Luận văn thạc sĩ về aptamer đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 tại Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn escherichia coli o157h7, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp cải thiện thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Thủy
• Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo aptamer cho E. coli O157:H7
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về Escherichia coli O157:H7
• 1.2. Giới thiệu chung về E. coli O157:H7
• 1.3. Đặc tính của E. coli O157:H7
• 1.4. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7
• 1.5. Tình hình nghiên cứu E. coli O157:H7 trong và ngoài nước
• 1.6. Giới thiệu chung về aptamer
• 1.7. Ưu điểm của aptamer so với kháng thể
• 1.8. Phương pháp làm giàu phát triển hệ thống phối tử cấp số mũ (SELEX) sàng lọc aptamer
• 1.9. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng aptamer
• 1.10. Hạt nano vàng
• 1.11. Chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng vi vật và plasmid
• 2.2. Môi trường và dung dịch
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
• 2.5. Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu E.
• 2.6. Phương pháp PCR
• 2.7. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.8. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.9. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng
• 2.10. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.
• 2.11. Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E.
• 2.12. Phương pháp giải trình tự acid nucleic tự động
• 2.13. Phương pháp tạo phức hệ aptamer – hạt nano vàng
• 2.14. Phương pháp lai Dot blot
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
• 3.1. Kết quả sàng lọc aptamer đặc hiệu vi khuẩn E.
• 3.2. Chuẩn bị thư viện
• 3.3. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết E.
• 3.4. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E.
• 3.5. Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E.
• 3.6. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR
• 3.7. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.
• 3.8. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E.
• 3.9. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E.
• 3.10. Kết quả xác định sự liên kết của phức hợp aptamer - hạt nano vàng với E.
• 3.11. Xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E.
• 3.12. Kết quả xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E.
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tạo aptamer cho E

Nghiên cứu về aptamer cho E. coli O157:H7 đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học và an toàn thực phẩm. E. coli O157:H7 là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng nhất, với khả năng gây ra các triệu chứng nguy hiểm như tiêu chảy xuất huyết và hội chứng tan huyết. Việc phát triển aptamer đặc hiệu có thể giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác vi khuẩn này trong thực phẩm và môi trường. Aptamer là các phân tử oligonucleic có khả năng liên kết với các phân tử đích, mang lại nhiều lợi ích so với kháng thể truyền thống.

1.1. Đặc điểm của E. coli O157 H7 và tầm quan trọng của nghiên cứu

E. coli O157:H7 là một loại vi khuẩn Gram âm, có khả năng gây ra các bệnh lý nghiêm trọng. Vi khuẩn này có thể tồn tại trong thực phẩm và nước, gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm lớn. Nghiên cứu về aptamer giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi khuẩn này, từ đó giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm.

1.2. Aptamer và ứng dụng trong phát hiện E. coli O157 H7

Aptamer có khả năng nhận biết đặc hiệu với các phân tử đích, bao gồm cả vi khuẩn. Chúng có thể được sử dụng trong các phương pháp phát hiện nhanh, nhờ vào khả năng liên kết mạnh mẽ với E. coli O157:H7. Việc sử dụng aptamer trong chẩn đoán giúp cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu so với các phương pháp truyền thống.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu E

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về E. coli O157:H7, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc phát hiện và phân lập vi khuẩn này. Các phương pháp hiện tại thường tốn thời gian và yêu cầu thiết bị phức tạp. Việc phát triển aptamer có thể giúp giải quyết những vấn đề này, nhưng cũng đặt ra nhiều thách thức trong quá trình sàng lọc và tối ưu hóa.

2.1. Thách thức trong việc phát hiện E. coli O157 H7

Việc phát hiện E. coli O157:H7 gặp khó khăn do vi khuẩn này có thể tồn tại trong môi trường với số lượng rất thấp. Các phương pháp hiện tại như nuôi cấy vi khuẩn thường mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao. Do đó, cần có các phương pháp mới như aptamer để cải thiện khả năng phát hiện.

