Luận văn thạc sĩ nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men pichia pastoris x33

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men pichia pastoris x33, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho thực tiễn.

• Tác giả: Trần Thị Thúy Nga
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Nho Thái
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về ung thư hiện đại
• 1.2. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới
• 1.3. Các con đường cơ bản hình thành ung thư
• 1.4. Nghiên cứu điều trị ung thư hiện nay
• 1.5. P53 và các nghiên cứu biểu hiện p53 ứng dụng điều trị ung thư
• 1.6. Tổng quát về TP53 và protein tương ứng
• 1.7. Trình tự nhận biết đặc hiệu của p53 trên các gen mục tiêu
• 1.8. Những nghiên cứu về biểu hiện protein p53 tái tổ hợp
• 1.9. Hệ thống nấm men Pichia pastoris biểu hiện protein ngoại lai
• 1.10. Đặc điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
• 1.11. Vector pPICZα biểu hiện protein ở Pichia pastoris
• 1.12. Quá trình chuyển gen vào nấm men Pichia pastoris
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
• 2.3. Các môi trường nuôi cấy
• 2.4. Các dung dịch và đệm
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Tách chiết vector biểu hiện từ chủng E. coli
• 2.5.2. Xử lý vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn
• 2.5.3. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.5.4. Tinh sạch DNA gel agarose
• 2.5.5. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
• 2.5.6. Tách chiết DNA tổng số của nấm men
• 2.5.7. Sàng lọc thể biến nạp bằng kĩ thuật PCR
• 2.5.8. Nghiên cứu các điều kiện nhằm biểu hiện p53 tái tổ hợp tốt nhất
• 2.5.9. Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)
• 2.5.10. Phương pháp EMSA
• 2.5.11. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký
• 2.5.12. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tạo chủng nấm men Pichia pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His
• 3.2. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ chủng E. coli DH5α và xử lý với SacI
• 3.3. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào Pichia pastoris và sàng lọc thể biến nạp
• 3.4. Tối ưu quy trình biểu hiện p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris
• 3.5. Lựa chọn dòng biểu hiện p53 tái tổ hợp
• 3.6. Tối ưu môi trường biểu hiện p53 tái tổ hợp
• 3.7. Tối ưu nồng độ methanol cảm ứng biểu hiện
• 3.8. Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp thu được
• 3.9. Tinh sạch protein p53 tái tổ hợp
• 3.10. Định lượng protein p53 bằng phương pháp Bradford
• 3.11. Xác định protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris

Nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử và điều trị ung thư. Protein p53, được biết đến như một gen ức chế khối u, đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chu trình tế bào và sửa chữa DNA. Việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp trong nấm men Pichia pastoris không chỉ giúp hiểu rõ hơn về chức năng của protein này mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

1.1. Đặc điểm của protein p53 và vai trò trong điều trị ung thư

Protein p53 có vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư. Nó thực hiện chức năng này thông qua việc kích hoạt các gen liên quan đến sửa chữa DNA và apoptosis. Nghiên cứu cho thấy rằng protein p53 tái tổ hợp có thể được sử dụng như một liệu pháp điều trị hiệu quả cho nhiều loại ung thư.

1.2. Hệ thống nấm men Pichia pastoris trong nghiên cứu protein

Nấm men Pichia pastoris là một hệ thống biểu hiện protein hiệu quả nhờ vào khả năng sản xuất protein ngoại lai với số lượng lớn và dễ dàng tinh sạch. Hệ thống này cho phép các nhà nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và biểu hiện protein p53 tái tổ hợp, từ đó nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

II. Thách thức trong việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp

Mặc dù nấm men Pichia pastoris có nhiều ưu điểm, việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như điều kiện nuôi cấy, nồng độ methanol và quy trình tinh sạch protein đều ảnh hưởng đến hiệu quả sản xuất. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để đạt được protein p53 có hoạt tính sinh học cao.

2.1. Điều kiện nuôi cấy nấm men Pichia pastoris

Điều kiện nuôi cấy là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và biểu hiện của nấm men Pichia pastoris. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng cần được điều chỉnh để tối ưu hóa quá trình sản xuất protein p53 tái tổ hợp.

2.2. Nồng độ methanol và ảnh hưởng đến biểu hiện protein

Methanol là nguồn carbon chính trong quá trình nuôi cấy Pichia pastoris. Nồng độ methanol cần được điều chỉnh cẩn thận, vì nồng độ quá cao có thể gây độc cho tế bào, trong khi nồng độ quá thấp có thể không đủ để kích thích biểu hiện protein p53 tái tổ hợp.

