Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men pichia pastoris x33 36 và ảnh hưởng của nó đến tế bào ung thư nuôi cấy

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men pichia pastoris x33 36 và ảnh hưởng, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Nguyễn Quang Hòa
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Nho Thái
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Protein P53 Từ Nấm Men Và Tác Động Đến Ung Thư
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Tình hình ung thư trên thế giới
• 1.3. Tình hình ung thư ở Việt Nam
• 1.4. Các nguyên nhân gây ung thư
• 1.5. Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư
• 1.6. Tổng quan về gen TP53 và protein p53
• 1.6.1. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53
• 1.6.2. Cấu trúc không gian của protein p53
• 1.6.3. Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu
• 1.6.4. Chức năng của protein p53
• 1.6.5. Cơ chế protein p53 gây nên apoptosis và ảnh hưởng đến sự ức chế tế bào khối u
• 1.7. Tổng quan về các nghiên cứu biểu hiện protein cho liệu pháp điều trị đích trong ung thư
• 1.8. Liệu pháp điều trị ung thư dựa vào protein p53
• 1.9. Nghiên cứu biểu hiện protein p53 trong nấm men trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.10. Vector pPicZαA-TAT-p53-his và cơ chế thử nghiệm protein p53 tái tổ hợp trên mức độ tế bào
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Các dung dịch và đệm
• 2.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Kiểm tra chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và nuôi biểu hiện thu sinh khối protein p53 tái tổ hợp
• 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của nấm men
• 2.4.3. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose
• 2.4.4. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)
• 2.4.5. Phương pháp sắc ký ái lực
• 2.4.6. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.4.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư trong điều kiện in vitro
• 2.4.8. Phương pháp kiểm tra sự ảnh hưởng của dung dịch P lên tế bào ung thư trong điều kiện in vitro
• 2.4.9. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nuôi biểu hiện protein p53 trong nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.2. Kết quả kiểm tra gen TAT-p53-His chứa trong hệ gen nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.3. Kết quả nuôi biểu hiện chủng nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.4. Kết quả điện di dịch nuôi biểu hiện thô và sau khi tinh sạch
• 3.5. Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 3.6. Kết quả nuôi tế bào ung thư in vitro
• 3.7. Kết quả kiểm tra khả năng ảnh hưởng của môi trường pha thuốc tới tế bào ung thư nuôi cấy
• 3.8. Kết quả thử độc tính tế bào và khả năng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư với thuốc thử là protein p53 tái tổ hợp
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein p53 từ nấm men và ung thư

Nghiên cứu về protein p53 từ nấm men đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử và điều trị ung thư. Protein p53 được biết đến như một yếu tố quan trọng trong việc điều chỉnh chu trình tế bào và ngăn ngừa sự phát triển của khối u. Nấm men, đặc biệt là Pichia pastoris, đã trở thành một mô hình lý tưởng để nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp. Việc hiểu rõ về protein p53 và cách thức hoạt động của nó có thể mở ra những hướng đi mới trong điều trị ung thư.

1.1. Protein p53 và vai trò trong ung thư

Protein p53 được coi là 'người bảo vệ' của gen, có khả năng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư. Khi gen TP53 bị đột biến, khả năng kiểm soát chu trình tế bào bị suy giảm, dẫn đến sự phát triển không kiểm soát của tế bào. Nghiên cứu cho thấy rằng hơn 50% các loại ung thư có liên quan đến sự bất thường của protein p53.

1.2. Nấm men Pichia pastoris trong nghiên cứu sinh học

Nấm men Pichia pastoris là một hệ thống biểu hiện protein hiệu quả, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp với độ tinh khiết cao. Hệ thống này đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất các protein có giá trị, bao gồm cả protein p53. Việc sử dụng nấm men giúp giảm chi phí và thời gian trong quá trình nghiên cứu.

II. Thách thức trong nghiên cứu protein p53 từ nấm men

Mặc dù nghiên cứu protein p53 từ nấm men mang lại nhiều tiềm năng, nhưng cũng gặp phải không ít thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để đạt được sản lượng protein cao nhất. Ngoài ra, việc đảm bảo tính hoạt động của protein p53 sau khi tái tổ hợp cũng là một thách thức không nhỏ.

