phản ứng ngưng kết hạt màu xanh đặc hiệu với dịch chiết tôm nhiễm WSSV trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Khi đối chiếu với định lượng Real-time PCR, phản ứng ngưng kết phát hiện rõ ràng mẫu bệnh phẩm ở độ pha loãng 10^-3, tương đương ngưỡng phát hiện khoảng 10^4 bản copy virus/µl.

Thảo luận kết quả

Thành công của việc hiển thị Streptavidin trên vỏ bào tử vi khuẩn bắt nguồn từ việc bảo toàn cấu trúc bậc ba của miền liên kết Biotin khi dung hợp với đầu C của protein CotB. Khác với các hệ thống biểu hiện trên tế bào sinh dưỡng vốn dễ bị phân hủy protein do enzyme nội bào, lớp áo ngoài của bào tử tạo ra khung giá đỡ vô cùng bền vững trước tác động nhiệt và dung môi.

Khi so sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm sử dụng hạt nhựa polystyrene nhân tạo trong kỹ thuật RPLA phát hiện WSSV, việc sử dụng bào tử Bacillus subtilis giải quyết triệt để hiện tượng ngưng kết không đặc hiệu (dương tính giả) nhờ bề mặt bào tử đã được xử lý ức chế bằng BSA 1% và đệm glycine. Đồng thời, chi phí sản xuất sinh khối bào tử bằng phương pháp lên men DSM thấp hơn tới 80% so với việc tổng hợp và hoạt hóa hạt vi cầu latex nhân tạo.

Về phương thức trực quan hóa dữ liệu nghiên cứu, toàn bộ kết quả có thể được thể hiện trực quan qua biểu đồ đường biểu diễn động học hấp phụ kháng thể biotinyl hóa theo các nồng độ từ 10 đến 100 µg/ml; kết hợp bảng đối chiếu so sánh độ nhạy chẩn đoán giữa ba phương pháp: Real-time PCR (ngưỡng phát hiện 10^2 copies/µl, thời gian 4 giờ trong phòng thí nghiệm), que thử sắc ký miễn dịch (ngưỡng phát hiện 10^5 copies/µl, giá thành 10 USD) và phản ứng ngưng kết bào tử-strep (ngưỡng phát hiện 10^4 copies/µl, thời gian 4 giờ, chi phí ước tính dưới 2 USD).

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và đưa kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn sản xuất, bốn giải pháp trọng tâm được đề xuất như sau:

Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình lên men thu hồi bào tử tái tổ hợp ở quy mô pilot. Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein cùng các đơn vị phối hợp cần chuẩn hóa điều kiện lên men vi sinh trong nồi lên men dung tích 10 đến 50 lít, nâng mật độ sinh khối đạt trên 10^10 bào tử/ml và tỷ lệ tạo bào tử đạt trên 95% trong khung thời gian 6 đến 12 tháng.

Thứ hai, nghiên cứu rút ngắn thời gian phản ứng và chế tạo bộ kit ngưng kết dạng khô. Nhóm nghiên cứu kết hợp cùng các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế tiến hành đông khô phức hệ bào tử-strep gắn kháng thể trên các phiến nhựa vi lưu, cải tiến công thức đệm để rút ngắn thời gian xuất hiện ngưng kết từ 4 giờ xuống dưới 15 đến 30 phút, bảo đảm giá thành thương mại dưới 1,5 USD cho mỗi xét nghiệm trong vòng 12 tháng tới.

Thứ ba, mở rộng ứng dụng nền tảng bào tử CotB làm vaccine đường uống kích thích miễn dịch tôm. Các viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản cần tận dụng công nghệ biểu hiện bề mặt để sản xuất chế phẩm sinh học mang kháng nguyên VP28 trộn vào thức ăn tôm, hướng tới mục tiêu giảm tỷ lệ chết ở tôm khi phơi nhiễm WSSV từ mức 96,7% ở lô đối chứng xuống dưới 50% ở lô thử nghiệm trong thời gian 18 tháng.

