Luận văn: Xác định hệ protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hệ protein màng trong huyết thanh bệnh nhân hội chứng mạch vành cấp, phương pháp và kết quả phân tích chi tiết.

• Tác giả: Trần Thái Thượng
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Bích Thảo
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu xác định hệ protein màng trong huyết thanh của bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm về Protein Màng và Huyết Thanh

Protein màng là một thành phần quan trọng trong huyết thanh, đóng vai trò thiết yếu trong các quá trình sinh lý của cơ thể. Huyết thanh là phần lỏng của máu sau khi loại bỏ các tế bào máu, chứa nhiều protein huyết thanh có chức năng đa dạng. Trong bối cảnh hội chứng mạch vành cấp, việc nhận diện và phân tích hệ protein màng trong huyết thanh trở nên cực kỳ quan trọng. Các protein màng huyết thanh có thể được phân loại theo vị trí dưới tế bào, chức năng sinh học và đặc điểm cấu trúc. Nghiên cứu về những thành phần protein này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh tim mạch và hỗ trợ phát triển các phương pháp chẩn đoán mới. Kỹ thuật proteomics hiện đại cho phép các nhà khoa học xác định chi tiết các protein trong huyết thanh với độ chính xác cao, mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu y sinh học.

1.1. Đặc điểm Thành phần Protein Màng Huyết Thanh

Protein màng huyết thanh bao gồm các protein xuyên màng và protein liên kết bề mặt. Các thành phần protein này có khối lượng phân tử khác nhau, dao động từ vài kDa đến hàng trăm kDa. Chúng tham gia vào các quá trình quan trọng như gắn kết tế bào, vận chuyển chất, và tín hiệu tế bào. Protein màng thường có các vùng疏 nước đặc trưng, cho phép chúng hoạt động hiệu quả trong môi trường màng lipid. Cấu trúc ba chiều của các protein huyết thanh loại này được bảo vệ bởi các liên kết covalent và tương tác không covalent.

1.2. Vai trò của Protein Màng trong Tim Mạch

Các protein màng đóng vai trò trung tâm trong chức năng tim mạch khỏe mạnh. Trong bệnh hội chứng mạch vành cấp, các protein huyết thanh bất thường có thể chỉ thị tình trạng thiệt hại mô tim. Protein màng tham gia vào việc điều chỉnh huyết áp, chống viêm, và bảo vệ mạch máu. Sự thay đổi hệ protein trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp phản ánh mức độ tổn thương tim cơ. Nghiên cứu protein màng huyết thanh giúp phát hiện sớm các dấu hiệu hội chứng mạch vành cấp thông qua các biomarker protein đặc hiệu.

II. Phương pháp Proteomics trong Nghiên cứu Protein Màng

Proteomics là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép phân tích toàn bộ bộ protein trong một mẫu sinh học cụ thể. Phương pháp này kết hợp điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) và khối phổ để xác định và định lượng các protein màng trong huyết thanh. Quy trình proteomics bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, phân tách protein, thủy phân bằng enzyme và phân tích. Sắc kí đa chiều (LC-MS/MS) là công cụ chủ yếu để nhận diện các protein huyết thanh với độ chính xác cao. Kỹ thuật này cho phép các nhà nghiên cứu phát hiện các protein màng ngay cả khi chúng có nồng độ thấp. Ứng dụng proteomics trong nghiên cứu hội chứng mạch vành cấp đã dẫn đến khám phá nhiều biomarker protein mới có giá trị chẩn đoán.

2.1. Quy trình Chuẩn bị Mẫu và Phân tách Protein

Bước đầu tiên trong proteomics là loại bỏ các protein chiếm ưu thế như albumin và immunoglobulin (IgG) từ huyết thanh. Việc tủa protein bằng acetone giúp loại bỏ lipid và các tạp chất khác. Protein được định lượng để đảm bảo nồng độ đều đặn trước khi điện di. Kỹ thuật SDS-PAGE phân tách các protein màng dựa trên khối lượng phân tử. Các gel được cắt thành các phân đoạn khác nhau để phân tích chi tiết.

