Đặt vấn đề Dendrobium là giống lớn thứ hai trong họ lan (Orchidaceae), có phân bố rộng từ các vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới, rất thích hợp trong điều kiện khí hậu Việt Nam. Trong đó, Dendrobium Sonia là loài lan lai có hoa đẹp, màu tím, rất được ưa chuộng và là loại lan cắt cành chủ lực hiện nay ở Việt Nam nói chung và Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng. Tuy nhiên, lan Dendrobium Sonia cũng như hoa lan nói chung rất dễ mắc các loại bệnh gây hại, đặc biệt là bệnh virus. Bệnh do virus gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lan và hiện vẫn chưa có thuốc đặc trị.
Do đó, việc tạo ra giống lan có khả năng kháng virus là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay và một trong những phương pháp đang được quan tâm nhất để tạo cây lan kháng virus là chuyển gen. Mặc dù phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thường được sử dụng để chuyển gen trên các cây thuộc lớp hai lá mầm. Tuy nhiên, gần đây đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng vi khuẩn này để chuyển gen trên các cây một lá mầm, tuy nhiên đòi hỏi phải tối ưu hóa nhiều yếu tố liên quan trong quy trình chuyển gen. Với mục tiêu tạo ra một quy trình phù hợp để chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, góp phần vào mục tiêu tạo cây lan chuyển gen kháng virus trong tương lai, đề tài: “Bước đầu thiết lập quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia bằng vi khuẩn Agrobacterium” được triển khai thực hiện.2 Mục đích và phạm vi đề tài Xây dựng quy trình chuyển gen vào protocorm của lan Dendrobium Sonia thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
Đồng thời tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen.3 Ý nghĩa của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học cần thiết cho việc chuyển được gen vào cây lan Dendrobium Sonia cũng như lan Dendrobium nói chung bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Các thông số kỹ thuật của đề tài sẽ là cơ sở để tiếp tục tiến hành chuyển gen tạo ra cây lan Dendrobium Sonia có khả năng kháng virus. 2 4 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 4.1 Giới thiệu chung về lan Dendrobium Sonia 4.1 Nguồn gốc Giống lan này được đặt tên vào năm 1799. Chữ Dendrobium có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp.
Dendro có nghĩa là cây lớn, bio là sống, vì tất cả các loài của Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ. Dendrobium rất phong phú về chủng loại, là giống lớn thứ hai của họ lan với khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Châu Úc. Điều kiện sinh thái của Dendrobium rất đa dạng, có loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở vùng trung gian, và cũng có loài có thể thích nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào.2 Phân loại Tên khoa học: Dendrobium Sonia Giống: Dendrobium Họ: Ochidaceae Bộ: Ochidales Lớp: Monocotyldones (Một lá mầm) Ngành: Magnoliophyta [2] 3 Hình 2.1: Lan Dendrobium Sonia 4.3 Đặc điểm về hình thái a. Rễ Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp với nhiều điều kiện sống.
Ở một số loài có lối sống bám lơ lửng trên vỏ thân cây gỗ khác, nên thân rễ dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, hấp thu chất dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cho cây khỏi bị gió cuốn đi. Hệ rễ phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chung của cả cây lan. Ở một số loài sống hoại sinh thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặt các vòi hút ngắn hút chất dinh dưỡng từ xác thực vật [5, 9].
Thân Thuộc nhóm đa thân, đây là nhóm gồm những cây tăng trưởng liên tục mà có những chu kì nghỉ sau những mùa tăng trưởng. Dendrobium vừa có thân thật vừa có giả hành. Giả hành tuy là thân nhưng có diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới. Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước.
Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùn với lá, nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp. Thường các loài thuộc giống Dendrobium dùng cho mục đích kinh doanh là lan đa thân với nhiều giả hành [5]. Lá: Phong lan đều là cây tự dưỡng, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá, có rất nhiều kiểu lá mỏng khác nhau, có mỏng mềm, có dai cứng và cũng có cả mọng nước, có lá dài, lá dẹt, hình trụ. Về màu sắc, phiến lá có màu xanh bóng, nhưng đôi khi hai mặt lá có màu sắc khác nhau [5].
Hoa: Mọc từ thân thành từng chùm, các chồi hoa không những mọc trên các giả hành mới mà còn mọc trên các giả hành củ. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa, mang phần đực ở phía trên và phần cái (đầu nhụy) ở mặt trước. Cột này thường dài, thẳng hay cong về phía trước. Nhị đực gồm hai phần, bao phấn và hốc phấn.
Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy, còn hốc phấn thì lõm lại. Mang khối phấn và thường song song với bao phấn. Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng do có tinh bột, sáp hay chất sừng. Vì thế giống Dendrobium khi ra hoa nó cho một số lượng cành hoa nhiều hơn bất kì loài lan nào khác [5, 9].
Quả: Quả phong lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3 – 6 đường nứt dọc. Khi chín quả mở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc [5]. Hạt: Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy không khí [5]. Protocorm Protocorm là thuật ngữ được đặt ra đầu tiên bởi nhà quản lý Melchoior Treub của vườn Bách Thảo Bogor, Indonesia (hiện nay là Vườn Kebun Raya), ông dùng từ này để chỉ ra một giai đoạn phát triển của rêu (Treub, 1890).
Sau đó, Noel Bemard dùng protocorm cho các cây họ lan vào những năm 1899 – 1910. Hiện nay, protocorm dùng để mô tả cấu trúc hình cầu nhỏ của lan [6]. Protocorm là một cơ quan dự trữ nhỏ được hình thành từ phôi đang nẩy mầm. Phôi này bao gồm một đỉnh sinh trưởng và một lá mầm.
5 Protocorm like body là một thuật ngữ thích hợp để chỉ những cấu trúc giống với protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh của chồi bất định. Thuật ngữ này được Morel sử dụng trong bài báo tiếng Anh của ông về nuôi cấy chồi đỉnh. Trong nuôi cấy mô ở cây lan, PLB là một thể thường gặp và là cấu trúc tái sinh cơ quan của lan. PLB là một cụm nhỏ vô tổ chức, có khả năng sinh ra nhiều điểm tăng trưởng bất định.
Các điểm này có thể tạo ra nhiều PLB mới hay phát triển thành chồi non có lá. Cùng với đặc điểm dễ dàng trong nuôi cấy nên PLB thường được dùng làm nguồn nguyên liệu nhân nhanh [6].2 Sơ lược về vi khuẩn Agrobacterium 4.1 Phân loại Giống Agrobacterium thuộc: Họ: Rhizobiaceae Bộ: Rhizobiales Lớp: Alphaproteobacteria Ngành: Proteobacteria Giới: Prokaryotae ( monera ) Danh pháp của các loài Agrobacterium được đặt tên dựa trên các đặc điểm gây bệnh của plasmid: - Agrobacterium tumefaciens: gây bệnh gẻ khối u trên cây phong lữ, cà chua, thuốc lá… - Agrobacterium rhizogenes: gây bệnh rễ tơ trên cây đậu nành, cà chua… - Agrobacterium rubi: gây bệnh mụn ở mía. - Agrobacterium vitis: gây bệnh ghẻ khối u ở nho. - Agrobacterium radiobacter: bao gồm tất cả các loài không gây bệnh.
Nhóm Agrobacterium tumefaciens được sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen. Vi khuẩn gram âm Agrobacterium tumefaciens là một vi khuẩn gây bệnh, trong vòng đời 6 của mình vi khuẩn thực hiện việc biến nạp di truyền vào trong tế bào thực vật. Việc biến nạp di truyền này tạo thành các u sần trên cây chủ làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường của cây. Bệnh do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gây ra tác động quan trọng đến nông nghiệp tuy nhiên nó chỉ tác động trên cây hai lá mầm [26].2: Vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi 4.2 Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium A.
tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5 – 3,0 x 0.8mm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn háo khí, nhuộm gram (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn. Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, tròn, nhỏ, rìa đều đặn và có màu xanh da trời nhạt sau đó đậm dần trên môi trường chỉ thị. tumefaciens không có khả năng khử arginine, không phân giải gelatin, có thể phân giải các loại đường, tinh bột, tryptophan, tạo NH3 và H2S, khử oxydase. Agrobacterium không thể tạo gây khối u (chuyển T-DNA) ở nhiệt độ trên 290C và khoảng pH bazơ.
Lý do là hệ thống protein vir đặc biệt là virA rất nhạy cảm với nhiệt độ, chúng bất hoạt ở 290C và biến tính ở 320C. Hiệu suất chuyển gen cao nhất ở 220C và khoảng pH từ 5.7, điều này được giải thích do thụ thể nhận biết ký chủ của Agrobacterium (ChvE-VirA) được hoạt hóa bằng proton của hợp chất phenolic và nó bị bất hoạt trong môi trường baz. Một khi protein vir A bị bất hoạt thì tế bào vi khuẩn sẽ mất khả năng hoạt hóa toàn bộ hệ thống protein vir dẫn đến mất khả năng chuyển gen [9]. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật.
Khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn. Để khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T- ADN và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-ADN.
Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật [7, 21, 26].