III. Phương pháp tối ưu hóa quy trình biểu hiện protein p53 tái tổ hợp

Để đạt được protein p53 tái tổ hợp với hoạt tính sinh học cao, cần áp dụng các phương pháp tối ưu hóa quy trình biểu hiện. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các yếu tố như thời gian nuôi cấy, nồng độ methanol và phương pháp tinh sạch có thể cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất.

3.1. Tối ưu hóa thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy là yếu tố quan trọng trong việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp. Nghiên cứu cho thấy rằng thời gian nuôi cấy tối ưu có thể giúp tăng cường sự biểu hiện và thu nhận protein với hoạt tính sinh học cao.

3.2. Phương pháp tinh sạch protein hiệu quả

Việc tinh sạch protein p53 tái tổ hợp là bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và hoạt tính của protein. Các phương pháp như sắc ký và điện di có thể được áp dụng để đạt được protein tinh khiết và có hoạt tính sinh học cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protein p53 tái tổ hợp trong điều trị ung thư

Protein p53 tái tổ hợp có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein này có thể giúp tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào bình thường, mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

4.1. Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư của protein p53

Nghiên cứu cho thấy protein p53 tái tổ hợp có khả năng kích hoạt quá trình apoptosis trong tế bào ung thư, từ đó giúp tiêu diệt tế bào ung thư một cách hiệu quả. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới.

4.2. Tạo nguyên liệu cho nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư

Việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp không chỉ giúp nghiên cứu về cơ chế hoạt động của protein này mà còn cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư trong tương lai. Điều này có thể dẫn đến những bước tiến mới trong việc điều trị bệnh ung thư.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp

Nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực điều trị ung thư. Với những tiến bộ trong công nghệ sinh học, việc sản xuất protein này sẽ ngày càng trở nên hiệu quả hơn, góp phần vào việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư an toàn và hiệu quả.

5.1. Tương lai của nghiên cứu protein p53

Nghiên cứu về protein p53 tái tổ hợp sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá hiệu quả của protein trong điều trị ung thư.

5.2. Định hướng nghiên cứu trong tương lai

Định hướng nghiên cứu trong tương lai sẽ bao gồm việc khám phá các ứng dụng khác của protein p53 tái tổ hợp, cũng như phát triển các công nghệ mới để nâng cao hiệu quả sản xuất và ứng dụng của protein này trong điều trị ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện nay là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn cầu. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 9-10 triệu người mới mắc ung thư với tỷ lệ tử vong hơn 50%. Tại Việt Nam, tỷ lệ tử vong do ung thư lên đến 110/100.000 dân và số người mắc bệnh có xu hướng tăng qua từng năm. Các phương pháp điều trị truyền thống như phẫu thuật, hóa trị và xạ trị tuy phổ biến nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn tế bào ung thư, đồng thời gây nhiều tác dụng phụ và chi phí cao. Do đó, nghiên cứu các protein đích có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư một cách đặc hiệu, không ảnh hưởng đến tế bào bình thường, trở thành hướng đi mới đầy triển vọng.

Protein p53, được mã hóa bởi gen ức chế khối u TP53, giữ vai trò quan trọng trong kiểm soát chu trình tế bào, sửa chữa DNA và kích hoạt apoptosis. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh protein p53 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học và khả năng ức chế tế bào ung thư in vitro. Hệ thống nấm men Pichia pastoris X33 được lựa chọn để biểu hiện protein p53 tái tổ hợp do có khả năng biến đổi sau dịch mã hoàn chỉnh, dễ nuôi cấy, chi phí thấp và thuận tiện trong tinh sạch protein tiết ra ngoài môi trường.