2.2. Nhận diện Protein thông qua Khối Phổ

Sau khi thủy phân protein bằng trypsin, các peptide được phân tích bằng khối phổ. Phần mềm Mascot được sử dụng để so sánh dữ liệu phổ khối lượng với các cơ sở dữ liệu protein. Protein được xác định dựa trên độ tương đồng chuỗi peptide. Các biomarker protein trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp được liệt kê cùng với chức năng và vị trí dưới tế bào của chúng.

III. Hội chứng Mạch Vành Cấp và Các Phương pháp Chẩn đoán

Hội chứng mạch vành cấp (ACS - Acute Coronary Syndrome) là tình trạng y tế cấp cứu xảy ra khi dòng máu đến tim bị giảm đột ngột. Bệnh động mạch vành là nguyên nhân chính gây ra hội chứng mạch vành cấp, thường do tắc động mạch vành. Các triệu chứng bao gồm đau ngực, khó thở, mệt mỏi và chứng mồ hôi lạnh. Chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp dựa vào tiền sử bệnh, các dấu hiệu lâm sàng và các xét nghiệm chuẩn đoán. Điện tâm đồ (ECG) và các biomarker như troponin là những công cụ chẩn đoán quan trọng. Nhận diện các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp cung cấp thông tin bổ sung giúp đánh giá mức độ tổn thương tim cơ và tiên lượng bệnh.

3.1. Bệnh Động mạch Vành và Cơ chế Bệnh sinh

Động mạch vành cấp máu cho cơ tim và cần được thông thoáng để tim hoạt động bình thường. Bệnh động mạch vành xảy ra khi các mảng xơ vữa tích tụ bên trong động mạch, hình thành quy trình xơ vữa hóa động mạch. Khi mảng xơ vữa vỡ, xảy ra hình thành cục máu đông, gây tắc động mạch hoàn toàn hoặc một phần. Hội chứng mạch vành cấp dẫn đến thiếu oxy tim cơ, gây hoại tử mô tim nếu không được điều trị kịp thời.

3.2. Các Phương pháp Chẩn đoán Hội chứng Mạch vành Cấp

Điện tâm đồ (ECG) là công cụ chẩn đoán đầu tay, hiển thị hoạt động điện tim. Các biomarker tim như troponin I, troponin T và creatine kinase (CK-MB) chỉ thị tổn thương cơ tim. Hình ảnh y tế bao gồm siêu âm tim và chụp cắt lớp để đánh giá chức năng tim. Phương pháp proteomics trong nghiên cứu protein màng huyết thanh có tiềm năng phát hiện các biomarker mới giúp cải thiện chẩn đoán.

IV. Ứng dụng và Triển vọng Nghiên cứu Protein Màng

Các nghiên cứu gần đây về protein màng và huyết thanh tại các nước phát triển đã xác định nhiều biomarker protein liên quan đến hội chứng mạch vành cấp. Những phát hiện này mở đường cho phát triển các xét nghiệm chẩn đoán mới dựa trên hệ protein trong huyết thanh. Tại Việt Nam, nghiên cứu protein màng bắt đầu được chú trọng, đặc biệt tại các viện nghiên cứu hàng đầu như Viện Công nghệ sinh học và Viện Tim mạch. Kỹ thuật proteomics cho phép xác định các protein xuyên màng với cấu trúc đặc biệt, đặc biệt là những vùng xuyên màng (TMD - Transmembrane Domain). Dự đoán số lượng vùng xuyên màng giúp phân loại protein màng và hiểu rõ hơn chức năng của chúng. Triển vọng phát triển các phương pháp chẩn đoán dựa trên phân tích protein huyết thanh hứa hẹn sẽ cải thiện khả năng phát hiện sớm và quản lý bệnh tim mạch.