2.1. Khó khăn trong việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nấm men để sản xuất protein p53 tái tổ hợp là một quá trình phức tạp. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, và nồng độ dinh dưỡng đều ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm men và khả năng sản xuất protein. Việc tìm ra điều kiện tối ưu là rất cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất.

2.2. Đảm bảo tính hoạt động của protein p53

Sau khi tái tổ hợp, protein p53 cần được kiểm tra để đảm bảo rằng nó vẫn giữ được hoạt tính sinh học. Các phương pháp như điện di SDS-PAGE và thử nghiệm chức năng tế bào thường được sử dụng để đánh giá tính hoạt động của protein. Việc này rất quan trọng để xác định khả năng ức chế tế bào ung thư của protein p53.

III. Phương pháp nghiên cứu protein p53 từ nấm men

Để nghiên cứu protein p53 từ nấm men, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy nấm men, tách chiết protein, và kiểm tra hoạt tính sinh học của protein. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng.

3.1. Nuôi cấy nấm men Pichia pastoris

Nuôi cấy nấm men Pichia pastoris là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu. Các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, và nồng độ dinh dưỡng cần được tối ưu hóa để đạt được sản lượng protein cao nhất. Việc theo dõi sự phát triển của nấm men trong quá trình nuôi cấy cũng rất quan trọng.

3.2. Tách chiết và tinh sạch protein p53

Sau khi nuôi cấy, protein p53 cần được tách chiết và tinh sạch. Các phương pháp như sắc ký ái lực và điện di SDS-PAGE thường được sử dụng để đạt được độ tinh khiết cao. Việc này giúp đảm bảo rằng protein p53 có thể được sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protein p53 trong điều trị ung thư

Protein p53 có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Nghiên cứu cho thấy rằng protein p53 tái tổ hợp có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong các thử nghiệm in vitro. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị đích hiệu quả hơn.

4.1. Khả năng ức chế tế bào ung thư của protein p53

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein p53 tái tổ hợp có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Các thử nghiệm in vitro cho thấy rằng protein này có thể kích hoạt quá trình apoptosis, dẫn đến sự chết của tế bào ung thư. Điều này cho thấy tiềm năng của protein p53 trong điều trị ung thư.

4.2. Triển vọng phát triển liệu pháp điều trị đích

Việc sử dụng protein p53 trong liệu pháp điều trị đích có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ so với các phương pháp điều trị truyền thống. Nghiên cứu đang tiếp tục để xác định cách thức tối ưu để sử dụng protein p53 trong điều trị ung thư, nhằm mang lại hiệu quả cao nhất cho bệnh nhân.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu protein p53

Nghiên cứu protein p53 từ nấm men không chỉ mở ra những hướng đi mới trong điều trị ung thư mà còn góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế hoạt động của protein này. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều đột phá trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu protein p53

Nghiên cứu protein p53 đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Việc hiểu rõ về cơ chế hoạt động của protein này có thể giúp các nhà khoa học phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn, giảm thiểu tác dụng phụ cho bệnh nhân.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu

Tương lai của nghiên cứu protein p53 từ nấm men sẽ tiếp tục được mở rộng với nhiều thử nghiệm lâm sàng hơn. Các nhà khoa học sẽ tiếp tục tìm kiếm các phương pháp tối ưu để sản xuất và sử dụng protein p53 trong điều trị ung thư, nhằm mang lại hy vọng cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu trên thế giới với khoảng 18,1 triệu ca mắc mới và 9,6 triệu ca tử vong vào năm 2018. Ở Việt Nam, năm 2018 ghi nhận 164.671 ca ung thư mới, dự báo tăng lên 189.344 ca vào năm 2020. Các loại ung thư phổ biến ở nam giới gồm gan (21,5%), phổi (18,4%), dạ dày (12,3%), trong khi ở nữ giới là ung thư vú (20,6%), đại trực tràng (9,6%) và phổi (9,4%). Tỷ lệ bệnh nhân phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm còn thấp, chỉ khoảng 28,6% tổng số ca. Các phương pháp điều trị truyền thống như hóa trị, xạ trị thường tốn kém và gây nhiều tác dụng phụ, do đó liệu pháp điều trị đích đang được quan tâm nhằm tăng hiệu quả và giảm tác hại.