Mục tiêu nghiên cứu là tạo chủng P. pastoris X33 mang cấu trúc TAT-p53-His, tối ưu các điều kiện biểu hiện protein p53 tái tổ hợp, tinh sạch và định lượng protein, đồng thời kiểm tra hoạt tính sinh học của protein bằng phương pháp EMSA. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong giai đoạn 2016-2017. Kết quả nghiên cứu góp phần tạo nguyên liệu protein p53 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học, phục vụ cho các nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư trong tương lai.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết di truyền học phân tử về ung thư: Ung thư phát sinh do đột biến gen tiền ung thư và gen ức chế khối u, trong đó gen TP53 là gen ức chế khối u quan trọng nhất, có vai trò kiểm soát chu trình tế bào, sửa chữa DNA và kích hoạt apoptosis.
• Mô hình biểu hiện protein tái tổ hợp trong hệ thống nấm men Pichia pastoris: P. pastoris là sinh vật nhân chuẩn có khả năng biểu hiện protein ngoại lai với các biến đổi sau dịch mã hoàn chỉnh, sử dụng promoter AOX1 cảm ứng bởi methanol để điều khiển biểu hiện protein.
• Khái niệm protein p53 và chức năng sinh học: Protein p53 gồm 393 amino acid, tồn tại dạng tetramer, có vùng liên kết DNA đặc hiệu, điều hòa biểu hiện nhiều gen mục tiêu liên quan đến kiểm soát tế bào và apoptosis.
• Phương pháp EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay): Kỹ thuật xác định khả năng liên kết đặc hiệu của protein p53 tái tổ hợp với trình tự DNA mục tiêu, đánh giá hoạt tính sinh học của protein.
• Phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký affinity dựa trên đuôi polyhistidine (His-tag): Sử dụng cột Niken-Sapharose để thu nhận protein p53 tái tổ hợp có gắn đuôi 6X His.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Vector biểu hiện pPICZαA-TAT-p53-His được chuẩn bị từ nghiên cứu trước, chủng vi khuẩn E. coli DH5α và nấm men Pichia pastoris X33 được sử dụng làm vật chủ. Các hóa chất, enzyme, môi trường nuôi cấy và thiết bị được chuẩn bị theo tiêu chuẩn phòng thí nghiệm sinh học phân tử.
• Phương pháp phân tích:
  • Tách chiết plasmid từ E. coli, xử lý bằng enzyme SacI để mở vòng vector.
  • Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào P. pastoris X33 bằng phương pháp xung điện.
  • Sàng lọc thể biến nạp bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
  • Khảo sát các điều kiện biểu hiện protein p53 tái tổ hợp: lựa chọn chủng biểu hiện, môi trường nuôi cấy, nồng độ methanol cảm ứng.
  • Điện di protein SDS-PAGE để đánh giá biểu hiện protein.
  • Tinh sạch protein bằng sắc ký affinity trên cột Niken-Sapharose.
  • Định lượng protein bằng phương pháp Bradford.
  • Kiểm tra hoạt tính protein p53 tái tổ hợp bằng EMSA với trình tự DNA mục tiêu trên promoter gen mdm2.
• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2017, bao gồm các giai đoạn chuẩn bị vật liệu, biến nạp, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính protein.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tạo chủng P. pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His thành công

   • 7/9 khuẩn lạc E. coli mang plasmid tái tổ hợp được xác nhận bằng PCR.
   • DNA plasmid tinh sạch đạt nồng độ 5981,3 ng/µl, độ tinh sạch cao (tỉ lệ 260/280 = 1,09).
   • Vector pPICZαA-TAT-p53-His được mở vòng thành công bằng enzyme SacI, thu được băng DNA 4,8 kb đúng kích thước dự kiến.

2. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào P. pastoris X33 và sàng lọc thể biến nạp

   • Thu được nhiều dòng biến nạp phát triển trên môi trường chứa zeocin.
   • DNA tổng số tách từ các dòng biến nạp có nồng độ từ 122,2 đến 531,3 ng/µl, độ tinh sạch phù hợp.
   • PCR xác nhận sự có mặt của gen TAT-p53-His trong hệ gen nấm men ở tất cả các dòng biến nạp được chọn.

3. Khảo sát điều kiện biểu hiện protein p53 tái tổ hợp

   • Lựa chọn được dòng biến nạp X33-36 có khả năng biểu hiện protein p53 cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy.
   • Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex Medium with Yeast extract) cho kết quả biểu hiện protein p53 tái tổ hợp tốt nhất, mật độ tế bào đạt OD600 khoảng 12.
   • Nồng độ methanol cảm ứng 0,5% là tối ưu để kích thích biểu hiện protein p53, nồng độ cao hơn không làm tăng đáng kể lượng protein và có thể gây độc tế bào.

4. Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp

   • Protein p53 tái tổ hợp được tinh sạch hiệu quả bằng cột Niken-Sapharose nhờ đuôi His-tag.
   • Định lượng protein bằng phương pháp Bradford cho thấy thu được khoảng 1,2 mg protein p53 tái tổ hợp trên 100 ml dịch nuôi cấy.
   • SDS-PAGE cho thấy băng protein có kích thước khoảng 53 kDa, tương ứng với protein p53.

5. Xác định hoạt tính sinh học của protein p53 tái tổ hợp bằng EMSA

   • Protein p53 tái tổ hợp liên kết đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu trên promoter gen mdm2, tạo phức hợp di chuyển chậm trên gel polyacrylamide.
   • Mẫu đối chứng không chứa protein p53 không tạo phức hợp, chứng tỏ tính đặc hiệu của liên kết.
   • Kết quả khẳng định protein p53 tái tổ hợp giữ được hoạt tính sinh học tương tự protein tự nhiên.

Thảo luận kết quả

Việc tạo chủng P. pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His thành công và biểu hiện protein p53 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học là bước tiến quan trọng trong nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư. Kết quả phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy P. pastoris là hệ thống biểu hiện hiệu quả protein nhân chuẩn có biến đổi sau dịch mã đầy đủ. Môi trường BMMY và nồng độ methanol 0,5% được xác định là điều kiện tối ưu, tương tự như các báo cáo trong ngành về biểu hiện protein tái tổ hợp trong P. pastoris.

Phương pháp EMSA chứng minh protein p53 tái tổ hợp có khả năng liên kết đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, đảm bảo chức năng sinh học cần thiết cho ứng dụng điều trị. Việc tinh sạch protein bằng sắc ký affinity với đuôi His-tag giúp thu được protein tinh khiết với lượng đủ lớn, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ thể hiện mật độ tế bào (OD600) theo thời gian nuôi cấy, biểu đồ so sánh lượng protein p53 thu được ở các điều kiện môi trường và nồng độ methanol khác nhau, cùng bảng SDS-PAGE và hình ảnh EMSA minh họa sự liên kết protein-DNA.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng quy mô sản xuất protein p53 tái tổ hợp

   • Áp dụng hệ thống lên men sinh học quy mô lớn với điều kiện môi trường BMMY và nồng độ methanol 0,5% để tăng sản lượng protein.
   • Thời gian thực hiện: 6-12 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, doanh nghiệp dược phẩm.

2. Nghiên cứu ứng dụng protein p53 tái tổ hợp trong mô hình tế bào ung thư in vitro và in vivo

   • Thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng và kích hoạt apoptosis trên các dòng tế bào ung thư khác nhau.
   • Thời gian: 12-18 tháng.
   • Chủ thể: Các trung tâm nghiên cứu ung thư, viện nghiên cứu y sinh.

3. Phát triển liệu pháp điều trị đích dựa trên protein p53 tái tổ hợp

   • Thiết kế các hệ thống vận chuyển protein p53 vào tế bào ung thư, đánh giá hiệu quả và an toàn.
   • Thời gian: 2-3 năm.
   • Chủ thể: Các công ty dược phẩm, viện nghiên cứu công nghệ sinh học.

4. Tối ưu hóa quy trình tinh sạch và bảo quản protein p53 tái tổ hợp

   • Nghiên cứu các phương pháp bảo quản protein ổn định lâu dài, giảm chi phí sản xuất.
   • Thời gian: 6-12 tháng.
   • Chủ thể: Phòng thí nghiệm công nghệ protein.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành di truyền học, công nghệ sinh học

   • Lợi ích: Hiểu rõ quy trình biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp trong hệ thống nấm men P. pastoris, áp dụng cho các nghiên cứu protein khác.
   • Use case: Tham khảo phương pháp biến nạp, sàng lọc và đánh giá hoạt tính protein.

2. Chuyên gia phát triển thuốc và liệu pháp điều trị ung thư

   • Lợi ích: Nắm bắt công nghệ sản xuất protein p53 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học, làm nền tảng phát triển liệu pháp điều trị đích.
   • Use case: Thiết kế thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng dựa trên protein p53.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm

   • Lợi ích: Áp dụng quy trình sản xuất protein tái tổ hợp quy mô công nghiệp, tối ưu chi phí và hiệu quả.
   • Use case: Phát triển sản phẩm protein p53 phục vụ nghiên cứu và điều trị.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách y tế

   • Lợi ích: Hiểu rõ tiềm năng công nghệ sinh học trong điều trị ung thư, hỗ trợ xây dựng chính sách phát triển nghiên cứu và ứng dụng.
   • Use case: Đánh giá và cấp phép các sản phẩm sinh học mới.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn Pichia pastoris để biểu hiện protein p53 tái tổ hợp?
   P. pastoris là sinh vật nhân chuẩn có khả năng biến đổi sau dịch mã đầy đủ, dễ nuôi cấy, chi phí thấp và có promoter AOX1 mạnh cảm ứng bởi methanol, giúp biểu hiện protein với sản lượng cao và chất lượng tốt.