Thứ tư, xây dựng quy chuẩn chẩn đoán lưu động tại các vùng nuôi thủy sản trọng điểm. Chi cục Thú y và Trung tâm Khuyến nông các tỉnh ven biển cần áp dụng thử nghiệm quy trình ngưng kết tại các trạm kiểm dịch giống cơ sở, kiểm soát 100% các lô tôm giống trước khi xuất bán trong lộ trình 24 tháng nhằm chủ động ngăn chặn dịch bệnh bùng phát.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chuyên môn:

Nhà nghiên cứu và chuyên gia công nghệ sinh học phân tử: Tài liệu cung cấp quy trình chi tiết về kỹ thuật tái tổ hợp gen, chiến lược tích hợp gen ngoại lai vào locus amyE của vi khuẩn Gram dương và phương pháp luận thiết kế hệ thống hiển thị bề mặt bào tử ứng dụng trong y sinh.

Kỹ sư R&D tại các công ty sản xuất sinh phẩm và kit chẩn đoán: Luận văn mở ra giải pháp công nghệ giá thể sinh học bền nhiệt thay thế hạt vi cầu tổng hợp, cung cấp thông số kỹ thuật tối ưu về phản ứng biotinyl hóa kháng thể và chuẩn hóa phản ứng ngưng kết miễn dịch thụ động ngược.

Cán bộ quản lý dịch bệnh thủy sản và kỹ thuật viên kiểm nghiệm: Cung cấp góc nhìn thực tiễn về công cụ xét nghiệm nhanh tại hiện trường, hỗ trợ xây dựng quy trình giám sát dịch bệnh đốm trắng tại các ao đầm nuôi tôm với chi phí tiết kiệm.

Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Sinh học: Nguồn tài liệu học thuật chuẩn mực, tích hợp đầy đủ các kỹ thuật sinh học hiện đại từ tạo dòng plasmid, Western Blotting, Real-time PCR định lượng huỳnh quang đến phân tích động học liên kết kháng nguyên - kháng thể.

Câu hỏi thường gặp

Bào tử Bacillus subtilis có ưu thế gì vượt trội so với hạt nhựa nhân tạo trong phản ứng ngưng kết? Bào tử Bacillus subtilis có kích thước đồng nhất khoảng 1,0 µm, sở hữu lớp vỏ protein đề kháng tự nhiên với nhiệt độ lên tới 90°C và các dung môi hóa học. Khác với hạt nhựa polystyrene dễ gây ngưng kết giả, bào tử sinh học duy trì liên kết ổn định sau 2 tháng bảo quản ở 4°C, an toàn sinh học và dễ dàng sản xuất sinh khối lớn với chi phí thấp.

Vì sao tương tác giữa Streptavidin và Biotin lại được lựa chọn làm cầu nối trung gian? Phức hệ Streptavidin - Biotin sở hữu hằng số phân ly siêu nhỏ đạt mức xấp xỉ 4x10^-14 mol/L, tạo nên liên kết phi hóa trị bền vững bậc nhất trong sinh học. Cơ chế này cho phép cố định định hướng mọi loại phân tử kháng thể hoặc enzyme đã được biotinyl hóa lên bề mặt bào tử mà hoàn toàn không làm biến tính hay suy giảm hoạt tính miễn dịch của protein đích.

Protein VP28 giữ vai trò then chốt như thế nào trong việc nhận diện virus đốm trắng? VP28 là protein cấu trúc vỏ ngoài phong phú nhất của virus WSSV với khối lượng 27,5 kDa, chịu trách nhiệm trực tiếp trong việc bám dính và xâm nhập vào tế bào mô tôm. Việc sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng VP28 giúp hệ thống bắt giữ chính xác các hạt virion nguyên vẹn trong mẫu bệnh phẩm ngay cả ở độ pha loãng 10^-3.

Phản ứng ngưng kết thụ động bằng bào tử-strep mất bao lâu để ghi nhận kết quả? Trên đĩa vi lượng 96 giếng, phản ứng ngưng kết hoàn thành rõ rệt sau 4 giờ ủ ở nhiệt độ phòng. Nhờ chất nhuộm màu IC5-PE-Maleimide, mẫu dương tính tạo thành mạng lưới ngưng kết màu xanh phủ rộng đáy giếng, trong khi mẫu âm tính lắng tụ thành điểm tủa tròn nhỏ, giúp người nuôi quan sát và đánh giá chính xác bằng mắt thường.

Hệ thống biểu hiện bề mặt bào tử-strep có thể mở rộng cho các mầm bệnh khác không? Hoàn toàn khả thi. Bào tử-strep đóng vai trò như một giá thể sinh học vạn năng. Khi thay đổi kháng thể biotinyl hóa gắn lên bề mặt, hệ thống có thể chuyển đổi nhanh chóng sang phát hiện các tác nhân gây bệnh nguy hiểm khác như virus cúm A/H5N1, virus dại hoặc vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm.