Protein p53, được mã hóa bởi gen TP53, là một protein ức chế khối u quan trọng, có vai trò kiểm soát chu trình tế bào, sửa chữa DNA và kích hoạt apoptosis. Nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 nhằm tạo ra protein p53 tinh sạch với hoạt tính sinh học cao, có khả năng ức chế tế bào ung thư nuôi cấy in vitro. Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nấm men và quy trình tinh sạch protein p53 tái tổ hợp, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của protein này đến sự phát triển của tế bào ung thư HeLa và KMS-20 trong điều kiện nuôi cấy.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết về gen TP53 và protein p53: TP53 là gen ức chế khối u, mã hóa protein p53 có cấu trúc tetramer, gồm các miền kích hoạt phiên mã, vùng giàu proline, vùng lõi chứa nguyên tử kẽm và miền oligomer hóa. Protein p53 điều chỉnh chu trình tế bào, sửa chữa DNA và kích hoạt apoptosis khi tế bào bị tổn thương.

• Mô hình apoptosis: Hai con đường chính dẫn đến apoptosis là con đường nội bào (điều hòa bởi họ BCL-2) và con đường ngoại bào (kích hoạt caspase-8 qua FADD). Protein p53 kích hoạt apoptosis qua việc điều hòa các gen mục tiêu như p21, GADD45A, MDM2.

• Liệu pháp điều trị đích dựa trên protein p53: Sử dụng protein p53 tái tổ hợp để ức chế tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào bình thường, dựa trên khả năng kiểm soát chu trình tế bào và gây apoptosis của p53.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 mang vector pPicZαA-TAT-p53-his, tế bào ung thư HeLa (ung thư cổ tử cung) và KMS-20 (ung thư máu).

• Phương pháp nuôi cấy và biểu hiện protein: Nấm men được nuôi trong môi trường YPD và BMMY với methanol 0,5% làm nguồn carbon, đo OD600 để theo dõi sinh trưởng. Protein p53 tái tổ hợp được thu nhận từ dịch nuôi biểu hiện sau 72 giờ.

• Tinh sạch protein: Sử dụng sắc ký ái lực với cột Niken-Sepharose dựa trên đuôi polyhistidine của protein. Tối ưu pH tinh sạch (pH 8.0) và nồng độ imidazol (0,5 mM) để tăng hiệu suất tinh sạch.

• Định lượng protein: Phương pháp Bradford với đường chuẩn BSA, đo OD595 để xác định nồng độ protein.

• Nuôi cấy tế bào ung thư in vitro: Tế bào HeLa và KMS-20 được nuôi trong môi trường DMEM low glucose và RPMI 1640 bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, ở 37°C, 5% CO2.

• Thử nghiệm độc tính và ức chế tế bào: Dùng phương pháp MTS đo hoạt tính tế bào sau 48 giờ xử lý với protein p53 tái tổ hợp ở dải nồng độ 0,109375 – 7 µg/ml. Đo OD490 để tính chỉ số IC50.

• Timeline nghiên cứu: Nuôi cấy nấm men và biểu hiện protein trong 3 ngày, tinh sạch protein trong 1-2 ngày, nuôi cấy tế bào và thử nghiệm hoạt tính trong 2 ngày, phân tích dữ liệu và báo cáo kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Kiểm tra gen TAT-p53-His trong nấm men: PCR xác nhận sự tồn tại ổn định của gen tái tổ hợp trong chủng Pichia pastoris X33-36 với băng DNA khoảng 1,2 kb, phù hợp kích thước thiết kế.

2. Tốc độ sinh trưởng nấm men: Đường cong sinh trưởng cho thấy OD600 đạt khoảng 10 sau 72 giờ nuôi cấy, thể hiện khả năng sinh trưởng ổn định và phù hợp cho biểu hiện protein.

3. Tinh sạch protein p53 tái tổ hợp: SDS-PAGE cho thấy protein p53 tinh sạch có kích thước khoảng 47 kDa, với hiệu suất tinh sạch đạt 21,8% ở pH 8.0, cao hơn so với pH 6.0. Nồng độ protein thu được khoảng 30 mg từ 400 ml dịch nuôi biểu hiện.

4. Ảnh hưởng của môi trường pha mẫu đến tế bào ung thư: Môi trường bảo quản protein (glycerol 20%, BSA 1%) không ảnh hưởng đến sự sống và sinh trưởng của tế bào HeLa và KMS-20 sau 24 giờ nuôi cấy.

5. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của protein p53: Protein p53 tái tổ hợp không gây độc tế bào HeLa nhưng có tác dụng ức chế rõ rệt trên tế bào KMS-20, giảm mật độ tế bào xuống còn khoảng 20% so với đối chứng ở nồng độ 7 µg/ml. Chỉ số IC50 ước tính nằm trong khoảng dải nồng độ thử nghiệm.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy quy trình nuôi cấy và tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 đã được tối ưu, đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao hơn so với các nghiên cứu trước. Việc sử dụng pH 8.0 và nồng độ imidazol 0,5 mM trong sắc ký ái lực giúp tăng khả năng thu hồi protein tinh sạch.

Hoạt tính sinh học của protein p53 được thể hiện qua khả năng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư máu KMS-20, trong khi tế bào HeLa không bị ảnh hưởng, phù hợp với cơ chế điều trị đích nhằm hạn chế tác động lên tế bào bình thường. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về protein p53 tái tổ hợp trên tế bào ung thư.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong sinh trưởng nấm men, gel điện di SDS-PAGE thể hiện độ tinh sạch protein, và biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ sống sót tế bào KMS-20 theo nồng độ protein p53. Bảng số liệu định lượng protein và OD490 nm hỗ trợ đánh giá hiệu quả tinh sạch và hoạt tính sinh học.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng nghiên cứu in vivo: Tiến hành thử nghiệm trên mô và động vật để đánh giá hiệu quả và an toàn của protein p53 tái tổ hợp trong điều trị ung thư, nhằm xác nhận khả năng ứng dụng lâm sàng trong vòng 1-2 năm tới.

2. Tối ưu quy trình sản xuất protein: Nâng cao quy mô nuôi cấy và tinh sạch protein p53 để đáp ứng nhu cầu thử nghiệm và ứng dụng, tập trung vào việc giảm chi phí và tăng độ ổn định sản phẩm trong 6-12 tháng.

3. Phát triển liệu pháp kết hợp: Nghiên cứu phối hợp protein p53 với các liệu pháp điều trị đích khác hoặc hóa trị để tăng hiệu quả điều trị và giảm tác dụng phụ, thực hiện trong 1-3 năm.

4. Xây dựng quy trình kiểm soát chất lượng: Thiết lập các tiêu chuẩn đánh giá độ tinh sạch, hoạt tính và an toàn của protein p53 tái tổ hợp để đảm bảo tính nhất quán và an toàn khi ứng dụng, hoàn thiện trong 6 tháng.

5. Tăng cường đào tạo và hợp tác nghiên cứu: Đào tạo nhân lực chuyên môn về công nghệ protein tái tổ hợp và mở rộng hợp tác quốc tế để cập nhật kỹ thuật mới, nâng cao chất lượng nghiên cứu trong 1 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu về biểu hiện protein tái tổ hợp, kỹ thuật tinh sạch protein và ứng dụng trong điều trị ung thư.

2. Bác sĩ và chuyên gia y học ung thư: Hiểu rõ cơ chế hoạt động của protein p53 trong điều trị đích, từ đó áp dụng các liệu pháp mới trong lâm sàng.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Phát triển sản phẩm protein tái tổ hợp phục vụ điều trị ung thư, tối ưu quy trình sản xuất và kiểm soát chất lượng.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế: Đánh giá tiềm năng ứng dụng liệu pháp điều trị đích dựa trên protein p53, từ đó xây dựng chính sách hỗ trợ nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học trong y tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Protein p53 tái tổ hợp có ưu điểm gì so với liệu pháp truyền thống?
   Protein p53 tái tổ hợp nhắm mục tiêu trực tiếp vào tế bào ung thư, kích hoạt apoptosis mà không ảnh hưởng đến tế bào bình thường, giảm tác dụng phụ và chi phí điều trị so với hóa trị và xạ trị.

2. Tại sao chọn nấm men Pichia pastoris để biểu hiện protein p53?
   Pichia pastoris có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp với năng suất cao, dễ nuôi cấy, chi phí thấp và có hệ thống glycosyl hóa tương tự tế bào người, giúp protein giữ hoạt tính sinh học.

3. Phương pháp tinh sạch protein sử dụng trong nghiên cứu là gì?
   Sử dụng sắc ký ái lực với cột Niken-Sepharose dựa trên đuôi polyhistidine của protein, cho phép tinh sạch đặc hiệu và giữ hoạt tính protein.