2. Protein p53 tái tổ hợp có giữ được hoạt tính sinh học không?
   Kết quả EMSA cho thấy protein p53 tái tổ hợp liên kết đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, chứng tỏ giữ được chức năng sinh học tương tự protein tự nhiên.

3. Phương pháp tinh sạch protein sử dụng trong nghiên cứu là gì?
   Protein p53 được tinh sạch bằng sắc ký affinity trên cột Niken-Sapharose nhờ đuôi polyhistidine (His-tag) gắn ở đầu C, giúp thu nhận protein tinh khiết hiệu quả.

4. Nồng độ methanol ảnh hưởng thế nào đến biểu hiện protein?
   Nồng độ methanol 0,5% được xác định là tối ưu để cảm ứng biểu hiện protein p53, nồng độ cao hơn không tăng đáng kể lượng protein và có thể gây độc tế bào.

5. Ứng dụng tiềm năng của protein p53 tái tổ hợp là gì?
   Protein p53 tái tổ hợp có thể được sử dụng trong nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư, đặc biệt là liệu pháp điều trị đích nhằm ức chế tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào bình thường.

Kết luận

• Đã tạo thành công chủng Pichia pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His và biểu hiện protein p53 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học.
• Điều kiện biểu hiện tối ưu là môi trường BMMY với nồng độ methanol cảm ứng 0,5%, thu được lượng protein p53 tái tổ hợp khoảng 1,2 mg/100 ml dịch nuôi cấy.
• Protein p53 tái tổ hợp được tinh sạch hiệu quả bằng sắc ký affinity và giữ được khả năng liên kết đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu theo phương pháp EMSA.
• Nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu và phát triển liệu pháp điều trị ung thư.
• Các bước tiếp theo bao gồm mở rộng quy mô sản xuất, thử nghiệm hoạt tính trên mô hình tế bào và động vật, cũng như phát triển các hệ thống vận chuyển protein vào tế bào ung thư.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học tiếp tục phát triển và ứng dụng kết quả nghiên cứu này nhằm góp phần nâng cao hiệu quả điều trị ung thư trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về ung thư hiện đại 1. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới Thuật ngữ “ung thư” ngày nay được sử dụng để chỉ một nhóm bệnh phát sinh do sự biến đổi của các gen đặc thù, có thể tạo ra một tập hợp các tế bào phân chia một cách không kiểm soát (khối u) phát triển từ một mô hay từ một tế bào bình thường.

Khối u ác tính khi phát triển xâm lấn sẽ tiếp cận với mạch máu, từ đó có thể di chuyển và phát triển tại các mô ở xa, gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong [19, 41]. Những con số thống kê cụ thể chứng minh “Ung thư là một trong những nguyên nhân chính gây ra tử vong ở người” vào những năm gần đây đã được Cơ quan nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) báo cáo vào năm 2013. Cụ thể, đã có khoảng 14 triệu trường hợp mới mắc ung thư và 8,2 triệu trường hợp tử vong do ung thư vào năm 2012, ảnh hưởng đến các quần thể người ở tất cả các nước và các vùng trên thế giới [18, 26]. Tính riêng trong giới tính nam, năm 2012, chẩn đoán mắc ung thư ở nam giới phổ biến nhất là ung thư phổi (16,7%), ung thư tuyến tiền liệt (15,0%) và ung thư đại tràng (10,0%).