4.1. Những Phát hiện Nghiên cứu Quốc tế

Các nghiên cứu từ các quốc gia phát triển đã sử dụng proteomics để xác định hơn một trăm protein màng khác nhau trong huyết thanh của bệnh nhân mạch vành. Những protein này tham gia vào các quá trình như viêm, vận chuyển chất, và tín hiệu tế bào. Biomarker protein mới được phát hiện có tiềm năng cải thiện chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Dữ liệu từ các cơ sở dữ liệu protein như UniProt cung cấp thông tin chi tiết về chức năng và cấu trúc của các protein huyết thanh.

4.2. Triển vọng Ứng dụng Lâm sàng tại Việt Nam

Nghiên cứu protein màng huyết thanh tại Việt Nam có tiềm năng ứng dụng cao trong chẩn đoán bệnh tim mạch. Phát triển các xét nghiệm dựa trên phân tích protein có thể giúp các bệnh viện phát hiện sớm hội chứng mạch vành cấp. Kỹ thuật proteomics hiện đang được triển khai tại các viện nghiên cứu hàng đầu. Cải biến sau dịch mã (PTM) của các protein cũng được nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh. Hợp tác giữa các trường đại học và bệnh viện sẽ tạo cơ hội để đưa phương pháp này vào ứng dụng lâm sàng thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hội chứng mạch vành cấp (Acute Coronary Syndrome, ACS) thƣờng xảy ra bất ngờ, đột ngột, có tỉ lệ tử vong cao và để lại nhiều di chứng nặng nề nếu không đƣợc cấp cứu kịp thời. Ở Việt Nam, do áp lực công việc ngày càng tăng cao cùng với thói quen ăn uống không cân đối, tình trạng thừa cân, béo phì hay hút thuốc lá đã dẫn đến tỉ lệ các bệnh lí tim mạch nói chung và ACS nói riêng tăng lên rõ rệt trong những năm gần đây. Hội chứng mạch vành cấp thƣờng liên quan đến những biến đổi bất thƣờng xảy ra bên trong dòng máu. Hơn nữa, dòng máu tuần hoàn gần nhƣ khắp cơ thể, tiếp xúc với hầu hết các tế bào nên rất nhiều biến đổi trong cơ thể đƣợc phản ánh vào trong máu.

Huyết thanh là thành phần chính của máu, là môi trƣờng cho các tế bào máu hoạt động nên những biến đổi này cũng đƣợc phản ánh trong huyết thanh. Do đó, huyết thanh đã đƣợc lựa chọn nhƣ một trong những đối tƣợng nghiên cứu chính trong nhiều bệnh lí, đặc biệt là tim mạch. Đã có rất nhiều nghiên cứu đƣợc thực hiện trên huyết thanh nhƣng gần đây hƣớng tiếp cận về protein màng đang thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học. Protein màng có vai trò then chốt trong các hoạt động sống của tế bào vì chúng thực hiện rất nhiều chức năng quan trọng.

Những thay đổi bất thƣờng trong hoạt động của các protein này chính là dấu hiệu nhận biết sự phát sinh và phát triển bệnh lí. Những năm gần đây các nghiên cứu về protein đặc biệt là protein màng đang rất đƣợc quan tâm và đầu tƣ. Cùng với sự ra đời, phát triển của tin sinh học và các kĩ thuật phân tích dựa trên phổ khối lƣợng, cách tiếp cận proteomics đang cho thấy đây là một phƣơng pháp hữu hiệu và khó có thể thay thế trong việc phân tích các hệ protein trong cơ thể. Tại Việt Nam, những nghiên cứu proteomics đã đƣợc tiến hành trong một số năm qua và đạt đƣợc những kết quả nhất định.

Trên cơ sở đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định hệ protein màng trong huyết thanh của bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp” với mục đích: K20 – Sinh học thực –1 Trường ĐHKHTN, Trần Thái Luận văn 1. Nhận diện các protein màng có trong huyết thanh bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp. Xây dựng và phân tích dữ liệu cơ bản về các protein này. Dự đoán số vùng xuyên màng trong cấu trúc các protein màng.