Kết luận

• Tạo dòng thành công vector pDG364-cotB-streptavidin (7,3 kb) và tích hợp ổn định vào hệ gen Bacillus subtilis PY79 tại vị trí amyE.
• Biểu hiện bền vững protein dung hợp CotB-Streptavidin (75 kDa) trên lớp vỏ ngoài của bào tử, duy trì hoạt tính sinh học sau hơn 60 ngày bảo quản ở 4°C.
• Biotinyl hóa và cố định tối ưu kháng thể kháng VP28 lên 30x10^8 bào tử-strep, bảo đảm khả năng bắt giữ đặc hiệu kháng nguyên virus đốm trắng.
• Phát triển thành công phản ứng ngưng kết thụ động ngược với ngưỡng phát hiện đạt 10^4 bản copy virus/µl trong thời gian 4 giờ, mở ra hướng đi sản xuất kit chẩn đoán WSSV giá rẻ tại hiện trường.
• Kế hoạch 12 đến 24 tháng tới cần tập trung nâng quy mô lên men pilot, tinh gọn quy trình xét nghiệm dạng khô và triển khai thử nghiệm diện rộng tại các vùng nuôi tôm trọng điểm. Quý độc giả và các đơn vị nghiên cứu quan tâm có thể khai thác trực tiếp dữ liệu luận văn để phát triển các giải pháp phòng trừ dịch bệnh thủy sản hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bào tử Bacillus subtilis là một trong những đối tƣợng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nhờ tính chất bền nhiệt, không độc hại, đặc biệt nhấ t là các công trình nghiên cứu về hệ thống biểu hiện protein trên bề mặt của bào tử. Hệ thống biểu hiện này sử dụng một protein của lớp áo bào tử làm yếu tố dung hơ ̣p, gắ n với mô ̣t protein ngoa ̣i lai nhằ m biể u hiê ̣n protein này trên bề mă ̣ t bào tử đó. Protein ngoa ̣i lai có thể là một kháng nguyên hay các protein làm đầ u dò v. Nhƣ̃ng ƣ́ng du ̣ng của hê ̣ thố ng này trải rô ̣ng trên nhiề u liñ h vƣ̣c , nổ i bâ ̣t nhấ t là tiề m năng ta ̣o ra thế hê ̣ vaccine mới có thể sƣ̉ du ̣ng qua đƣờng uố ng hay đƣờng mũi, hay ta ̣o ra các chấ t hoa ̣t hóa sinh ho ̣c, chấ t bám dính sinh ho ̣c v.

Streptavidin tƣ̀ lâu đã đƣơ ̣c con ngƣời biế t đế n trong rấ t nhiề u ƣ́ng du ̣ng quan tro ̣ng chủ yế u thuô ̣c liñ h vƣ̣c Hóa sinh học và Sinh y ho ̣c, liên quan đế n khả năng liên kế t đă ̣c biê ̣t của nó với biotin hoặc với các phân tử đã đƣợc biotinyl hóa. Bào tử Bacillus subtilis biể u hiê ̣n streptavidin trên bề mă ̣t (gọi tắt là bào tử- strep) hƣ́a he ̣n đem la ̣i nhi ều tiề m năng ƣ́n g du ̣ng. Bào tử-strep có thể đƣợc sử dụng nhƣ một chất mang “đa dụng” nhờ khả năng gắn với phân tử đƣợc biotinyl hóa với nhiều ƣu điểm nhƣ bền nhiệt, bền với các tác nhân lý hóa học, kích thƣớc đồng nhất cỡ micromet, hy vọng sẽ có khả năng “chuyên chở” các kháng nguyên của vi sinh vật, các enzyme, các kháng thể để phục vụ cho các mục đích phân tích hay ứng dụng khác nhau. Virus gây bệnh đốm trắng ở tôm (WSSV) là loại virus gây bệnh nghiêm trọng và phổ biến ở tôm nuôi, là nguyên nhân chủ yếu gây ra những tổn hại kinh tế lớn đối với ngành công nghiệp tôm trên toàn thế giới.