2.2. Khó khăn trong việc phát triển aptamer đặc hiệu

Quá trình phát triển aptamer đặc hiệu cho E. coli O157:H7 đòi hỏi nhiều bước phức tạp, từ việc sàng lọc đến tối ưu hóa. Các yếu tố như độ ổn định và khả năng liên kết của aptamer cũng cần được xem xét kỹ lưỡng để đảm bảo hiệu quả trong ứng dụng thực tiễn.

III. Phương pháp tạo aptamer cho E

Phương pháp sàng lọc aptamer cho E. coli O157:H7 thường sử dụng kỹ thuật SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Kỹ thuật này cho phép tạo ra các aptamer có khả năng liên kết mạnh mẽ với vi khuẩn mục tiêu. SELEX bao gồm nhiều bước, từ việc tạo thư viện aptamer đến việc sàng lọc và tối ưu hóa các aptamer có khả năng nhận biết tốt nhất.

3.1. Quy trình SELEX trong phát triển aptamer

Quy trình SELEX bao gồm việc tạo ra một thư viện ssDNA ngẫu nhiên, sau đó tiến hành sàng lọc để tìm ra các aptamer có khả năng liên kết với E. coli O157:H7. Các aptamer này sẽ được nhân bản và tối ưu hóa để cải thiện khả năng nhận biết.

3.2. Tối ưu hóa aptamer sau sàng lọc

Sau khi sàng lọc, các aptamer cần được tối ưu hóa để tăng cường khả năng liên kết và độ ổn định. Việc này có thể bao gồm việc thay đổi cấu trúc của aptamer hoặc điều chỉnh điều kiện phản ứng để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của aptamer trong phát hiện E

Aptamer có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y học và an toàn thực phẩm. Việc phát triển aptamer cho E. coli O157:H7 không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng vi khuẩn mà còn có thể được sử dụng trong các cảm biến sinh học để theo dõi sự hiện diện của vi khuẩn trong thực phẩm và môi trường.

4.1. Ứng dụng trong chẩn đoán y học

Aptamer có thể được sử dụng trong các xét nghiệm chẩn đoán để phát hiện E. coli O157:H7 trong mẫu bệnh phẩm. Điều này giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời và chính xác hơn.

4.2. Ứng dụng trong an toàn thực phẩm

Trong lĩnh vực an toàn thực phẩm, aptamer có thể được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của E. coli O157:H7 trong thực phẩm, từ đó giúp ngăn ngừa ngộ độc thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu aptamer cho E

Nghiên cứu về aptamer cho E. coli O157:H7 đang mở ra nhiều triển vọng mới trong việc phát hiện và kiểm soát vi khuẩn này. Với những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống, aptamer hứa hẹn sẽ trở thành công cụ quan trọng trong y học và an toàn thực phẩm. Tương lai của nghiên cứu này sẽ phụ thuộc vào việc phát triển các phương pháp sàng lọc và tối ưu hóa hiệu quả hơn.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về aptamer cho E. coli O157:H7 sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các phương pháp phát hiện nhanh chóng và chính xác hơn. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của aptamer.

5.2. Tích hợp công nghệ mới vào nghiên cứu

Việc tích hợp các công nghệ mới như công nghệ nano và cảm biến sinh học vào nghiên cứu aptamer có thể giúp nâng cao hiệu quả phát hiện và mở rộng ứng dụng của aptamer trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) là một vấn đề nghiêm trọng toàn cầu, gây ra các bệnh lý tiêu chảy xuất huyết, viêm đại tràng và hội chứng huyết niệu tan huyết (HUS) với tỷ lệ tử vong đáng kể. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lương thế giới (FAO), tỷ lệ nhiễm E. coli O157:H7 dao động từ 1,3 đến 22 người trên 100.000 dân tại các khu vực như Liên minh Châu Âu, Mỹ, Australia và Argentina. Ở Việt Nam, năm 2013 ghi nhận khoảng 5.200 trường hợp ngộ độc thực phẩm liên quan đến vi khuẩn này. E. coli O157:H7 có liều gây độc rất thấp (10–100 tế bào), khả năng sinh độc tố Shiga mạnh, tốc độ lây lan nhanh và tỷ lệ biến chứng suy thận cao, đặc biệt ở trẻ em với khoảng 15% trẻ bị nhiễm và 5% tử vong.

Mục tiêu nghiên cứu là tạo ra aptamer đặc hiệu nhận biết vi khuẩn E. coli O157:H7 nhằm phát triển phương pháp phát hiện nhanh, chính xác và tiết kiệm chi phí. Nghiên cứu tập trung xây dựng thư viện ssDNA, sàng lọc aptamer liên kết đặc hiệu với vi khuẩn và xác định trình tự aptamer. Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2013. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công cụ sinh học phân tử ứng dụng trong kiểm soát an toàn thực phẩm và phòng chống dịch bệnh do E. coli O157:H7 gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Đặc tính sinh học và cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7: Vi khuẩn Gram âm, có khả năng sinh độc tố Shiga (Stx1, Stx2) gây tổn thương tế bào biểu mô ruột và thận, dẫn đến tiêu chảy xuất huyết và hội chứng HUS. Vi khuẩn có khả năng tồn tại trong môi trường khắc nghiệt với pH từ 2,5 đến 9,0 và nhiệt độ từ 8°C đến 46°C.

• Aptamer và phương pháp SELEX: Aptamer là các phân tử acid nucleic hoặc peptide có khả năng liên kết đặc hiệu với phân tử đích nhờ cấu trúc không gian ba chiều. Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) được sử dụng để sàng lọc aptamer từ thư viện ssDNA đa dạng khoảng 10^15 phân tử, qua nhiều vòng chọn lọc và khuếch đại PCR nhằm thu nhận aptamer có ái lực cao với vi khuẩn đích.

• Ứng dụng hạt nano vàng và kỹ thuật sinh học phân tử: Hạt nano vàng được sử dụng để tạo phức hợp với aptamer nhằm tăng độ nhạy và đặc hiệu trong phát hiện vi khuẩn. Kỹ thuật PCR, điện di gel agarose, biến nạp plasmid, tách chiết DNA plasmid và giải trình tự tự động được áp dụng để nhân bản, tinh sạch và xác định trình tự aptamer.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 ATCC 43895 được nuôi cấy trong môi trường LB, sử dụng thư viện ssDNA tổng hợp với vùng ngẫu nhiên 36 nucleotit làm nguyên liệu sàng lọc aptamer.

• Phương pháp phân tích: Thực hiện 8 vòng sàng lọc SELEX với vi khuẩn đích và 1 vòng loại trừ với E. coli thường nhằm tăng tính đặc hiệu. Sản phẩm PCR được xử lý enzyme lambda exonuclease để tạo ssDNA, sau đó ủ với vi khuẩn, ly tâm loại bỏ ssDNA không liên kết, rửa và giải hấp aptamer liên kết. Nồng độ aptamer được đo bằng máy NanoDrop để theo dõi quá trình làm giàu. Các aptamer thu nhận được được tách dòng vào vector pCR2.1, biến nạp vào tế bào E. coli DH5α, tách chiết plasmid và giải trình tự xác định trình tự aptamer đặc hiệu.

• Timeline nghiên cứu: Quá trình thực hiện kéo dài trong năm 2013, bao gồm chuẩn bị mẫu, sàng lọc aptamer, nhân bản, tách dòng và phân tích trình tự.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Sàng lọc aptamer đặc hiệu: Qua 8 vòng sàng lọc SELEX, tỷ lệ aptamer liên kết đặc hiệu với E. coli O157:H7 đạt khoảng 55% so với thư viện ban đầu, cho thấy quá trình làm giàu aptamer thành công. Nồng độ aptamer thu nhận tăng dần qua các vòng, minh chứng bằng số liệu đo trên máy NanoDrop.

2. Tách dòng và nhân bản aptamer: Sản phẩm PCR sau sàng lọc được gắn vào vector pCR2.1 và biến nạp thành công vào tế bào E. coli DH5α, với hiệu suất biến nạp cao, cho phép nhân bản aptamer với số lượng lớn phục vụ giải trình tự.

3. Xác định trình tự aptamer: Giải trình tự tự động cho thấy aptamer ssDNA có cấu trúc bậc hai đặc trưng, phù hợp với khả năng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7. Phân tích so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu gen cho thấy aptamer không trùng lặp với các trình tự đã biết, khẳng định tính mới và đặc hiệu.