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. K20 – Sinh học thực –2 Trường ĐHKHTN, Trần Thái Luận văn Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1. Khái niệm về huyết thanh Máu là dung dịch sinh lí quan trọng nhất trong cơ thể con ngƣời. Nhiệm vụ của máu là tuần hoàn khắp cơ thể, cung cấp oxi cũng nhƣ các chất dinh dƣỡng cần thiết cho các tế bào, đồng thời chuyển các chất thải từ chính những tế bào này đến các cơ quan bài tiết.

Để có thể thực hiện những chức năng trên, máu đƣợc tạo nên nhờ hai thành phần cơ bản là các tế bào máu và một môi trƣờng bao quanh các tế bào này. Môi trƣờng này chính là huyết tƣơng. Huyết tƣơng là thành phần phi tế bào, là môi trƣờng sống của các tế bào máu, chiếm tới 55 – 60% thể tích máu [48]. Trong huyết tƣơng có nhiều nhân tố quan trọng tham gia vào quá trình đông máu.

Khi các nhân tố này đƣợc tách khỏi huyết tƣơng, phần dịch còn lại chính là huyết thanh. Huyết thanh bao gồm nƣớc, muối, lipid, đƣờng, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác Nhƣ vậy, thành phần của huyết thanh rất giống huyết tƣơng và các protein của huyết thanh thực hiện các vai trò rất đa dạng nhƣ đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dƣỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể [11]. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh Một ngƣời trƣởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam protein. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lƣợng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml.

Trong đó, khoảng từ 10.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml [12]. Các protein hiện diện trong huyết thanh với nhiều lí do khác nhau và đƣợc chia thành các nhóm nhƣ sau: K20 – Sinh học thực –3 Trường ĐHKHTN, Trần Thái Luận văn  Protein do mô đặc tiết ra và có hoạt động trong huyết thanh: Các protein này đƣợc tiết với số lƣợng lớn từ gan và các nội tạng, có khối lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ lọc của thận (~ 45 kDa) nên không chui qua đƣợc màng lọc của thận, do đó thời gian cƣ trú trong huyết thanh thƣờng dài (thời gian tồn tại của albumin trong huyết thanh lên tới 21 ngày).  Các globulin miễn dịch (Immunoglobulin): Các phân tử giữ chức năng kháng thể điển hình trong huyết thanh.  Chất gắn thụ thể trung gian: Các hormone có bản chất là protein và peptide đều nằm trong nhóm này.

Những protein này có kích thƣớc khác nhau, phù hợp với các cấp độ hoạt động điều hòa (với những hormone nhỏ nhƣ insulin việc điều chỉnh rất nhanh chóng, với những hormone lớn nhƣ erythropoietin thì việc điều chỉnh diễn ra chậm hơn).  Chất gắn thụ thể nội bộ: Bao gồm các cytokine và các chất dẫn truyền ở cự li gần khác trong con đƣờng truyền thông tin liên tế bào. Thông thƣờng, những protein này có kích thƣớc phân tử nhỏ hơn màng lọc của thận (do đó, thời gian cƣ trú trong huyết thanh khá ngắn), những chất này tạo ra các tƣơng tác cục bộ giữa các tế bào và đƣợc pha loãng trong huyết thanh khi không còn tác dụng.  Những chất lưu hành tạm thời: Bao gồm các protein không phải là hormone, hoạt động trong huyết thanh với thời gian ngắn và cũng theo máu đến vị trí cụ thể để biểu hiện chức năng.