Hiện nay, chƣa có một biện pháp chữa trị hữu hiệu nào đối với bệnh bệnh do virus WSSV gây ra. Do vậy, phát hiện sớm virus gây bệnh đóng vai trò quan trọng và then chốt trong việc phòng ngừa bệnh do virus đốm trắng gây ra. Rất nhiều phƣơng pháp đã đƣợcsử dụng để phát hiện sự có mặt của WSSV tôm giống hay ao nuôi nhƣ PCR, hóa mô miễn dịch, que thử nhanh. Tuy nhiên những phƣơng pháp này chỉ phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm nên không thuận tiện cho việc xét nghiệm nhanh trên thực địa (nhƣ đầm, ao nuôi.

) đồng thời giá thành xét nghiệm cũng còn rất cao. Khóa 2009-2011 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Xuấ t phát tƣ̀ thƣ̣c tế đó , chúng tôi thực hiện đề tài “ Tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” với mục đích tạo bào tử-strep và gắn kết bào tử này với kháng thể kháng VP28 của virus gây bệnh đốm trắng đã đƣợc biotinyl hóa nhằm phát hiện sự có mặt của virus đốm trắng trong mẫu tôm thông qua phản ứng ngƣng kết. Cùng với phƣơng pháp sắc ký miễn dịch, đây là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm nhƣ thao tác đơn giản, dễ dàng, và có thể tiến hành ngay tại ruộng nuôi. Khóa 2009-2011 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Chƣơng I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ 1. Nội bào tử vi khuẩn Nội bào tử là một dạng sống đặc biệt của vi khuẩn, gặp ở một số vi khuẩn Gram dƣơng (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina.) cũng nhƣ Gram âm (Sporomusa), đƣợc hình thành khi môi trƣờng sống trở nên khắc nghiệt nhƣ thiếu dinh dƣỡng, nhiệt độ cao… Vì mỗi tế bào chỉ sinh ra một bào tử nên đây không phải là loại bào tử có chức năng sinh sản nhƣ ở nấm [1]. Nội bào tử có khả năng đề kháng cao với nhiệt độ (có thể lên tới 900C), với tia tử ngoại, tia gamma và các hóa chất diệt khuẩn cũng nhƣ với sự khô hạn. Trong thời kì nghỉ, bào tử của vi khuẩn không thể hiện bất cứ một hoạt động trao đổi chất nào.

Ngƣời ta gọi đó là trạng thái sống ẩn (cryptobiosis). Tuổi thọ của nội bào tử gần nhƣ vô hạn. Ngƣời ta đã phân lập đƣợc bào tử sống từ mật ong hóa thạch có tuổi 25 triệu năm và thậm chí từ một tinh thể muối 250 triệu năm tuổi. Do tính đề kháng cao nhƣ vậy nên nội bào tử có tầm quan trọng thực tiễn lớn trong các lĩnh vực vi sinh vật học thực phẩm, công nghiệp và y học.

Sử dụng bào tử trong nghiên cứu có nhiều thuận lợi. Thứ nhất là do tính bền và tính ổn định của nó nhƣ đã đƣợc đề cập ở trên. Thứ hai, độ an toàn của bào tử đã đƣợc chứng minh bởi trong thực tế, con ngƣời đã sử dụng rất nhiều loài nhƣ B. natto làm thành phần phụ gia hay trong các sản phẩm chữa trị các bệnh liên quan đến hệ tiêu hoá.

Một số sản phẩm làm từ bào tử đƣợc sản xuất rộng rãi ở phạm vi công nghiệp [10]. Hơn nữa, một thực thể phức tạp nhƣ vậy (ở B. subtilis có tới hơn 200 gen tham gia vào sự hình thành nội bào tử) mà có thể đƣợc tạo ra chỉ trong vài giờ (6-8 giờ ở đa số trƣờng hợp) theo một phƣơng thức chặt chẽ, sẽ rất thích hợp cho việc nghiên cứu để thiết kế các cấu trúc sinh học phức tạp. Hiện nay, bào tử đƣợc nghiên cứu chủ yếu thuộc hai chi Bacillus và Clostridium.

Clostridium sống kị khí và khi sinh bào tử, tế bào bị biến dạng thành hình thoi trong khi Bacillus sống hiếu khí và tế bào không bị biến dạng khi sinh bào tử [15]. Chính nhờ những ƣu điểm này mà Bacillus (hình 1) trở thành đối tƣợng nghiên cứu lý tƣởng hơn cả trong phòng thí nghiệm. Khóa 2009-2011 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y Hình 1: Hình ảnh hiển vi điện tử quét của bào tử Bacillus subtilis [22] 1. Bào tử Bacillus subtilis 1.