Ung thư ở những vị trí này cũng là nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong cho nam giới với 23,6% ở ung thư phổi, tiếp theo là ung thư gan (11,2%) và ung thư dạ dày (10,1%). Đối với phụ nữ, chuẩn đoán mắc ung thư phổ biến nhất là ung thư vú (25,2%), ung thư đại trực tràng (9,2%), ung thư phổi (8,7%) và ung thư cổ tử cung (7,9%). Ung thư tại những vị trí này cũng tương tự là nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong ở phụ nữ với 14,7% ở ung thư vú và 13,8% ở ung thư phổi [26, 27,43]. Đến năm 2015, xếp sau bệnh tim và đột quỵ, ung thư trở thành nguyên nhân gây tử vong thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu người chết, phổ biến xảy ra ở ung thư phổi với 1,69 triệu ca tử vong, sau đó đến ung thư gan (788.000 ca tử vong), u ruột kết (774.000 ca NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ tử vong), ung thư dạ dày (754.000 ca tử vong) và ung thư vú (571.000 ca tử vong).

Ước tính chung về tỉ lệ tử vong do ung thư trên toàn thế giới thì có khoảng 70% số ca xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, khoảng 30% số ca phát sinh từ năm nguy cơ sinh hoạt và chế độ ăn uống như: chỉ số cơ thể cao, ăn ít trái cây và rau quả, thiếu hoạt động thể lực, sử dụng thuốc lá và bia rượu. Thuốc lá là một yếu tố gây ung thư phổ biến nhất và chiếm khoảng 22% số ca tử vong. Nhiễm trùng gây ung thư lên đến 25% các trường hợp ung thư ở những nước thu nhập thấp và trung bình [20]. Vào năm 2015, chỉ có 35% các quốc gia thu nhập thấp báo cáo có dịch vụ chuẩn đoán bệnh lý tại thành phố và các khu trung tâm.

Tổng chi phí kinh tế hàng năm dành cho ung thư ước tính khoảng 1,16 nghìn tỷ USD. Do đó, chỉ có khoảng 20% các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình có những giải pháp cần thiết để thúc đẩy chính sách về ung thư [18, 43]. Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều khó khăn về chữa trị bệnh với số lượng người mắc ung thư ngày một tăng. Theo thống kê của Đại học Y Hà Nội, năm 2005, số ca tử vong do ung thư là 45.413 người; năm 2006, con số này là 48.306 người, trong đó phổ biến nhất là ung thư gan, sau đó đến ung thư phổi và ung thư dạ dày [34].

Tuy nhiên, các phương thức điều trị ung thư hiện nay còn tốn kém, hầu hết dựa vào phương pháp truyền thống là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật. Các phương pháp này gây đau đớn kéo dài cho người bệnh, và chỉ kéo dài tuổi thọ được trong thời gian ngắn hoặc khả năng tái phát cao do không thể tiêu diệt triệt để tế bào ung thư. Điều này đòi hỏi cần phải có giải pháp điều trị mới, tăng hiệu quả chữa trị bệnh và giảm thiểu kinh phí. Các con đường cơ bản hình thành ung thư 1.

Cơ sở di truyền học phân tử hình thành ung thư Gen ung thư là dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do đột biến, làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. Các gen ung thư phát sinh từ tế bào mầm sinh dục sẽ có mặt trong hầu hết các tế bào của cơ thể và truyền lại NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ cho thế hệ sau, ngược lại, nếu từ tế bào soma sẽ không được truyền cho thế hệ sau. Gen ung thư được xuất phát từ hai nhóm gen là gen tiền ung thư và gen ức chế khối u [19]. Gen tiền ung thư có chức năng điều khiển quá trình sinh trưởng và biệt hóa trong tế bào.

Các đột biến chuyển gen tiền ung thư thành gen ung thư (oncogene) gây nên rối loạn chuyển hóa ở tế bào và tạo ra ung thư. Protein được mã hóa bởi gen ung thư thường có mức biểu hiện chức năng tăng lên so với protein được mã hóa bởi gen tiền ung thư. Sự tái sắp xếp phức tạp của hệ gen có thể tạo ra gen ung thư. Điển hình là họ gen MYC (ví dụ gen tiền ung thư C-MYC) mã hóa cho các yếu tố phiên mã ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ biểu hiện của gen, qua đó tác động đến sự tăng sinh tế bào và liên quan đến sự phát sinh của khối u.

Cấu trúc di truyền của MYC bị sắp xếp lại theo một số cách dẫn đến mức biểu hiện cao bất thường các protein MYC, làm hoạt hóa các gen tiền ung thư. Số gen MYC có thể tăng lên do hiện tượng lặp đoạn NST mang gen MYC hoặc do vị trí của nó được xếp lại gần một promoter mạnh dẫn đến tăng lượng sản phẩm protein. Những đột biến NST kiểu này ở tế bào soma có thể được nhân lên ổn định cùng quá trình chọn lọc dòng tế bào ung thư [19, 28]. Các gen tiền ung thư cũng có thể được hoạt hóa bởi cơ chế nhân bản gen.

Số bản sao của mỗi gen có thể tăng do hiện tượng nhân bản một vùng DNA (amplicon) của NST, dẫn đến lượng protein trong tế bào do gen đó mã hóa tăng theo. Ví dụ lặp vùng NST 2p24 của gen N-MYC là một gen tiền ung thư được chuyển thành gen ung thư gây phát sinh các u nguyên bào thần kinh. Hiện tượng lặp 20-500 bản sao gen ERBB2 phổ biến trong các trường hợp ung thư vú và ung thư buồng trứng, u tuyến phát sinh từ dạ dày và tuyến nước bọt [19,41]. Sự hoạt hóa gen tiền ung thư còn có thể được tạo ra bởi chuyển đoạn NST theo hai cơ chế, tùy thuộc vào vị trí của điểm đứt gãy NST: chuyển đoạn có thể đặt hai trình tự exon thuộc hai gen khác nhau dưới sự điều khiển của chung một promoter dẫn đến sự biểu hiện của một protein dung hợp; hoặc chuyển đoạn NST đặt một khung đọc mở hoàn chỉnh cạnh một promoter hoạt động mạnh.

Ví dụ điển hình là bệnh ung thư bạch cầu thể tủy trường diễn có dạng chuyển đoạn tương hỗ hình thành theo hai cách: dung hợp của các gen BCR và C-ABL từ NST số 22 và từ NST số 9 dẫn NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ đến sản phẩm của gen dung hợp BCR-ABL có tác động gây ung thư. Nhiều sản phẩn gen dung hợp BCR-ABL với các khung dung hợp khác nhau được tạo ra nhờ trên NST số 9 chỉ có một điểm đứt gãy duy nhất, còn trên NST số 22 có một cụm các điểm đứt gãy đặc thù [19, 22, 41]. Các gen ung thư là các gen trội về khả năng phát sinh khối u bởi chỉ một đột biến duy nhất có thể chuyển một gen tiền ung thư thành gen ung thư. Đột biến hoạt hóa các gen này luôn tạo ra ưu thế tăng sinh tế bào mặc dù vẫn tồn tại bản sao của các alen bình thường.

Do kiểu hình mà các gen ung thư quy định không bị át chế bởi sự có mặt của bản sao kiểu dại còn lại, nên có thể coi các gen ung thư là các gen trội [28, 47]. Các gen ức chế khối u bình thường điều khiển các quá trình cơ bản nhằm duy trì sự cân bằng nội mô bao gồm: duy trì tính toàn vẹn của vật chất di truyền, các bước của chu kỳ tế bào, sự biệt hóa tế bào, mối tương tác giữa các tế bào và quá trình apoptosis. Các đột biến làm bất hoạt gen ức chế khối u, biến gen đó trở thành một gen ung thư, gây ra mất cân bằng nội mô, từ đó dẫn đến sự phát sinh các khối u [19]. Sự bất hoạt một gen ức chế khối u trải qua hai bước tách biệt nhau: đột biến thứ nhất làm bất hoạt một alen xảy ra ở tế bào dòng sinh dục hoặc ở tế bào soma; đột biến thứ hai làm bất hoạt hoàn toàn gen ức chế khối u luôn xảy ra ở tế bào soma và gây nên mất alen bình thường còn lại, từ đó phát triển thành khối u.

Hiện tượng mất tính dị hợp tử (Loss of Heterozygosity, LOH) phản ánh sự mất đi của bản sao alen kiểu dại duy nhất còn lại của một gen ức chế khối u và có thể xuất hiện theo các cơ chế khác nhau: mất toàn bộ NST; tái tổ hợp trong nguyên phân hoặc các đột biến cục bộ. Kết quả là mất các gen ức chế khối u diễn ra nhanh hơn ở các tế bào ung thư so với ở các tế bào tiền khối u [19, 28]. Theo cơ chế di truyền, các gen ức chế khối u (dạng đột biến) thường là lặn trong khi các gen gây khối u là trội. Một gen trội như gen gây khối u thường biểu hiện ngay kiểu hình trong khi hiệu quả kiểu hình của các gen ức chế khối u đột biến thường bị hạn chế bởi hoạt động của alen bình thường và chỉ được biểu hiện khi alen bình thường còn lại bị mất đi.