Luận văn thạc sĩ: Tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus đốm trắng ở tôm

• Tác giả: Bùi Thu Thủy
• Người hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Vân Anh
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
• 1.1.1. Nội bào tử vi khuẩn
• 1.1.2. Bào tử Bacillus subtilis
• 1.1.3. Giới thiệu chung về streptavidin
• 1.1.4. Cấu trúc của streptavidin
• 1.1.5. Cấu tạo của biotin. Tương tác streptavidin-biotin
• 1.1.6. Thiết kế trạng thái đơn hóa trị của streptavidin với một vị trí gắn biotin duy nhất
• 1.2. VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM
• 1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh đốm trắng ở tôm và virus gây bệnh đốm trắng
• 1.2.2. Protein vỏ VP28 của virus WSSV
• 1.2.3. Các phương pháp phát hiện virus gây bệnh đốm trắng ở tôm
• 1.2.4. subtilis biểu hiện streptavidin trên bề mặt (bào tử-strep) và ứng dụng
• 1.3. PHẢN ỨNG NGỪNG KẾT MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG
• 2. CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Chủng vi khuẩn
• 2.2. Mẫu tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng
• 2.3. Các nguyên liệu khác
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP
• 2.4.1. Tách chiết ADN hệ gen từ vi khuẩn Gram dương
• 2.4.2. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn
• 2.4.3. Tách chiết ADN hệ gen của virus từ mẫu tôm nhiễm WSSV
• 2.4.4. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR
• 2.4.5. Nhân dòng các đoạn gen đích vào vector pCR
• 2.4.6. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α
• 2.4.7. Xử lý plasmid bằng các cặp enzyme giới hạn. Phản ứng gắn đoạn gen đích (insert) vào vector bằng T4 ADN ligase. Dung hợp đoạn gen đích vào ADN hệ gen của Bacillus subtilis chủng PY79. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích trong ADN hệ gen của B.
• 2.4.8. Nuôi cấy tạo bào tử
• 2.4.9. Kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp bằng phương pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting)
• 2.4.10. Biotinyl hóa kháng thể kháng VP28
• 2.4.11. Gắn kháng thể kháng VP28 đã được biotinyl hóa lên trên bào tử-strep
• 2.4.12. Nhuộm màu bào tử-strep đã gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl
• 2.4.13. Thu dịch nghiền có chứa virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm sú nhiễm bệnh
• 2.4.14. Phản ứng ngưng kết thụ động ngược (Reverse passive latex agglutination)
• 2.4.15. Định lượng số bản copies của WSSV bằng kỹ thuật PCR đúng thời điểm (Realtime PCR)
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN STREPTAVIDIN VÀO VECTOR PDG364 COTB VÀ DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B.
• 3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa cotB và streptavidin bằng phương pháp PCR
• 3.1.2. Để thu được lượng lớn đoạn gen mã hóa cho streptavidin từ nguồn ADN hệ gen của Streptomyces avidinii và cotB từ ADN hệ gen của B. subtilis chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt cho từng đoạn gen như sau:
• 3.1.3. Nhân dòng đoạn gen cotB vào vector pDG364
• 3.1.4. Nhân dòng đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB
• 3.1.5. Đưa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin trên vector vào hệ gen B.
• 3.2. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP COTB- STREPTAVIDIN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ B.
• 3.2.1. Kiểm tra khả năng tạo bào tử của tế bào B. subtilis tái tổ hợp
• 3.2.2. Kiểm tra biểu hiện của cotB-streptavidin trên bào tử bằng phương pháp thẩm tách miễn dịch
• 3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ LIÊN KẾT CỦA BÀO TỬ-STREP VỚI KHÁNG THỂ KHÁNG VP28-BIOTINYL
• 3.3.1. Đánh giá mức độ liên kết của bào tử-strep với kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl
• 3.3.2. Đánh giá hằng số phân ly của phức hệ bào tử-strep- kháng thể kháng VP28-biotinyl
• 3.4. PHẢN ỨNG NGỪNG KẾT MIỄN DỊCH THỤ ĐỘNG KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM WSSV
• 3.4.1. Xác định nồng độ virus trong dịch nghiền bằng Realtime PCR
• 3.4.2. Đánh giá khả năng hình thành ngưng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28-biotinyl với dịch nghiền tôm nhiễm WSSV
• 3.4.3. Đánh giá khả năng hình thành phản ứng ngưng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl với các nồng độ virus pha loãng
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về nghiên cứu bào tử Bacillus subtilis và streptavidin

Nghiên cứu về bào tử Bacillus subtilis và khả năng biểu hiện streptavidin trên bề mặt bào tử đã thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học. Bào tử Bacillus subtilis được biết đến với khả năng chịu nhiệt và tính an toàn cao, làm cho chúng trở thành một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu sinh học. Việc biểu hiện streptavidin trên bề mặt bào tử mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học.

1.1. Bào tử Bacillus subtilis Đặc điểm và ứng dụng

Bào tử Bacillus subtilis có khả năng chịu đựng môi trường khắc nghiệt, giúp chúng tồn tại lâu dài. Chúng được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm nhờ vào tính an toàn và hiệu quả của chúng trong việc cải thiện sức khỏe cây trồng và động vật.

1.2. Streptavidin Tính chất và vai trò trong nghiên cứu

Streptavidin là một protein có khả năng liên kết mạnh mẽ với biotin, tạo điều kiện cho việc phát hiện và phân tích các phân tử sinh học. Sự kết hợp giữa streptavidin và bào tử Bacillus subtilis mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp phát hiện virus hiệu quả.

II. Thách thức trong việc phát hiện virus đốm trắng ở tôm

Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) là một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với ngành nuôi tôm. Việc phát hiện sớm virus này là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan và thiệt hại kinh tế. Tuy nhiên, các phương pháp hiện tại như PCR và hóa mô miễn dịch thường yêu cầu điều kiện phòng thí nghiệm, không thuận tiện cho việc sử dụng thực địa.

2.1. Tác động của virus đốm trắng đến ngành nuôi tôm

Virus WSSV gây ra thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm, ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng tôm nuôi. Việc phát hiện sớm virus là cần thiết để có biện pháp phòng ngừa kịp thời.

2.2. Hạn chế của các phương pháp phát hiện hiện tại

Các phương pháp phát hiện virus hiện tại thường tốn kém và yêu cầu thiết bị phức tạp, không phù hợp cho việc sử dụng tại các trang trại nuôi tôm. Do đó, cần phát triển các phương pháp đơn giản và hiệu quả hơn.

III. Phương pháp tạo bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin

Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo ra bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn với kháng thể biotinyl hóa. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện virus mà còn có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y học và công nghệ sinh học.

3.1. Quy trình tạo bào tử và biểu hiện protein

Quy trình tạo bào tử bao gồm các bước như nuôi cấy vi khuẩn, tách chiết ADN và biến nạp gen vào bào tử. Việc biểu hiện streptavidin trên bề mặt bào tử được thực hiện thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến.

3.2. Gắn kháng thể biotinyl hóa lên bào tử strep

Kháng thể biotinyl hóa được gắn lên bề mặt bào tử-strep, tạo thành một phức hợp có khả năng phát hiện virus WSSV. Phương pháp này hứa hẹn mang lại hiệu quả cao trong việc phát hiện virus trong mẫu tôm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin có khả năng gắn kết với kháng thể biotinyl hóa, từ đó phát hiện virus WSSV trong mẫu tôm. Phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản.

4.1. Đánh giá hiệu quả của bào tử strep trong phát hiện virus

Các thí nghiệm cho thấy bào tử-strep có khả năng phát hiện virus WSSV với độ nhạy và độ chính xác cao. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các bộ kit phát hiện virus đơn giản và hiệu quả.

4.2. Ứng dụng trong ngành nuôi trồng thủy sản

Phương pháp phát hiện virus mới này có thể được áp dụng trực tiếp tại các trang trại nuôi tôm, giúp nông dân phát hiện sớm và có biện pháp phòng ngừa kịp thời, từ đó giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

V. Kết luận và hướng nghiên cứu tương lai

Nghiên cứu về bào tử Bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus đốm trắng ở tôm đã mở ra nhiều triển vọng mới trong việc phát hiện virus. Hướng nghiên cứu tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng của phương pháp này.

5.1. Tương lai của nghiên cứu bào tử Bacillus subtilis

Nghiên cứu có thể mở rộng sang việc phát triển các loại bào tử khác có khả năng biểu hiện các protein khác nhau, từ đó tạo ra các sản phẩm sinh học đa dạng hơn.

5.2. Hướng đi mới trong phát hiện virus

Phát triển các bộ kit phát hiện virus dựa trên bào tử-strep có thể giúp cải thiện khả năng phát hiện virus trong thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả quản lý dịch bệnh trong ngành nuôi trồng thủy sản.