Cấu tạo nội bào tử B.subtilis Về hình dạng, bào tử trƣởng thành có hình cầu hoặc elip (hình 2), đƣờng kính khoảng 0. Hình 2: Hình dạng ngoài của nội bào tử B. subtilis [30] Về cấu tạo, nội bào tử có các lớp bao bọc sau đây (tính từ ngoài vào): ngoài cùng là một lớp vỏ ngoài (exosporium) mỏng, là các phần sót lại của tế bào mẹ, có thể có hoặc không. Tiếp đó là đến lớp áo bào tử (spore coat) dày khoảng 3 nm, chứa 3-15 lớp protein (chiếm 50-80% protein tổng số của bào tử), không thấm đối với nhiều phân tử chất độc, chịu trách nhiệm đối với tính kháng hóa chất của nội bào tử.

Các nghiên cứu còn cho thấy áo bào tử chứa một số enzyme tham gia vào sự nảy mầm của bào tử. Nằm dƣới áo bào tử là lớp vỏ (cortex), chiếm 36-60% thể tích của nội bào tử, đƣợc cấu tạo từ peptidoglican nhƣng chứa ít liên kết chéo hơn so với tế bào dinh dƣỡng. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ này lên tới 20 atm, lƣợng nƣớc là 70% (lƣợng nƣớc của tế bào dinh dƣỡng là 80%), cao hơn nhiều so với lƣợng nƣớc trung bình trong bào tử (khoảng 40%). Cuối cùng là thành bào tử (hay thành của Khóa 2009-2011 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y lõi- spore wall) bao quanh thể sinh chất hay lõi (core).

Lõi chứa các cấu trúc thông thƣờng của tế bào nhƣ các ribosome và một thể nhân, nhƣng không hoạt động về mặt trao đổi chất (hình 3). Hình 3: Cấu tạo nội bào tử B. IC (Inner coat): lớp áo trong. OC (outer coat): lớp áo ngoài.

Cx (cortex): lớp vỏ. gap: khoảng trống giữa lớp áo trong với lớp vỏ. Cl: khối bắt màu tối chƣa rõ thành phần cấu tạo [8]. Cho đến nay ngƣời ta còn chƣa biết chính xác tại sao nội bào tử có tính kháng nhiệt và kháng các tác nhân gây chết khác cao đến nhƣ vậy.

15% trọng lƣợng khô của nội bào tử là axit dipicolinic đƣợc kết hợp với các ion canxi. Vai trò chính xác của axit dipicolinic còn chƣa đƣợc biết rõ, song canxi trợ giúp tính đề kháng với nhiệt độ, độ ẩm, các tác nhân oxy hóa, và đôi khi, có thể dipicolinat canxi làm bền các axit nucleic của bào tử. Gần đây ngƣời ta tìm thấy trong nội bào tử một loại protein hòa tan trong axit có khối lƣợng phân tử thấp liên kết với ADN. Nó bão hòa ADN của bào tử và bảo vệ ADN chống lại sức nóng, các bức xạ, sự khô hạn và hóa chất.

Hàm lƣợng nƣớc thấp (10-30% so với tế bào dinh dƣỡng) của thể sinh chất (lõi) giữ vai trò quan trọng trong tính đề kháng với nhiệt, trong khi đó chúng ta biết rằng nhiệt độ phá hủy tế bào bằng cách làm bất hoạt ADN và protein, và quá trình này đòi hỏi một lƣợng nƣớc nhất định trong thể sinh chất. Áo bào tử hình nhƣ cũng bảo vệ chống lại các enzyme và hóa chất nhƣ H2O2. Cuối cùng, bào tử chứa một số Khóa 2009-2011 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y enzyme sửa chữa ADN. ADN sẽ đƣợc sửa chữa trong quá trình nảy mầm và tăng trƣởng sau khi lõi đã đƣợc hoạt hóa trở lại.

Sự hình thành bào tử thƣờng xảy ra khi trong môi trƣờng thiếu chất dinh dƣỡng, đặc biệt là thiếu nguồn cacbon hay nitơ hay có sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại. Về mặt hình thái, có thể chia quá trình này thành các giai đoạn [2] (hình 6): - Hình thành những búi chất nhiễm sắc. - Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử. - Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ.

- Lớp áo sơ khai hình thành giữa 2 lớp màng sau khi đã tích lũy nhiều peptidoglycan và tổng hợp axit dipicolinic và tích lũy canxi. - Kết thúc hình thành áo bào tử. Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài.