MỞ ĐẦU 1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cùng với sự tiến bộ của tin học trong sinh học cũng như của các kỹ thuật thao tác trong sinh học phân tử, các trình tự hoàn chỉnh của bộ gene (genome) đã và đang trở thành nguồn thông tin quí giá hỗ trợ cho việc tìm hiểu cấu trúc bộ gene và các quá trình sinh học xảy ra trong tế bào sinh vật. Các mối liên hệ giữa cấu trúc bộ gene và các quá trình sinh học xảy ra trong tế bào có thể được xác định thông qua việc thay đổi hoặc xóa bỏ các trình tự nucleotide trong bộ gene. Tuy nhiên, các kỹ thuật cao trong sinh học phân tử chưa đủ để việc thay đổi hoặc xóa bỏ các trình tự nucleotide trong bộ gene luôn được thành công. Các nghiên cứu gần đây của một số nhà khoa học trên thế giới trong việc tìm hiểu, thay đổi và tạo mới các trình tự bộ gene đã tiết lộ sự liên quan của sự sắp xếp của các nucleotide trong bộ gene đến một số các quá trình sinh học xảy ra trong tế bào [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7].
Các kết quả nghiên cứu này cho thấy những quá trình sinh học đó tác động lên sự thành công của các thí nghiệm tìm hiểu, thay đổi và tạo mới các trình tự bộ gene. Mặc dù các sinh vật khác nhau có các bộ gene với các trình tự nucleotide khác nhau, các nghiên cứu vào những năm 2001 [8] và 2002 [9] cho thấy các phân tử DNA nhiễm sắc thể của các bộ gene đều có chung một đặc điểm, đó là tính đối xứng. Không như tính đối xứng trên cơ sở khoảng cách của hai vật thể nào đó thường được đề cập trong hình học, tính đối xứng của phân tử DNA nhiễm sắc thể sinh vật là đặc điểm dựa trên sự phân bố của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể. Rõ ràng, các phân tử DNA nhiễm sắc thể tuy không giống nhau về trình tự nucleotide nhưng lại giống nhau về đặc tính đối xứng, có nghĩa là các nucleotide phải được sắp xếp theo một qui tắc nào đó để phân tử DNA nhiễm sắc thể trở nên đối xứng.
Tuy nhiên, vẫn chưa có một qui tắc nào về sự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể được công bố cho đến nay. Mặt khác, nhờ sự phát triển vượt trội của kỹ thuật xác định trình tự DNA, số lượng các vi sinh vật với trình tự bộ gene được xác định hoàn chỉnh tăng lên đáng kể [10]. Sự góp mặt của các trình tự bộ gene hoàn chỉnh của các vi sinh vật đã mở ra một hướng 1 mới cho việc nhận biết các loài, mặc dù hiện nay việc phân loại các vi sinh vật một cách nhanh chóng về cơ bản dựa trên mức độ đồng dạng của các trình tự 16S rDNA – là các trình tự mang thông tin mã hóa cho thành phần 16S rRNA của bộ máy tổng hợp protein ribosome. Tuy nhiên, các trình tự 16S rDNA gần đây được phát hiện là không đủ đặc trưng để luôn được sử dụng với vai trò này, đặc biệt là trong phân loại các vi sinh vật ở cấp độ dưới giống (genus), khi mà các loài trong cùng một giống hoặc các chủng (strain) trong cùng một loài (species) không giống nhau về khả năng gây bệnh cho người, thực vật và động vật và do đó cần được phân biệt [11], [12], [13], [14], [15], [16].
Các trình tự nucleotide của tổng thể bộ gene có tính đặc trưng loài, nhưng việc so sánh các trình tự này để xây dựng mối quan hệ tiến hóa của các loài là một vấn đề không đơn giản. Việc đi tìm một công cụ để phân loại các sinh vật nhờ các trình tự nucleotide hoàn chỉnh của các bộ gene đã cho ra đời các phương pháp phân loại mới dựa trên các dấu hiệu bộ gene (genomic signature) – là những dấu hiệu được phát hiện trên cơ sở tần suất xuất hiện của các oligomer trong các trình tự nucleotide nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, các phương pháp phân loại sinh vật dựa trên các dấu hiệu bộ gene cho đến nay nói chung phức tạp trong phương thức và trong thuật toán sử dụng. Chúng chưa được sử dụng một cách chính thống do không thể phân biệt được một số các vi sinh vật và không đủ đặc trưng để phân biệt một số vi khuẩn ở cấp độ dưới giống [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23].2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Đề tài nghiên cứu sự sắp xếp của các oligomer trong các phân tử DNA nhiễm sắc thể của các vi sinh vật nhằm hai mục đích sau: i) Tìm hiểu sâu hơn kiến thức hiện tại về sự phân bố của các nucleotide trong các phân tử DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn và nấm men.
ii) Đưa ra được một phương pháp phân loại các vi khuẩn có mối quan hệ tiến hóa gần ở cấp độ dưới giống.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các trình tự bộ gene đã được xác định hoàn chỉnh và được lưu ở ngân hàng National Center for Biotechnology Information (NCBI) [10]. 2 Do qui tắc sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể lần đầu tiên được khởi xướng và nghiên cứu bởi luận án này, phạm vi nghiên cứu của đề tài chỉ được giới hạn cho các trình tự bộ gene hoàn chỉnh của vi khuẩn và nấm men Saccharomyces cerevisiae.4 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Trong công nghiệp công nghệ sinh học, việc tạo ra được những chủng, loài vi sinh vật với bộ gene cho những sản phẩm mong muốn là thực sự cần thiết. Tuy nhiên, sự thành công trong việc tạo ra được những vi sinh vật này hiện tại phụ thuộc quá nhiều vào những hiểu biết của con người về các trình tự bộ gene và những quá trình sinh học liên quan đến trật tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Như đã đề cập trong Mục 1.1, các trình tự nucleotide hoàn chỉnh của các phân tử DNA nhiễm sắc thể của các cá thể vi sinh vật khác nhau thì không giống nhau nhưng đều có tính đối xứng.
Tuy vậy, các nucleotide được sắp xếp như thế nào để các phân tử DNA nhiễm sắc thể trở nên đối xứng thì chưa được biết đến. Cho nên, việc xác định được qui tắc sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể sẽ là cơ sở để định hướng và thực hiện hiệu quả công việc tạo ra những vi sinh vật mong muốn. Vì thế, nghiên cứu sự sắp xếp của các oligomer trong các phân tử DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn và nấm men là một đề tài quan trọng và có ý nghĩa cấp thiết trong công nghệ gene. Mặt khác, như đã được đề cập ở Mục 1.1, các trình tự 16S rDNA hiện nay đang được sử dụng một cách rộng rãi để nhận biết nhanh các vi khuẩn, nhưng do tính đặc trưng loài không cao của các trình tự này, một số vi khuẩn, nhất là các loài trong cùng một giống hoặc các chủng trong cùng một loài có các khả năng gây bệnh khác nhau cho người, động vật và thực vật không thể được phân biệt [13], [14], [15], [16].
Khó khăn này cho đến nay vẫn chưa được giải quyết mặc dù các giải pháp phân biệt các vi khuẩn này đã được nỗ lực nghiên cứu bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới [18], [19], [20], [21], [22]. Vì vậy, việc xây dựng được một phương pháp phân loại có khả năng phân biệt các vi khuẩn như thế thực sự mang tính cấp thiết.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Đề tài này tìm hiểu qui tắc sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn và nấm men, nhằm cung cấp sâu hơn kiến thức hiện tại về sự phân bố của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể tế bào vi sinh vật. Đồng thời, đề tài này xây dựng phương pháp phân loại các vi khuẩn có mối quan hệ tiến hóa gần ở cấp độ dưới giống mà trong đó có một số vi khuẩn không thể được phân loại bởi các phương pháp đã biết.6 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Việc khám phá ra qui tắc sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể có thể giúp con người can thiệp có định hướng vào việc thay đổi có hiệu quả các trình tự nucleotide trên nhiễm sắc thể bằng các kỹ thuật biến đổi DNA để phục vụ lợi ích của con người. Việc xây dựng được một phương pháp phân loại các vi khuẩn ở cấp độ dưới giống giải quyết được khó khăn hiện tại trong việc phân biệt các vi khuẩn có mối quan hệ tiến hóa gần, đặc biệt là các loài trong cùng một giống hoặc các chủng trong cùng một loài nhưng khác nhau về khả năng gây bệnh cho người, động vật và thực vật.7 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu của đề tài luận án có những tính mới sau đây: i) Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu và xác định được qui tắc sắp xếp của các trimer và trimer bổ sung đảo ngược (BSĐN) trong các trình tự mang thông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể.
ii) Luận án sử dụng khái niệm mới về bất đối xứng trimer để nghiên cứu sự phân bố của các trimer trong các trình tự DNA của nhiễm sắc thể. iii) Luận án đưa ra khái niệm mật độ phân bố của các trimer trong một trình tự DNA, cũng là một khái niệm mới. Với khái niệm này, luận án chứng minh các nucleotide được sắp xếp có qui tắc trong phân tử DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn để góp phần tạo nên tính đối xứng của phân tử DNA nhiễm sắc thể 4 cũng như trình bày khả năng ứng dụng các trình tự bộ gene trong phân loại các vi khuẩn có mối quan hệ tiến hóa gần ở cấp độ dưới giống. 5 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 DNA Vào năm 1919, Levene khám phá ra rằng phân tử DNA (deoxyribonucleic acid) là một phân tử chứa các nucleotide.
Mỗi nucleotide gồm có một nitrogen base và một đường deoxyribose nối với nhau thông qua nhóm phosphate [24]. Các nucleotide này có thể là adenine (A), thymine (T), cytosine (C) hoặc guanine (G). Chúng khác nhau ở cấu trúc nitrogen base (Hình 2. Năm 1951, Erwin Chargaff phát hiện được rằng trong DNA, số lượng A xấp xỉ bằng số lượng T cũng như số lượng C xấp xỉ bằng số lượng G [26].
Phát hiện này của Erwin Chargaff đã trở thành tiền đề cho Watson và Crick xây dựng nên mô hình xoắn kép nucleotide của phân tử DNA vào năm 1953 [27].