4. Protein p53 có tác dụng như thế nào trên các dòng tế bào ung thư khác nhau?
   Protein p53 tái tổ hợp không gây độc tế bào HeLa nhưng ức chế rõ rệt tế bào KMS-20, cho thấy hiệu quả phụ thuộc vào loại tế bào ung thư và cơ chế sinh học đặc thù.

5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng trong điều trị ung thư ở Việt Nam không?
   Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học quan trọng để phát triển liệu pháp điều trị đích dựa trên protein p53 tại Việt Nam, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

Kết luận

• Đã thành công trong việc nuôi cấy và biểu hiện protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 với hiệu suất và độ tinh sạch cao hơn các nghiên cứu trước.
• Protein p53 tinh sạch có hoạt tính sinh học, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư máu KMS-20 mà không gây độc tế bào HeLa.
• Quy trình tinh sạch protein được tối ưu ở pH 8.0 và nồng độ imidazol 0,5 mM, nâng cao hiệu quả thu hồi protein.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển liệu pháp điều trị đích dựa trên protein p53 tại Việt Nam, góp phần cải thiện chất lượng điều trị ung thư.
• Các bước tiếp theo bao gồm mở rộng thử nghiệm in vivo, tối ưu quy trình sản xuất và phát triển liệu pháp kết hợp để ứng dụng lâm sàng.

Hành động khuyến nghị: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học nên tiếp tục đầu tư phát triển và ứng dụng protein p53 tái tổ hợp trong điều trị ung thư, đồng thời tăng cường hợp tác quốc tế để nâng cao chất lượng nghiên cứu và sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam 1. Tình hình ung thư trên thế giới Ung thư là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, với khoảng 18,1 triệu trường hợp mới vào năm 2018. Số ca tử vong do ung thư lên đến 9,6 triệu người, chiếm gần 1/6 các ca tử vong.

Trong cả hai giới, số ca mắc bệnh do ung thư phổi chiếm tỷ lệ lớn nhất chiếm 11,6% trong tổng số ca và chiếm 18,4% trong tổng số ca tử vong do ung thư. Theo sau đó là ung thư vú ở nữ với 11,6% số ca mắc, ung thư tuyến tiền liệt với 7,1%. Đa số các ca mắc bệnh thường được chuẩn đoán ở giai đoạn cuối khi mà không thể can thiệp và điều trị được nữa. Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình.

Năm 2017, chỉ có 26% các quốc gia có thu nhập thấp báo cáo có dịch vụ khám bệnh công cộng trong khi ở các nước có thu nhập cao là 90%. Áp lực của ung thư đến nền kinh tế là vô cùng đáng kể và đang ngày một gia tăng. Tổng kinh phí hàng năm chi trả cho điều trị trong năm 2010 ước tính khoảng 1,16 nghìn tỉ USD [26]. Dù vậy cũng chỉ có 1 trong 5 nước có thu nhập thấp và trung bình có những dữ liệu cần thiết để thúc đẩy các chính sách phòng chống ung thư.

Tình hình ung thư ở Việt Nam Năm 2018, theo dữ liệu từ cơ quan nghiên cứu quốc tế về ung thư (IARC). Ở Việt Nam, số ca được chuẩn đoán mắc bệnh ung thư mới là 164 671người ( không tính du học sinh ), và 114 871 theo số liệu ước tính từ hệ thống ghi nhận ung thư từ 6 tỉnh, thành phố năm 2010. Dự báo vào năm 2020 sẽ có ít nhất 189 344 ca ung thư mới mắc. Trong số ca ung thư, 5 loại ung thư hàng đầu ở nam giới Việt Nam là ung thư gan (21,5%), phổi (18,4%), dạ dày (12,3%), đại trực tràng (8,4%) và vòm họng (5,0%) và ở phụ nữ là ung thư vú (20,6%), đại trực tràng (9,6%), phổi (9,4%), dạ dày (8,6%) ) và gan (7,8%).

Tỷ lệ bệnh nhân ung thư đến khám và điều trị sớm còn thấp, năm 2009 một nghiên cứu tại 5 bệnh viện ung thư cho thấy chung các loại ung thư 28,6% bệnh nhân đến giai đoạn I và II, đối với ung thư vú 50,5% đến sớm, ung thư cổ tử cung 46,0% đến sớm và ung thư đại trực tràng 32,2% đến sớm Số người chết vì ung thư trên năm là 94 700 người [26]. 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Dự án phòng chống ung thư là một dự án trong Chương trình mục tiêu quốc gia phòng, chống một số bệnh xã hội, bệnh dịch nguy hiểm và HIV/AIDS giai đoạn 2006-2010, được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt ngày 17/7/2007 tại quyết định số 108/2007/QĐ-TTG. Mục tiêu của dự án là từng bước giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do ung thư và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân ung thư. Giai đoạn 2012-2015 mục tiêu khiêm tốn hơn, cụ thể là nâng cao nhận thức của cộng đồng về phòng và phát hiện sớm bệnh ung thư và tăng 10-15% tỷ lệ bệnh nhân ung thư được phát hiện ở giai đoạn sớm, đồng thời giảm tỷ lệ tử vong của một số loại ung thư: vú, cổ tử cung, khoang miệng và đại trực tràng [35] 1.

Các nguyên nhân gây ung thư Ung thư xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau. Là quá trình chuyển đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u bằng một chuỗi các quá trình biến đổi sinh hóa khác nhau, thường phát triển từ các tổn thương tiền ung thư cho đến ung thư ác tính. Những thay đổi này là do sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của một người với các tác nhân bên ngoài như: tác nhân vật lý với tia cực tím, bức xạ ion; tác nhân hóa học như khói thuốc lá, aflatoxin, arsenic; và các tác nhân sinh học do nhiễm vi khuẩn, virus. Tuổi tác cũng là nguyên nhân cơ bản cho sự phát triển ung thư.

Tỷ lệ mắc bệnh ung thư tăng đáng kể theo độ tuổi. Khoảng 1/3 số ca tử vong do ung thư do lối sống và chế độ ăn uống với: các chỉ số trong cơ thể tăng cao bất thường, ăn ít trái cây và rau quả, thiếu hoạt động thể lực, sử dụng thuốc lá và rượu. Trong đó sử dụng thuốc lá là yếu tố gây nguy cơ cao nhất đến ung thư với khoảng 22% số ca tử vong do ung thư [12]. Ung thư cũng có thể do vi khuẩn hoặc virus ví dụ HPV gây ung thư cổ tử cung với khoảng 25% số ca ở các nước có thu nhập thấp và trung bình [23].

Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư Từ các nguyên nhân kể trên, các biện pháp làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư bao gồm: tránh các tác nhân có nguy cơ mắc bệnh cao như sử dụng thuốc lá, rượu, thừa cân – béo phì, chế độ ăn không lành mạnh với ít rau củ quả, thiếu hoạt động thể chất, nhiễm HPV, HBV do lây nhiễm qua đường tình dục, bức xạ ion, tia cực tím dưới ánh mặt trời, ô nhiễm không khí [5]. Đồng thời cũng tăng khả năng phát hiện sớm ung thư bằng cách khám tổng thể định kỳ thường xuyên bởi điều trị ở giai đoạn sớm ung thư, các bệnh nhân có nhiều khả năng sống sót cao hơn, chi phí 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] điều trị cũng thấp hơn. Để làm được điều đó cần tăng cường tuyên truyền cho người dân nhận thức được nguy cơ tiềm ẩn của bệnh ung thư đồng thời tiếp cận và chăm sóc, đánh giá lâm sàng cũng như chuẩn đoán và phân giai đoạn kịp thời để đưa ra hướng điều trị phù hợp nhất. Mỗi loại ung thư có một phác đồ điều trị cụ thể bao gồm một hoặc nhiều phương thức như phẫu thuật, hóa trị hay xạ trị.

Mục tiêu chính là kéo dài tuổi thọ đồng thời cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên điều trị ung thư bằng các phương pháp truyền thống thì lại tốn kém, đồng thời gây ra nhiều tác dụng phụ cho bệnh nhân. Vì vậy hiện nay các nhà khoa học đang hướng đến nghiên cứu liệu pháp điều trị đích. Khi đó thuốc chỉ tác động vào các tế bào ung thư mà không gây ảnh hưởng đến các tế bào khác của cơ thể.