4. Phức hợp aptamer – hạt nano vàng: Kết quả Dot blot và hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) xác nhận sự liên kết ổn định giữa aptamer và hạt nano vàng, tạo thành phức hợp có khả năng nhận biết vi khuẩn với độ nhạy cao.

Thảo luận kết quả

Quá trình sàng lọc aptamer theo phương pháp SELEX đã thành công trong việc thu nhận các phân tử ssDNA có ái lực cao và đặc hiệu với vi khuẩn E. coli O157:H7, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về aptamer nhận biết vi khuẩn. Việc sử dụng enzyme lambda exonuclease để tạo ssDNA giúp aptamer duy trì cấu trúc không gian cần thiết cho liên kết đặc hiệu. Kết quả nhân bản và tách dòng aptamer cho thấy quy trình kỹ thuật sinh học phân tử được thực hiện hiệu quả, đảm bảo chất lượng mẫu cho giải trình tự.

Phức hợp aptamer – hạt nano vàng tăng cường khả năng phát hiện nhờ hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt của hạt nano, phù hợp với các ứng dụng cảm biến sinh học hiện đại. So sánh với các phương pháp phát hiện truyền thống như PCR multiplex hay ELISA, aptamer mang lại ưu điểm về độ nhạy, tính đặc hiệu và chi phí thấp hơn.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tăng nồng độ aptamer qua các vòng sàng lọc, bảng so sánh hiệu suất biến nạp plasmid và hình ảnh TEM minh họa phức hợp aptamer – hạt nano vàng, giúp trực quan hóa kết quả nghiên cứu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển kit phát hiện nhanh E. coli O157:H7 dựa trên aptamer: Thiết kế và sản xuất kit thử nghiệm sử dụng phức hợp aptamer – hạt nano vàng nhằm phát hiện vi khuẩn trong thực phẩm và môi trường, mục tiêu giảm thời gian phát hiện xuống dưới 2 giờ, thực hiện trong vòng 1-2 năm, do các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học phối hợp thực hiện.

2. Ứng dụng aptamer trong giám sát an toàn thực phẩm: Áp dụng aptamer trong các chương trình kiểm tra định kỳ tại các cơ sở chế biến thực phẩm, nhằm nâng cao độ chính xác và giảm chi phí so với phương pháp PCR truyền thống, triển khai trong 3 năm tới, do cơ quan quản lý an toàn thực phẩm chủ trì.

3. Nâng cao năng lực nghiên cứu và đào tạo: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật SELEX, PCR và công nghệ nano cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên, nhằm mở rộng ứng dụng aptamer trong các lĩnh vực khác, thực hiện liên tục hàng năm tại các trường đại học và viện nghiên cứu.

4. Mở rộng nghiên cứu aptamer đặc hiệu cho các vi khuẩn gây bệnh khác: Khuyến khích nghiên cứu tạo aptamer nhận biết các tác nhân gây bệnh nguy hiểm khác như Salmonella spp., Listeria monocytogenes, nhằm đa dạng hóa công cụ phát hiện sinh học, thực hiện trong 5 năm, do các nhóm nghiên cứu chuyên ngành vi sinh và công nghệ sinh học đảm nhận.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành vi sinh vật học, công nghệ sinh học: Nghiên cứu về aptamer và ứng dụng trong phát hiện vi khuẩn, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng thực nghiệm.

2. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và y tế công cộng: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển các phương pháp giám sát nhanh, chính xác nhằm phòng chống ngộ độc thực phẩm do E. coli O157:H7.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và sản xuất kit xét nghiệm: Tham khảo quy trình sàng lọc aptamer và kỹ thuật tạo phức hợp với hạt nano vàng để phát triển sản phẩm thương mại.

4. Bệnh viện và phòng xét nghiệm lâm sàng: Ứng dụng aptamer trong chẩn đoán nhanh các trường hợp nhiễm E. coli O157:H7, hỗ trợ điều trị kịp thời và hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

1. Aptamer là gì và ưu điểm so với kháng thể?
   Aptamer là các phân tử acid nucleic hoặc peptide có khả năng liên kết đặc hiệu với phân tử đích nhờ cấu trúc ba chiều. Ưu điểm của aptamer gồm dễ tổng hợp, chi phí thấp, ổn định trong môi trường khác nhau, khả năng biến tính thuận nghịch và có thể liên kết với các phân tử không có tính miễn dịch, vượt trội hơn kháng thể trong nhiều ứng dụng.

2. Phương pháp SELEX hoạt động như thế nào?
   SELEX là quy trình sàng lọc aptamer từ thư viện ssDNA đa dạng bằng cách ủ với phân tử đích, tách các aptamer liên kết đặc hiệu, khuếch đại bằng PCR và lặp lại nhiều vòng để làm giàu aptamer có ái lực cao. Quá trình này giúp thu nhận aptamer đặc hiệu với mục tiêu nghiên cứu.

3. Tại sao sử dụng hạt nano vàng trong nghiên cứu aptamer?
   Hạt nano vàng có tính chất quang học đặc biệt nhờ hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt, giúp tăng độ nhạy và tín hiệu phát hiện khi gắn với aptamer. Phức hợp aptamer – hạt nano vàng được ứng dụng trong cảm biến sinh học để phát hiện vi khuẩn với độ chính xác cao.

4. Nghiên cứu này có thể ứng dụng thực tế như thế nào?
   Kết quả nghiên cứu có thể phát triển thành các kit phát hiện nhanh E. coli O157:H7 trong thực phẩm và môi trường, giúp kiểm soát an toàn thực phẩm hiệu quả, giảm thiểu nguy cơ ngộ độc và dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra.

5. Khó khăn chính trong việc phát hiện E. coli O157:H7 là gì?
   Vi khuẩn có liều gây độc thấp, khả năng tồn tại trong môi trường khắc nghiệt và sinh độc tố mạnh khiến việc phát hiện truyền thống mất nhiều thời gian, đòi hỏi thiết bị hiện đại và chuyên môn cao. Aptamer giúp khắc phục những hạn chế này bằng phương pháp phát hiện nhanh, đặc hiệu và chi phí hợp lý.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình sàng lọc aptamer đặc hiệu nhận biết vi khuẩn E. coli O157:H7 với độ đặc hiệu cao, đạt tỷ lệ liên kết khoảng 55% sau 8 vòng SELEX.
• Phương pháp PCR, biến nạp plasmid và giải trình tự được áp dụng hiệu quả để nhân bản và xác định trình tự aptamer.
• Phức hợp aptamer – hạt nano vàng được tạo thành ổn định, mở ra hướng ứng dụng trong phát hiện sinh học.
• Nghiên cứu góp phần phát triển công cụ sinh học phân tử mới, hỗ trợ kiểm soát an toàn thực phẩm và phòng chống ngộ độc do E. coli O157:H7.
• Đề xuất tiếp tục phát triển kit phát hiện nhanh và mở rộng nghiên cứu aptamer cho các tác nhân gây bệnh khác trong vòng 1-5 năm tới.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu, cơ quan quản lý và doanh nghiệp công nghệ sinh học hợp tác để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn, nâng cao hiệu quả phòng chống dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là vấn đề rất đƣợc quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là vi sinh vật, thƣờng gặp nhƣ Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp. Trong đó, vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm và thƣờng gặp nhất là E.

Theo báo cáo số 18 năm 2011 trong chuỗi báo cáo đánh giá nguy cơ nhiễm vi sinh vật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO) đã thống kê tỉ lệ ngƣời nhiễm E.000 dân: Tại Liên minh Châu Âu 1,3 ngƣời; tại Mỹ 1,9 ngƣời; tại Newzeland và Australia 2 ngƣời; tại Argentina 22 ngƣời. coli O157:H7 thuộc loài E. coli gây xuất huyết ruột (EHEC - Enterohaemorrhagic E. coli), sinh độc tố Shiga.

coli O157:H7 là đối tƣợng gây ngộ độc thực phẩm cực kỳ nguy hiểm trên phạm vi toàn cầu. Chúng gây tiêu chảy phân máu, viêm đại tràng xuất huyết. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể dẫn tới thủng ruột. Độc tố Shiga còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu, suy thận (HUS - haemorrhagic uremic syndrome) dẫn tới tử vong.