Ví dụ, các protein đƣợc tiết và hấp thụ bởi lysosome qua các thụ thể.  Sản phẩm giải phóng từ các mô: Là các protein thực hiện chức năng thông thƣờng trong tế bào nhƣng đƣợc giải phóng vào trong huyết thanh khi tế bào bị tổn thƣơng hoặc bị chết. Phần lớn những protein này là các chỉ thị chẩn đoán bệnh quan trọng.Ví dụ, troponin, creatinin kinase hoặc myoglobin sử dụng trong chẩn đoán bệnh nhồi máu cơ tim. K20 – Sinh học thực –4 Trường ĐHKHTN, Trần Thái Luận văn  Các chất tiết khác thường: Những protein này đƣợc giải phóng từ các khối u và những mô bệnh khác, không bắt nguồn từ những hoạt động chức năng của các cơ quan trong cơ thể.

 Protein ngoại lai: Là những protein của các sinh vật lây nhiễm hay động vật kí sinh đƣợc tiết vào trong hệ tuần hoàn. Thành phần protein trong huyết thanh đa dạng, phức tạp và rất biến động. Các nhà khoa học đã đƣa ra ba lí do giải thích về số lƣợng của protein trong huyết thanh. Đầu tiên, do hầu hết các protein huyết thanh đều bị glycosyl hóa rất mạnh nên giả sử rằng trong huyết thanh thật sự chỉ có khoảng 500 protein, và mỗi protein lại có khoảng 20 dạng glycosyl hóa gồm 5 kiểu biến đổi (bao gồm tiền chất, dạng có hoạt tính, sản phẩm suy thoái và các biến đổi cắt nối), tổng cộng sẽ tạo ra khoảng 50.000 dạng khác nhau.

Thứ hai, huyết thanh còn đƣợc bổ sung bởi thành phần giải phóng từ các mô, đây là tác động của hệ protein ngƣời (sản phẩm của bộ gen ngƣời), mỗi sản phẩm này có 10 biến thể cắt nối, cải biến sau dịch mã hay đứt gẫy, tổng cộng lên tới hơn 500. Cuối cùng với lớp immunoglobulin, theo tính toán cũng phải chứa khoảng 10.000 trình tự khác nhau [13]. Do đó, huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn và cũng là một mẫu nghiên cứu hấp dẫn [12]. Huyết thanh đƣợc sử dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh nhờ hai đặc trƣng: mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn; mẫu không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình ngƣời mà còn cho biết trạng thái của cơ thể trên từng thời điểm.

Trong khi đó, những mẫu khác nhƣ nƣớc bọt, nƣớc mắt, nƣớc tiểu chỉ đƣợc coi là một tập con nhỏ của huyết thanh và phản ánh hoạt động của các tế bào địa phƣơng [1]. Bên cạnh đó, huyết thanh còn là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Chính vì thành phần protein của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công trình nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh nguy hiểm K20 – Sinh học thực –5 Trường ĐHKHTN, Trần Thái Luận văn nhƣ đái tháo đƣờng, ung thƣ và tim mạch. Trên thực tế, nhiều loại protein trong huyết thanh đã đƣợc nghiên cứu trƣớc khi chúng ta biết đến sự tồn tại của gen [12].

Những thay đổi bất thƣờng về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lí. Nói cách khác, huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lí, đã và đang đƣợc minh chứng qua những thành tựu thu đƣợc trong nhiều thập kỉ qua. Các protein có hàm lƣợng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lƣợng protein tổng số, trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein… [31]. Ví dụ, albumin thông thƣờng thay đổi từ 35 – 50 mg/ml (chiếm 50 – 70%) do sự tổng hợp liên tục hàng ngày ở gan (khoảng 12 g/ngày) và có thời gian bán hủy là 21 ngày nên protein này đƣợc coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dƣỡng [14].

IgG có nồng độ khoảng 5 – 7 mg/ml chiếm 10%. Các protein còn lại tuy hàm lƣợng thấp, khoảng 1% hàm lƣợng protein tổng số nhƣ interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), β2-microglobulin. nhƣng có thể lại là những protein có chức năng quan trọng và đƣợc coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lí [47].