Và giúp làm giảm thời gian, chi phí điều trị ung thư lên nhiều lần giúp cải thiện cuộc sống cho các bệnh nhân ung thư. Tổng quan về gen TP53 và protein p53 2. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53 Năm 1979, sáu nhóm nghiên cứu làm việc độc lập cùng công bố phát hiện một protein có khối lượng 53 kDa có mặt trong các tế bào chuột và người (DeLeo et al. 1979, Kress et al.

1979, Lane & Crawford 1979, Linzer & Levine 1979, Melero et al. 1979, Smith et al. Ngay sau đó nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên protein này và sau đó với gen mã hóa cho protein là TP53, cho thấy TP53 này là một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) [2]. Hình 1: Cấu trúc của protein p53 ở người [34] 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Protein p53 là một phosphoprotein dạng tetrameric, là một trong những protein có vai trò trong chu trình tế bào giúp ức chế quá trình hình thành khối u, ngăn ngừa đột biến gen và sửa chữa DNA [27].

Tuy nhiên thực tế thì protein p53 dài đầy đủ có kích thước khoảng 43,7 kDa. Sự khác biệt này là do số axit amin proline lớn nên protein di chuyển chậm hơn trên SDS-PAGE [33]. Ngoài các protein có độ dài đầy đủ, gen TP53 ở người còn mã hóa cho ít nhất 15 đồng vị protein có khối lượng từ 3,5 đến 43,7 kDa. Đồng thời các gen TP53 cũng là gen có tần số đột biến cao nhất (>50%) trong tế bào ung thư ở người [27].

Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng protein p53 cũng liên kết với DNA và điều chỉnh mức độ hoạt động của gen và ngăn chặn sự hình thành đột biến [16]. Ở người, gen TP53 nằm trên cánh ngắn của NST số 17 (17p13. Protein p53 là một polypeptide có độ dài khoảng 400 aa (393 aa với p53 ở người). Monomer của p53 được gấp nếp bởi trong cơ thể, protein p53 tồn tại ở dạng tetramers [1, 20, 27].

Cấu trúc protein p53 gồm có: miền kích hoạt phiên mã (1-42), vùng giàu proline (64-92), khu vực lõi chứa một nguyên tử kẽm (102-292), miền homo-oligomerisation (OD) cần thiết cho hoạt động của p53 trong cơ thể (307-355), và vùng đầu mút C (356-393). Cấu trúc không gian của protein p53 Protein p53 ở dạng monomer bao bao gồm 2 nếp gấp β song song với nhau. Trong tế bào, protein p53 thường tồn tại ở dạng tetramer liên kết với nhau thông qua vùng oligomer ở đầu C và liên kết với DNA tại vùng gắn đặc hiệu với DNA (hình 2). Mỗi tetramer bao gồm hai dimer liên kết lại với nhau thông qua DNA.

Mỗi dimer lại được hình thành từ hai monomer thông qua liên kết liên phân tử giữa các tấm β song song. Hai dimer lại liên kết với nhau thông qua tương tác kỵ nước tạo thành tetramer chặt chẽ và có sự ổn định cao. Trung tâm của tetramer là các chuỗi bên Leu344 từ tất cả các monomer tiếp xúc trực tiếp với nhau. Phần đầu của vùng kích hoạt trên bốn monomer có thể liên kết được với bốn phân tử MDM2.

Bình thường trong tế bào, cấu trúc tetramer của protein p53 bao gồm bốn monomer liên kết với phân tử DNA đích và bốn phân tử MDM2 [1, 11, 28]. 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Cấu trúc phân tử của protein p53 [24]. Chú thích: A: protein p53 nhìn từ phía trên; B: chồng chất protein không có DNA (vàng) bên trong phức hợp p53-DNA; C: cấu trúc tinh thể của 2 miền lõi liên kết với DNA; D: lắp các miền lõi và DNA lại với nhau trong cấu trúc tinh thể [36].

Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu Protein p53 hoạt động chủ yếu như một nhân tố phiên mã. Được kích hoạt để đáp ứng các căng thẳng của tế bào như tổn thương DNA, căng thẳng ribosome, thiếu oxy,… bằng cách ngừng chu trình tế bào hoặc gây ra apoptosis. Thông thường trong tế bào protein p53 được liên kết với DNA ở dạng tetramer, gồm 2 dimer. Mỗi dimer liên kết với một trình tự đồng thuận RRRCWWGYYY (R = A / G, W = A / T, Y = C / T) [7].