coli O157:H7 là tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhƣng dễ dàng bị lây nhiễm ở nhiều thực phẩm thiết yếu nhƣ nƣớc, rau, thịt sống, thịt chƣa nấu kỹ…Mối nguy E. coli O157:H7 rất lớn do chủng này có liều gây độc thấp (10 – 100 tế bào), gây dịch tiêu chảy, tốc độ lây lan nhanh, sinh độc tố Shiga, tỷ lệ gây tan huyết và suy thận cao, dẫn tới tử vong. Hàng năm, khoảng 15% trẻ em và một tỷ lệ thấp hơn ngƣời lớn nhiễm E. coli O157:H7 và dẫn tới hội chứng tán huyết, suy thận, trong đó 50% số bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong.

Kể từ khi đƣợc xác định năm 1982 tại Hoa Kỳ, E. coli O157:H7 đã trở thành mầm bệnh quan trọng nhất trong nhóm các bệnh lây lan qua thực phẩm tại Hoa Kỳ cũng nhƣ các nƣớc đã phát triển ở Châu Âu và Nhật Bản. Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An toàn thực phẩm – Bộ Y tế: Năm 2013 có 5.200 trƣờng hợp bị ngộ độc. coli là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm quan trọng nên rất đƣợc quan tâm nghiên cứu.

Tuy đã có nhiều nghiên cứu về phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli nói chung nhƣng 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. coli O157:H7 nói riêng chỉ có một số nghiên cứu nhỏ, phân tán, chƣa thỏa đáng với mức độ nguy hiểm của nó. coli O157:H7 còn gặp nhiều khó khăn, mất nhiều thời gian, đòi hỏi các trang thiết bị, máy móc hiện đại, phân tích viên có trình độ chuyên môn cao.

Do đó, việc phân tích chính xác E. coli O157:H7 ở nƣớc ta còn hạn chế. Aptamer có bản chất là acid oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả năng liên kết chặt chẽ với một phân tử đích cụ thể nhờ sự tƣơng tác cấu trúc trong không gian 3 chiều. Phổ đích của aptamer rất đa dạng từ ion, phân tử, đại phân tử tới tế bào.

Aptamer đã đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, tạo cảm biến sinh học, nghiên cứu y dƣợc, điều trị ung thƣ, tạo thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, nghiên cứu dịch tễ học… Trong một số trƣờng hợp với vai trò nhƣ đầu dò nhận biết phân tử, aptamer có ái lực liên kết thậm chí vƣợt qua các kháng thể đơn dòng. Xuất phát từ nhu cầu sàng lọc, xác định E. coli O157:H7 một cách nhanh chóng, hạ giá thành nên chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7”. Mục tiêu của đề tài nhằm xây dựng đƣợc quy trình sàng lọc và sàng lọc đƣợc phân tử aptamer có khả năng nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E.

Nội dung nghiên cứu: - Xây dựng thƣ viện ssDNA và sàng lọc các aptamer liên kết với vi khuẩn E. - Tách dòng và xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Tổng quan về Escherichia coli O157:H7 1. Giới thiệu chung về E. coli O157:H7 Escherichia coli O157:H7 thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia [5]. Chúng là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng di động (hình 1.

Kích thƣớc: dài từ 2 - 4 µm, rộng 0.8 - 1µm, có nhiều lông toàn thân và có roi dài khoảng 20 nm. coli O157:H7 là sinh vật nhân sơ, DNA có cấu trúc siêu xoắn nằm giữa tế bào, không có màng nhân bao bọc. coli O157:H7 có cấu tạo đơn giản bao gồm: Lớp ngoài là thành tế bào,có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS). Lớp trong là màng sinh chất (gồm 1 lớp lipid nằm giữa 2 lớp phospho) bao quanh tế bào chất.

Tế bào chất là phần vật chất dạng keo chứa protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lƣợng phân tử thấp [7,8].1: Cấu tạo tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen nhân dài sấp xỉ 5,5 triệu bp, gồm khoảng 5483 gen và 2 plasmid có chiều dài lần lƣợt là 93 kb và 3,3 kb (hình 1. Trong hệ gen nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là stx1 và stx2 [5,25].

coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H, trong đó O là kháng nguyên bề mặt, còn H là kháng nguyên lông roi [5,6]. 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.1: Thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 Hệ gen pO157 pOSAK1 Độ dài 5,498,450 bp 92,721 bp 3,306 bp Tỉ lệ G+C 50.4 % Khung đọc mở (ORF): 5,361 83 3 Vùng mã hóa protein 88.8 % Chiều dài trung bình của các ORF 904 bp 922 bp 579 bp rRNA (16S-23S-5S) 7 0 0 tRNA và tmRNA 103 0 0 Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Đặc tính của E. coli O157:H7 là vi sinh vật hiếu kị khí tùy tiện, có khả năng hô hấp và lên men để trao đổi chất. Chúng không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Vi khuẩn này có thể sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng từ 80C đến 460C, nhiệt độ tối ƣu là 370C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 700C.

coli O157:H7 sinh truởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4 đến 9,0; thậm chí ở 370C trong 2 - 7h, nó vẫn có thể tồn tại đƣợc ở pH = 2,5 [43]; pH tối ƣu khoảng 6 - 7. Vi khuẩn này bị ức chế ở môi trƣờng có nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ trên 2,5%. coli O157:H7 sống kí sinh trong hệ tiêu hóa của ngƣời và động vật. Tuy nhiên khi bị phóng thích ra ngoài môi trƣờng chúng vẫn tiếp tục tồn tại 2 - 3 ngày ở 250C, 10 - 31 ngày ở 80C.

Điều này càng làm cho chúng có khả năng lan rộng và xâm nhiễm vào các tế bào vật chủ mới [14]. coli O157:H7 có khả năng lên men đƣờng lactose. Trên môi trƣờng Endo agar khuẩn lạc E. coli O157:H7 tròn, lồi, có ánh kim (hình 1.3: Hình ảnh khuẩn lạc của E.

coli O157:H7 trên môi trƣờng Endo agar và trên môi trƣờng Fluorocult® E. coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobise. Vi khuẩn này không tạo ra  -D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4- methylumbelliferyl--D-glucuronid (MUG) thành 4-methylumbelliferonenên khi chiếu dƣới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng Fluorocult® có bổ sung sorbitol và 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG), do không có khả năng lên men đƣờng sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] phân biệt với các E.

coli khác có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [26]. coli O157:H7 là loại vi khuẩn có khả năng sinh độc tố. Chúng có khả năng sinh độc tố Shiga hay còn gọi độc tố Vero.

Loại độc tố này không gây hại đối với động vật nhƣng lại gây nguy hiểm cho ngƣời nhƣ gây tán huyết, suy thận, thậm chí tử vong [38]. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H. Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O: - Bền nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2h.

- Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. - Bị hủy bởi formol 5%. - Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24h. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết O.

Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ [7]. Kháng nguyên lông roi H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H [7,20]. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E.

coli O157:H7 là vi khuẩn sinh độc tố. Trong hệ gen nhân của vi khuẩn này chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của chúng là stx1 và stx2. Trong đó, stx viết tắt của Shiga – like – toxin [8]. Stx là một ngoại độc tố không bền nhiệt, tác động lên cả ruột và hệ thần kinh trung ƣơng của ngƣời.

coli O157:H7 gây tiêu chảy, xuất huyết, đồng thời ức chế hấp thu đƣờng và các acid amin ở ruột non. Theo kết quả nghiên cứu của Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dƣợc Tp. Hồ Chí 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Minh, năm 1996: Độc tố theo đƣờng máu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến hệ thần kinh, có thể dẫn đến mê sảng, biến chứng thần kinh trầm trọng: co giật, tê liệt. Stx1 và Stx2 đều có tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tiểu đơn vị B gắn với thụ thể đặc hiệu là một glycolipid kí hiệu Gb3 (thụ thể đặc hiệu của Stx2 là Gb4).

Các Gb3 thƣờng thấy ở các tế bào biểu mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào biểu mô mạch [8]. Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố, các gen mã hóa nằm trên chromosome. stx1 có tính bảo tồn cao trong khi stx2 rất hay thay đổi về trình tự [19,25]. Tất cả các loại Stx đều có chung một cấu trúc AB5, trong đó một tiểu đơn vị A kết hợp với năm tiểu đơn vị B.